劉雪瑩 付紅娟 任彥蓉 齊文川 梁繁榮

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起以心絞痛、心律失常等為主要臨床表現(xiàn)的疾病[1]。國內(nèi)外眾多研究證實(shí)針刺對缺血心肌具有保護(hù)作用[2-4]。臨床治療CHD心絞痛多選用心經(jīng)、心包經(jīng)穴位,其中內(nèi)關(guān)穴使用頻率最高。研究團(tuán)隊(duì)在前期臨床試驗(yàn)中的研究表明CHD心絞痛患者會(huì)出現(xiàn)穴位敏化現(xiàn)象。穴位敏化是指機(jī)體在疾病狀態(tài)下,陰平陽秘被打破,氣血陰陽發(fā)生變化,腧穴由“沉寂態(tài)”變?yōu)椤凹せ顟B(tài)”的過程,這跟機(jī)體的生理病理狀態(tài)變化有關(guān),能夠?qū)崟r(shí)和動(dòng)態(tài)的反映臟腑的功能狀態(tài)[5]。但目前關(guān)于穴位敏化的產(chǎn)生機(jī)制研究尚顯不夠。近年來差異表達(dá)基因研究被越來越多的應(yīng)用于疾病機(jī)制的研究中,這也為穴位敏化發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制研究提供了新的思路和平臺(tái)[6-9]。本研究以穴位敏化理論為基礎(chǔ),通過轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出CHD心絞痛模型大鼠敏化穴位組織中差異性表達(dá)的mRNA,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,明確其生物學(xué)功能,從基因調(diào)控的角度研究參與穴位敏化發(fā)生過程的mRNA及其調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究穴位敏化現(xiàn)象提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康SPF級雄性SD大鼠20只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心節(jié)律室,飼養(yǎng)條件為12小時(shí)明暗交替,室溫16～28℃,濕度40%～70%。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,常規(guī)喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水。按照隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白組(Cc組)、模型組(Tc組),每組10只。實(shí)驗(yàn)方案獲得了成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器:PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司),電子測痛儀Electric VonFrey(美國 IITC Life Science Inc公司),轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徐卡RM2016,德國LEICA公司),高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司),干浴器干式恒溫金屬浴(上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司),Bio-rad-CFX96、LineGene9600均購于杭州博日科技有限公司,QuantStudio 5 Real-Time PCR System(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

主要試劑:Isofluranee(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),10%中性甲醛固定液(福晨化學(xué)試劑有限公司),二甲苯(成都市科隆化學(xué)有限公司),蘇木素染液、伊紅染液均購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司,中性樹膠(Biosharp生物公司),Animal Total RNA Isolation Kit、2×RT OR-EasyTM Mix、2×Real PCR EasyTM Mix-SYBR均購于成都福際生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型制備

參考相關(guān)文獻(xiàn)[10],采用腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)構(gòu)建大鼠心絞痛模型;空白組腹腔注射生理鹽水構(gòu)建對照模型。注射劑量均為2 mg/kg,每24小時(shí)注射1次,連續(xù)注射14天。

在造模前一天和造模后一天使用PowerLab7多導(dǎo)電生理記錄儀進(jìn)行心臟電生理參數(shù)檢測和斜方肌肌電信號(hào)檢測,將大鼠用異氟烷呼吸麻醉后,仰臥于操作臺(tái)上,將電極淺刺入大鼠肢體皮下,右前肢近心端接電極負(fù)極,右后肢近心端接地線,左后肢近心端接電極正極,記錄大鼠的心率及心電圖變化情況;剔除大鼠頸部及左側(cè)背部毛發(fā),暴露左側(cè)背斜方肌,同芯電極以約30°角斜插入左側(cè)背斜方肌,插入深度約為1.5～1.7 mm,記錄左側(cè)背斜方肌的肌電信號(hào)[11]。并于造模結(jié)束后麻醉大鼠,取心臟組織放入10%中性甲醛固定液中。采用蘇木素—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法,對心臟組織進(jìn)行脫水、包埋、切片、染色、封片后,分別于100倍和400倍下采集圖片,觀察兩組大鼠的心肌組織病理形態(tài)變化。

造模成功標(biāo)準(zhǔn):(1)模型組大鼠心電圖ST段明顯抬高[10,12],見圖1。(2)模型組大鼠左側(cè)背斜方肌肌電信號(hào)明顯增強(qiáng),表明注射ISO會(huì)引發(fā)大鼠心臟產(chǎn)生疼痛反應(yīng),見圖2。(3)模型組大鼠心肌組織可見不等量的心肌纖維壞死,壞死區(qū)不同程度纖維組織增生,以成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞增生為主,壞死區(qū)域內(nèi)或間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤,包括少量單個(gè)圓形深染核的淋巴細(xì)胞、桿狀核的中性粒細(xì)胞和細(xì)胞較小,核圓偏于細(xì)胞一側(cè)的漿細(xì)胞,見少量紅細(xì)胞溢出,壞死區(qū)可見新生毛細(xì)血管形成。見圖3。

圖1 造模后大鼠心電圖(Ⅱ?qū)?lián))

圖2 造模后大鼠背斜方肌肌電圖

注:A:空白組;B:模型組。藍(lán)色箭頭示淋巴細(xì)胞,橙色箭頭示成纖維細(xì)胞,黃色箭頭示纖維細(xì)胞,紅色箭頭示新生毛細(xì)血管。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測與方法

1.4.1 穴位敏化檢測 (1)穴位選擇與定位:選取大鼠雙側(cè)手厥陰心包經(jīng)上內(nèi)關(guān)穴為特異性經(jīng)穴,另選擇尺澤穴為他經(jīng)穴位,大鼠臀大肌隆起處為非經(jīng)非穴。根據(jù)由中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜,取穴定位如下:內(nèi)關(guān)穴:前肢內(nèi)側(cè),離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。尺澤穴:肘彎橫紋偏外凹陷中。非經(jīng)非穴:大鼠臀大肌隆起處,距環(huán)跳穴(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣)外側(cè)5 mm[10]。

(2)穴位機(jī)械痛閾檢測:采用Electric VonFrey 測痛儀檢測造模前和造模后空白組和心絞痛模型組大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴、尺澤穴、非經(jīng)非穴的機(jī)械痛閾值。于檢測前一天剃除大鼠待檢測穴位皮膚毛發(fā)。檢測當(dāng)天校正儀器,將大鼠固定在自制鼠臺(tái)上,將探針頭對準(zhǔn)檢測穴位,垂直、緩慢下壓,用力均勻,待大鼠出現(xiàn)嘶叫、甩尾、伸足、縮足等躲避反應(yīng)時(shí)移開探針,讀取此時(shí)顯示屏上數(shù)值。每個(gè)穴位檢測3次,每次檢測間隔3分鐘以上,取3次數(shù)值的平均值,若3次檢測數(shù)值相差5以上,則重新檢測。

(3)穴位敏化判定:參考相關(guān)文獻(xiàn)[12],以造模前后穴位痛閾值變化率為標(biāo)準(zhǔn),判斷穴位是否發(fā)生敏化。痛閾值變化率=(造模后痛閾值-造模前痛閾值)/造模前痛閾值。比較空白組和模型組痛閾值變化率,找出敏化穴位。

1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測序 選取心絞痛模型組敏化穴位及空白組對應(yīng)穴位皮膚及皮下組織3 mm×3 mm×3 mm,生理鹽水沖洗干凈,置于凍存管中迅速投入液氮,干冰送至南京派森諾基因科技有限公司檢測。使用TRIZOL試劑提取總RNA,采用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行總RNA的檢測,檢測后純化mRNA。

用Oligo(dT)珠富集帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA,采用離子打斷方式,將RNA長度打斷成大小為300 bp左右的片段。用6堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶,以RNA為模板合成cDNA第一鏈,再以第一鏈cDNA為模板,合成cDNA第二鏈。構(gòu)建文庫,并對文庫進(jìn)行質(zhì)檢。在Illumina測序平臺(tái)用第二代測序技術(shù),進(jìn)行文庫的雙末端測序。利用DESeq對基因表達(dá)差異進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1、顯著性P<0.05的差異表達(dá)基因,并對其進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.4.3 RT-qPCR驗(yàn)證 參考相關(guān)文獻(xiàn)[15-23],挑選出9個(gè)與炎癥、疼痛、肥大細(xì)胞有關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,這9個(gè)基因分別是Nqo2、Adam11、Gpr65、Ghrhr、Angptl4、Krt16、Mmp11、Chrna1、Hmgcs2,內(nèi)參基因?yàn)镚apdh,引物序列見表1。使用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(帶gDNA清除柱)提取總RNA,用10 μL RNA溶液和10 μL 2×RT OR-EasyTMMix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),并于42℃金屬浴中反應(yīng)30分鐘,72℃金屬浴中反應(yīng)10分鐘。將最終得到的溶液稀釋10倍后進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),反應(yīng)體系為:10 μL 2×Real PCR EasyTMMix-SYBR、10 μL樣本和上下游引物各0.3 μL。將10 μL基因特異性qPCR反應(yīng)液和10 μL樣品加入96孔板中,置于實(shí)時(shí)定量PCR儀中運(yùn)行,程序如下:95℃,20 s;(95℃,20 s;60℃,20 s)40 cycles;添加溶解曲線。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 穴位敏化檢測結(jié)果

Shapiro-Wilk test檢驗(yàn)提示,雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴、尺澤穴和非經(jīng)非穴符合正態(tài)分布,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

與空白組相比,模型組雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴痛閾值顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明模型組大鼠左、右內(nèi)關(guān)穴均發(fā)生了痛敏化現(xiàn)象。雙側(cè)尺澤穴、雙側(cè)非經(jīng)非穴痛閾值變化率組間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),沒有發(fā)生痛敏現(xiàn)象。見表2。

表2 造模前后大鼠痛閾值變化率組間比較鼠只=9)

2.2 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

通過對空白組和模型組mRNA表達(dá)進(jìn)行分析比較,發(fā)現(xiàn)敏化穴位(內(nèi)關(guān)穴)局部的差異表達(dá)mRNA共45個(gè),其中上調(diào)16個(gè),下調(diào)29個(gè),見表3、圖4。

表3 兩組大鼠差異表達(dá)mRNA篩選

注:圖中兩條豎虛線為2倍表達(dá)差異閾值,橫虛線為P值=0.05閾值;紅點(diǎn)表示該組上調(diào)基因,藍(lán)點(diǎn)表示該組下調(diào)基因,灰點(diǎn)表示非顯著差異表達(dá)基因;C為空白組,T為模型組。

2.3 差異表達(dá)基因GO富集分析和KEGG通路分析

通過GO富集結(jié)果、Rich factor值、FDR值和富集到該GO Term的基因數(shù)來衡量富集程度。其中,富集因子(Rich factor)為GO Term中富集到的差異基因數(shù)與注釋的基因數(shù)之比。富集程度越高,Rich factor值越高。FDR取值范圍0～1,富集越顯著時(shí),FDR值越接近于0。挑選出FDR值最小的前20個(gè)GO Term條目,即富集最顯著的進(jìn)行展示,結(jié)果表明差異表達(dá)基因參與的生物過程包括表皮細(xì)胞分化、蛋白變性等;細(xì)胞組分包括HAUS復(fù)合物、超分子聚合物等;分子功能包括煙酰胺核糖苷還原酶活性、羥甲基戊二酰輔酶a裂合酶活性等,見圖5～6。

圖5 GO富集分析柱狀圖

圖6 GO富集分析氣泡圖

通過KEGG富集結(jié)果、Rich factor值、FDR 值和富集到該通路的基因數(shù)量來衡量富集程度。其中,Rich factor為該通路中富集的差異基因數(shù)與注釋基因數(shù)之比。富集程度越高,Rich factor值越高。選取FDR值最小,即富集最顯著的前20條KEGG通路進(jìn)行展示,結(jié)果表明差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路包括PPAR信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等,見圖7～8。

圖7 KEGG富集分析柱狀圖

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

對9個(gè)差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,通過溶解曲線分析得出,除內(nèi)參外,其余基因均為單一峰,表明PCR擴(kuò)增特異性較好。RT-qPCR 結(jié)果如表4所示,模型組與空白組比較,Adam11表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致;Gpr65、Nqo2表達(dá)上調(diào),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果不一致;Angptl4、Chrna1、Hmgcs2、Krt16表達(dá)下調(diào),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果不一致;Ghrhr、Mmp11表達(dá)下調(diào),與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果組間比較鼠只=6)

3 討論

CHD屬于中醫(yī)“胸痹”“心悸”“真心痛”等范疇,針灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法已被證實(shí)在治療CHD心絞痛方面取得了確切的療效[24]。針灸治療CHD多選用內(nèi)關(guān)穴,內(nèi)關(guān)穴是手厥陰心包經(jīng)的絡(luò)穴,“循經(jīng)以上,系于心包,絡(luò)心系”,有著理氣寬胸、活血祛瘀的作用[25]。同時(shí)內(nèi)關(guān)穴也是八脈交會(huì)穴,通于陰維脈,“陰維為病,苦心痛”。在大量的數(shù)據(jù)挖掘研究中發(fā)現(xiàn),CHD患者會(huì)出現(xiàn)穴位敏化現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為:(1)穴位熱敏現(xiàn)象,穴位溫度改變。(2)穴位力敏現(xiàn)象,按壓穴位時(shí)出現(xiàn)酸、麻、脹、痛等感覺的改變。(3)穴位光敏現(xiàn)象,CHD患者相關(guān)穴位紅外輻射強(qiáng)度在與健康人之間存在差異。(4)穴位形敏現(xiàn)象,穴位皮膚發(fā)生色澤、形態(tài)改變。(5)穴位電敏現(xiàn)象,CHD患者相關(guān)穴位皮膚電阻顯著升高,左右電阻失衡。(6)穴位痛敏現(xiàn)象,CHD患者相關(guān)穴位痛閾值降低。在所有發(fā)生敏化的穴位當(dāng)中,內(nèi)關(guān)穴敏化頻次最高,且CHD目前所涉及到的所有敏化形式都在內(nèi)關(guān)穴被檢測到,是CHD穴位敏化現(xiàn)象運(yùn)用于臨床診治的代表性穴位[5]。穴位敏化是指機(jī)體疾病狀態(tài)下,腧穴由“沉寂態(tài)”轉(zhuǎn)化為“激活態(tài)”的過程,能夠幫助診斷和治療疾病,指導(dǎo)針灸臨床選穴。本實(shí)驗(yàn)采用Electric Vonfrey 測痛儀檢測造模前后CHD心絞痛模型大鼠和空白組大鼠穴位機(jī)械痛閾值,比較兩組大鼠痛閾值變化率,結(jié)果顯示模型組大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴機(jī)械痛閾值明顯降低,說明內(nèi)關(guān)穴發(fā)生痛敏化現(xiàn)象。該結(jié)果也與團(tuán)隊(duì)臨床檢測結(jié)果一致。但本研究僅采用穴位機(jī)械痛閾值變化率來判斷穴位是否發(fā)生敏化,評判標(biāo)準(zhǔn)較為單一,還應(yīng)將其它穴位敏化檢測指標(biāo)一并納入檢測,如穴位溫度、穴位電阻、感覺神經(jīng)定位檢測等,多角度評估穴位敏化。

差異表達(dá)基因研究是近年來的研究熱點(diǎn),被越來越多的應(yīng)用于疾病機(jī)制的研究中。翟雪芹等[8]探索研究了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病穢濁痰阻證患者差異表達(dá)基因及相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)穢濁痰阻證與CHD非穢濁痰阻證患者存在顯著的差異表達(dá)基因,這些差異表達(dá)基因顯著富集在與CHD相關(guān)的多條功能通路中,從分子水平闡明了其穢濁痰阻證的生物學(xué)特點(diǎn)。樊小農(nóng)等[9]利用基因芯片技術(shù)對老年癡呆進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)譜研究,探討差異表達(dá)基因在老年癡呆病理機(jī)制中的作用。差異表達(dá)基因的研究也為穴位敏化發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制研究提供了新的思路和平臺(tái),通過對敏化穴位相關(guān)差異性表達(dá)基因的研究,探索穴位敏化發(fā)生的機(jī)制。在有關(guān)穴位敏化發(fā)生機(jī)制的研究中,前人有從神經(jīng)生物學(xué)方面進(jìn)行探究,崔翔[26]研究發(fā)現(xiàn)穴位敏化的發(fā)生可能與交感神經(jīng)有關(guān),胡瑞斌等[27]在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)興奮會(huì)激活背根節(jié)中型神經(jīng)元表達(dá)CGRP來介導(dǎo)穴位敏化的發(fā)生。但從差異表達(dá)基因方面入手探索穴位敏化產(chǎn)生機(jī)制的研究還略顯不足。本實(shí)驗(yàn)在此方向進(jìn)行探索研究,通過對大鼠敏化穴位(內(nèi)關(guān)穴)皮膚及皮下組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)mRNA共45個(gè),并對這些差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行生物學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因參與的生物過程和信號(hào)通路,如PPAR信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等。參考相關(guān)文獻(xiàn)[28-30],這些信號(hào)通路可能與穴位痛敏化發(fā)生機(jī)制有關(guān),有待進(jìn)一步研究。

在得出的差異表達(dá)基因中,進(jìn)一步通過搜索文獻(xiàn)找到與炎癥、疼痛、肥大細(xì)胞有關(guān)的差異表達(dá)mRNA共9個(gè)[15-23],并對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,在得出的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一條表達(dá)顯著上調(diào)且與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致的基因——Adam11。有研究表明,Adam11在疼痛傳遞和引起痛閾值變化的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮作用,由此推測Adam11這條差異表達(dá)mRNA可能參與穴位痛敏化發(fā)生的調(diào)控機(jī)制,可做進(jìn)一步研究[15]。在RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果中有的差異基因表達(dá)趨勢與有參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;有的差異基因表達(dá)趨勢與有參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果不一致。這可能與檢測樣本量較小,基因多態(tài)性等有關(guān),需增加樣本含量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述,本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了疾病狀態(tài)下穴位敏化現(xiàn)象發(fā)生的客觀性,用機(jī)械痛閾值檢測方法證實(shí)了CHD心絞痛模型大鼠內(nèi)關(guān)穴出現(xiàn)了痛敏化現(xiàn)象;從分子生物學(xué)水平探索了穴位敏化產(chǎn)生的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)一條差異表達(dá)基因Adam11可能參與調(diào)控穴位痛敏化的發(fā)生,但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。