侯 悅,張金仿,馬開慧,鄭 艷

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心,北京 100050

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差[1]。有研究顯示,Ⅳ級神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生存期往往不到一年,這主要由于腦膠質(zhì)瘤細胞的快速、不受控制的增殖以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的高侵襲性[2]。因此,了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制將有助于改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的療效。微小RNA(miRNA)是長度為19～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA,主要通過靶向信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)影響mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯的穩(wěn)定性。miRNA可調(diào)控抑癌或致癌基因的表達水平,并參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明,miR-16-1在減少膠質(zhì)瘤細胞的侵襲中發(fā)揮了作用,而miR-155通過靶向FOXO3a促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲,而PI3K/Akt信號傳導(dǎo)可能對其負調(diào)控[3]。 近期有研究表明,miR-155的表達可能受包括c-MYB在內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),c-MYB與造血細胞的分化和增殖有關(guān) c-MYB促進miR-155宿主基因MIR155HG在慢性淋巴細胞性白血病中的表達水平,這表明c-MYB可能充當(dāng)miR-155的轉(zhuǎn)錄激活因子[4-5]。

金絲桃苷具有抗衰老,抗炎和抗氧化的特性,可防止異丙腎上腺素引起的心肌損傷[6]。有研究表明,金絲桃苷對乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和前列腺癌具有抗癌作用[7]。理化分析表明,金絲桃苷不僅可溶于水,而且還具有很高的親脂性,因此它很容易穿過血腦屏障[8]。有研究表明,腦脊液中金絲桃苷的水平高于血液,因此,金絲桃苷已被用于改善帕金森病的失眠癥和預(yù)防[9]。目前,金絲桃苷對腦膠質(zhì)瘤細胞的作用的研究報道尚不清楚。本研究擬探討金絲桃苷經(jīng)miR-155/c-MYB通路抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、侵襲及遷移作用,為腦膠質(zhì)瘤的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及分組 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系U251購自中國科學(xué)院(中國上海)。使用Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/ F12培養(yǎng)細胞,該細胞培養(yǎng)基還含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL 鏈霉素。細胞培養(yǎng)環(huán)境為:37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2。細胞分組設(shè)計如下。U251細胞組:細胞濃度為5×106/mL的腦膠質(zhì)瘤U251細胞在10%FBS的DMEM中培養(yǎng);紫杉醇組:腦膠質(zhì)瘤U251細胞培養(yǎng)方法同U251細胞組,加入紫杉醇,使紫杉醇濃度為300 μmol/mL;金絲桃苷低、高劑量組的腦膠質(zhì)瘤U251細胞培養(yǎng)方法同U251細胞組,各組分別加入金絲桃苷,使金絲桃苷濃度分別為300、600 μmol/mL。以上各組細胞設(shè)置6個平行孔,培養(yǎng)72 h。

1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基/F12(美國格蘭德島生命技術(shù)公司,批號545263.32);FBS、青霉素、鏈霉素(中國碧云天生物技術(shù)研究所,批號:598756.63、548985.38、415298.59);金絲桃苷(美國Sigma公司,批號:MN-45875.36);紫杉醇(德國Merck KGaA,批號:RF-4512.36);CCK-8測定試劑盒(江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司,批號:14526.34);TRIzol?試劑(美國Invitrogen公司,批號:NB-478523.34);PrimeScriptTMRT試劑盒(日本TaKaRa公司,批號:VC-418963);SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本TaKaRa公司);放射免疫沉淀測定緩沖液(中國碧云天生物技術(shù)研究所,批號:BV-47896.32);雙辛可寧酸試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)研究所,批號:VH-412369.96);PVDF膜(美國EMD Millipore公司,批號:CI-54896.36);c-MYB一抗(1∶2 000;美國Sigma公司);β-肌動蛋白(β-actin)一抗,1∶5 000;美國Sigma公司);膜與抗兔IgG(1∶5 000;美國Sigma公司);增強型化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)檢測試劑盒(美國Pierce Biotechnology公司,批號:B548596)。FR-09酶標(biāo)儀(Bio-Rad Laboratories);Transwell上室(孔徑0.8 μm;美國BD公司,批號:XI-478596);基質(zhì)膠(美國Sigma-Aldrich公司,批號:452656.36);yh-09倒置光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);NanoDrop 1000分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3細胞增殖測定 通過CCK-8法檢測細胞的增殖活性。在相應(yīng)的時間點將10 mL的CCK-8溶液添加到每個孔中。在37 ℃下溫育2 h后,使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度(A)。存活率=(A實驗組-AU251細胞組)/(A實驗組-A蒸餾水空白組)×100%。

1.4細胞侵襲遷移水平測定 采用Transwell測定法評估細胞遷移和侵襲能力。為了進行遷移分析,使用無FBS培養(yǎng)基稀釋約105個細胞加入預(yù)先涂有基質(zhì)膠的上室中。隨后,將500 mL含10%FBS的培養(yǎng)基加入下室中。溫育48 h后,使用棉簽去除非遷移/侵襲性細胞。使用甲醇將下腔室中遷移/侵襲的細胞固定15 min,然后用0.5%的結(jié)晶紫染色。使用倒置光學(xué)顯微鏡在10個隨機選擇的區(qū)域中進行細胞計數(shù)。

1.5細胞凋亡水平測定 流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。在相應(yīng)的時間點將Annexin V-FITC和PI試劑各15 μL添加到每個孔中,孵育18 min,混勻,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.6細胞miR-155、c-MYB mRNA水平測定 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)測定細胞miR-155、c-MYB水平。使用TRIzol?試劑提取細胞中的總RNA,使用NanoDrop 1000分光光度計評估提取的RNA純度和質(zhì)量濃度。 cDNA由PrimeScriptTMRT試劑盒合成,使用SYBR Green PCR Master Mix進行PCR反應(yīng)。以內(nèi)源性β-actin和U6小核RNA分別作為對照來標(biāo)準化mRNA和miRNA的表達。正向和反向引物的序列如下。miR-155:正向引物為5′-TGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTAG-CTGATCGAC-3′,反向引物為5′-TGCTAGTCGAT-CGATCGATCGTACGTAGCTAGCTAGCTAGCT-AGC-3′;c-MYB:正向引物為5′-TCGCGATCGATCG-TAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGC-3′,反向引物為5′-TGCTAGTCGATCGATCGATCGTAGCTA-GCTCGCTCGCT-3′;β-actin:正向引物為5′-TCG-CTAGTCGATCGATCGATCGATCGTAGCTAGCT-CGATCG-3′,反向引物為5′-TGCTAGCTA-GCTAGCTAGCTAGCTGATCGCTAGC-3′;內(nèi)參U6:正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′,反正向引物為5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

1.7細胞c-MYB蛋白水平測定 Western blotting法測定c-MYB蛋白水平。提取神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞總蛋白,使用雙辛可寧酸測定法確定提取的蛋白質(zhì)的濃度。SDS-PAGE電泳分離等量(40 mg)蛋白質(zhì)樣品,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,然后在室溫下使用含5%脫脂牛奶的Tris緩沖液封閉膜1 h,使用c-MYB、β-actin一抗4 ℃孵育過夜,洗滌后將膜與二抗溫育1 h。采用增強型化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)檢測試劑盒可視化蛋白質(zhì)條帶,通過Image J對信號進行定量。

2 結(jié) 果

2.1各組U251細胞存活率比較 與U251細胞組相比,紫杉醇組、金絲桃苷低、高劑量組存活率均顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組相比,金絲桃苷低劑量組存活率顯著升高(P<0.05),金絲桃苷高劑量組存活率顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組相比,金絲桃苷高劑量組存活率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

注:與U251細胞組相比,aP<0.05;與紫衫醇組相比,bP<0.05;與金絲桃苷低劑量組相比,cP<0.05。圖1 各組U251細胞存活率比較

2.2各組U251細胞克隆形成數(shù)目比較 與U251細胞組相比,紫杉醇組、金絲桃苷低、高劑量組克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組相比,金絲桃苷低劑量組克隆形成數(shù)顯著升高(P<0.05),金絲桃苷高劑量組克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組相比,金絲桃苷高劑量組克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖2。

2.3各組U251細胞侵襲遷移能力比較 與U251細胞組相比,紫杉醇組、金絲桃苷低、高劑量組穿膜數(shù)目顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組相比,金絲桃苷低劑量組穿膜數(shù)目顯著升高(P<0.05),金絲桃苷高劑量組穿膜數(shù)目顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組相比,金絲桃苷高劑量組穿膜數(shù)目顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注:A為各組U251細胞侵襲遷移能力(200×);B為各組U251細胞穿膜情況統(tǒng)計與U251細胞組相比,aP<0.05;與紫衫醇組相比,bP<0.05;與金絲桃苷低劑量組相比,cP<0.05。圖3 各組U251細胞侵襲遷移能力比較

2.4各組U251細胞凋亡率比較 與U251細胞組相比,紫杉醇組、金絲桃苷低、高劑量組凋亡率顯著升高(P<0.05);與紫杉醇組相比,金絲桃苷低劑量組凋亡率顯著減低(P<0.05),金絲桃苷高劑量組凋亡率顯著升高(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組相比,金絲桃苷高劑量組凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖4。

注:與U251細胞組相比,aP<0.05;與紫衫醇組相比,bP<0.05;與金絲桃苷低劑量組相比,cP<0.05。圖4 各組U251細胞凋亡率比較

2.5各組U251細胞miR-155、c-MYB mRNA及蛋白表達水平比較 與U251細胞組相比,紫杉醇組、金絲桃苷低、高劑量組miR-155、c-MYB mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與紫杉醇組相比,金絲桃苷低劑量組miR-155、c-MYB mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),金絲桃苷高劑量組miR-155、c-MYB mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組相比,金絲桃苷高劑量組miR-155、c-MYB mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注:A為各組U251細胞miR-155、c-MYB mRNA表達水平比較;B為各組U251細胞c-MYB蛋白表達水平比較;與U251細胞組相比,aP<0.05;與紫衫醇組相比,bP<0.05;與金絲桃苷低劑量組相比,cP<0.05。圖5 各組U251細胞miR-155、c-MYB mRNA及蛋白表達水平比較

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是腦部常見的侵襲性原發(fā)性惡性腫瘤之一,占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的大多數(shù)。盡管目前已經(jīng)開發(fā)出諸如輔助放射療法、激素療法、化學(xué)療法和靶向生物療法等腦膠質(zhì)瘤療法,但大多神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的總體生存率仍然很低,預(yù)后較差。因此,亟待尋找新的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方法。

金絲桃苷是單寧酸的基本組成單元,在植物界廣泛分布。據(jù)報道,金絲桃苷具有抗癌作用,可以在不同階段干擾腫瘤的進展[10]。金絲桃苷可抑制腫瘤血管生成,其潛在的機制可能與上調(diào)包括血管內(nèi)皮生長因子在內(nèi)的關(guān)鍵血管生成因子而干擾參與血管生成的CXCR4/SDF-1相互作用有關(guān)[11]。金絲桃苷在MB-49鼠膀胱癌模型中對體外侵襲具有抑制作用,其機制與抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)有關(guān)。此外,金絲桃苷還可以通過抑制激活蛋白1的轉(zhuǎn)錄活性來預(yù)防動脈粥樣硬化[12]。金絲桃苷的抗病毒能力與其抗氧化活性有關(guān)[13]。目前,關(guān)于金絲桃苷在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的作用的報道很少。本研究結(jié)果表明,膠質(zhì)瘤U251細胞經(jīng)金絲桃苷處理后,其存活率、單細胞克隆形成數(shù)目,穿膜數(shù)降低,凋亡率升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且金絲桃苷高劑量組效果優(yōu)于紫衫醇組(P<0.05)。這說明金絲桃苷可降低膠質(zhì)瘤細胞的活力,以及增殖和侵襲能力,并促進其凋亡。

氧缺少和缺乏營養(yǎng)會導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞分泌促血管生成因子,其在腫瘤生長中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報道金絲桃苷在一定程度上具有體外的抗血管生成活性。人胎盤靜脈血管生成模型分析表明,金絲桃苷對人血管生成的起始和新生血管的生長具有劑量依賴性的抑制作用[14]。大鼠試驗表明,250 mg金絲桃苷的給藥顯著抑制了血管生成,然而,灌胃金絲桃苷的大鼠并未顯著抑制血管生成的起始和新血管的生長[15]。本研究未探討金絲桃苷對腦膠質(zhì)瘤U251細胞血管的生成作用,但根據(jù)本研究數(shù)據(jù),金絲桃苷可能對血管生成有用,但需要進一步闡明其潛在機制。

有研究發(fā)現(xiàn),miR-155通過靶向FOXO3a來促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲,該研究推測金絲桃苷可能通過調(diào)節(jié)miR-155的表達在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中起抑制作用[16]。本研究檢測了金絲桃苷(300、600 μg/mL)處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中miR-155的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)金絲桃苷顯著抑制了miR-155的表達水平。有研究表明,金絲桃苷可以正向調(diào)節(jié)乳腺癌細胞中miR-362-3p的表達水平,而miR-362-3p可以靶向并抑制與腫瘤相關(guān)的分子,如TNFAIP8、NRP2,而TNFAIP8、NRP2在人乳腺癌中具有抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡功能[17]。結(jié)合本研究結(jié)果,TNFAIP8、NRP2也有可能參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲,這有待后續(xù)進一步研究證實。

c-MYB已被認為是miR-155的轉(zhuǎn)錄激活因子,c-MYB在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達,并與癌細胞的侵襲呈正相關(guān),這提示金絲桃苷可能通過miR-155靶向抑制c-MYB表達[18]。在本研究中,與U251細胞組比較,紫衫醇組、金絲桃苷低、高劑量組c-MYB mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05);與紫衫醇組比較,金絲桃苷低劑量組c-MYB mRNA和蛋白表達升高,金絲桃苷高劑量組c-MYB mRNA和蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與金絲桃苷低劑量組比較,金絲桃苷高劑量組c-MYB mRNA和蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而在前列腺癌細胞中,c-MYB沉默與前列腺癌細胞的遷移和侵襲相關(guān)[19]。結(jié)合金絲桃苷對miR-155的作用,提示金絲桃苷抑制miR-155、c-MYB的表達進而抑制miR-155/c-MYB通路,這可能是金絲桃苷抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞機制之一。

綜上所述,金絲桃苷可降低膠質(zhì)瘤細胞的活力,增殖和侵襲能力,并促進其凋亡,其機制可能與金絲桃苷抑制miR-155、c-MYB表達進而抑制miR-155/c-MYB通路有關(guān)。但本文尚未設(shè)置miR-155/c-MYB通路抑制劑實驗,需在后續(xù)研究中進一步驗證。