李琦， 張樹林， 張達娟， 賈瀅暄， 王澤斌

（天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392）

微藻是水生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力的主要貢獻者，含有豐富的蛋白質、多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、維生素等營養(yǎng)物質，不僅是水生動物的優(yōu)質天然餌料，而且在保健食品、藥物、飼料、化妝品、生物農(nóng)藥、廢水治理等方面具有較廣泛的應用前景，亦可用于改善水質[1-5]，進行水質調控。牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）是一種海洋硅藻，隸屬硅藻門（Bacillariophyta），其營養(yǎng)豐富、生長迅速、大小適宜，便于對蝦早期幼體攝食，是對蝦育苗中常用的餌料微藻，其規(guī)模化培養(yǎng)一直是研究的熱點之一。

朱昔恩等[6]研究表明，NaNO3效果優(yōu)于CO(NH2)2且NaNO3在25～100 mg·L-1時效果最好，磷和硅分別在2.5 和30 mg·L-1時有利于牟氏角毛藻生長；林權卓等[7]、張貴杰等[8]研究不同的氮源對牟氏角毛藻增殖的影響，均認為CO(NH2)2效果優(yōu)于NaNO3；于瑾等[9]通過單因素試驗研究表明，氮、磷和鐵對牟氏角毛藻生長影響顯著，在正交試驗中，當?shù)土踪|量濃度分別為35和1.5 mg·L-1時，牟氏角毛藻生長最快，此時受氮的影響，鐵對牟氏角毛藻的生長影響不顯著。以上研究表明，營養(yǎng)鹽的不同種類和含量水平對牟氏角毛藻的生長有顯著影響，但各研究結果之間存在一定的差異，歸其原因是培養(yǎng)基成分種類繁多，關系錯綜復雜。單因素法僅考慮單一因素的影響，缺乏因素間的交互性，正交試驗法雖能同時考慮多種因素，但不能得出因素和響應值之間明確的函數(shù)表達式（即回歸方程），進而無法求得整個區(qū)域中因素的最佳組合和最優(yōu)值[10]。因此選用高效的方法尤為重要，數(shù)學統(tǒng)計中的優(yōu)化方法已廣泛應用于微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，其中以響應面法的效果最顯著[11]。響應面法克服正交試驗法不能給出直觀圖像的缺點，彌補傳統(tǒng)方法中非線性關系的深度不足并且考慮誤差，建立多項數(shù)學模型，對模型進行顯著性檢驗并得出最優(yōu)值。本研究用響應面法優(yōu)化牟氏角毛藻培養(yǎng)基，篩選營養(yǎng)鹽最佳質量濃度，為其高密度培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

牟氏角毛藻購自上海光語生物科技有限公司，在f/2 培養(yǎng)基上于光照培養(yǎng)箱（MLR352-PC，日本三洋有限公司）中進行培養(yǎng)，鹽度29，培養(yǎng)溫度為（22±1）℃，光照強度為50 μmol·m-2·s-1，光照/黑暗時間為12 h/12 h，每天搖瓶3次，防止沉淀。

1.2 試驗設計

1.2.1單因素試驗設計 采用單因素試驗法對f/2培養(yǎng)基的各營養(yǎng)鹽濃度進行篩選，氮（NaNO3）、磷（NaH2PO4·H2O）、硅（Na2SiO3）、鐵（C6H8FeNO7），每種營養(yǎng)鹽均設置1 個對照組（0 mg·L-1）和6 個試驗組（表1），每個試驗組分別設置3 次重復。取對數(shù)生長期的牟氏角毛藻離心（5 000 r·min-1，5 min，4 ℃）并去上清液，將藻泥加入經(jīng)高溫滅菌的上述各試驗組的培養(yǎng)基中，藻細胞初始密度均為1×106cell·mL-1。試驗進行14 d，培養(yǎng)條件同1.1 藻種培養(yǎng)，在第8 天使用血球計數(shù)板進行藻細胞計數(shù)，確定4 種營養(yǎng)鹽的最適質量濃度范圍。

表1 營養(yǎng)鹽單因素水平Table 1 Single factor level of nutrients （mg·L-1）

1.2.2響應面法試驗設計 以A、B、C 和D 分別代表NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7，經(jīng)單因素試驗法篩選出的A、B、C 和D 的適宜質量濃度，以此為基礎分別設置3 個水平（表2），以密度（Y）為響應值，采用Design Expert 11.0 統(tǒng)計分析軟件的響應面分析法優(yōu)化試驗[11-15]，每組設置3 次重復，共設計29 個試驗點（中心點重復5 次，用于估計試驗誤差），以獲取最佳營養(yǎng)鹽質量濃度。

表2 Box-Behnken 試驗因素水平Table 2 Box Behnken experimental factor level（mg·L-1）

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用平均值±標準差表示，使用Design-Expert11.0 軟件繪制等高線和響應曲面圖。利用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，使用Original繪圖制表。

2 結果與分析

2.1 營養(yǎng)鹽單因素試驗結果分析

不同質量濃度的單一營養(yǎng)鹽對牟氏角毛藻生長的影響如圖1 所示，在培養(yǎng)至第8 天時，牟氏角毛藻密度分別在NaNO3質量濃度為20 mg·L-1、NaH2PO4·H2O質量濃度為2 mg·L-1、Na2SiO3質量濃度為50 mg·L-1、C6H8FeNO7質量濃度為0.3 mg·L-1時達到最大值，分別為6.90×106，6.07×106，5.15×106，5.12×106cell·mL-1，均顯著高于對照組和其他試驗組（P<0.05），根據(jù)牟氏角毛藻生長情況初步選擇10~30 mg·L-1的NaNO3、1.0~3.0 mg·L-1的NaH2PO4·H2O、20~80 mg·L-1的Na2SiO3和0.1~0.5 mg·L-1的C6H8FeNO7進行響應優(yōu)化。

圖1 不同營養(yǎng)鹽對牟氏角毛藻生長的影響Fig. 1 Growth of Chaetoceros muelleri with different nutrient species

2.2 響應面法試驗結果分析

2.2.1回歸分析 響應面法結果見表3，將數(shù)據(jù)通過Design-Expert 11.0 軟件擬合，得到細胞密度（Y）和NaNO3（A）、NaH2PO4·H2O（B）、Na2SiO3（C）和C6H8FeNO7（D）的回歸方程如下。

表3 響應面法試驗結果Table 3 Experimental results of response surface method

2.2.2方差及殘差分析 對上述模型進行方差分析，結果如表4 所示，該回歸方程的F值為29.89，P<0.000 1，模型極顯著；由顯著性水平檢驗可知，A、B、C、AC、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2項對細胞密度影響顯著（P<0.05）；其中決定系數(shù)R2＝0.967 6，矯正系數(shù)R2＝0.935 3；該模型中精密度值測量精度為19.407 7，當精密度值測量精度大于4 時可用；通過殘差分析，殘差的正態(tài)概率分布圖和預測值與試驗實際值的分布圖（圖2～4）可以看出，圖里的各個散點都靠近同一條直線。綜上所述，該模型中細胞密度對NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7有較好的擬合性。

圖2 殘差的正態(tài)概率分布Fig. 2 Normal probability distribution of residuals

圖3 殘差與方程預測值分布Fig. 3 Residual error and predicted value distribution of the equation

圖4 預測值與試驗實際值分布Fig. 4 Distribution diagram of predicted value and actual value in experiment

2.2.3響應面法交互作用分析 NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7間交互作用的響應面分析見圖5，當NaH2PO4·H2O（B）和C6H8FeNO7（D）分別為2 和0.3 mg·L-1時，NaNO3（A）和Na2SiO3（C）的交互作用對牟氏角毛藻密度的影響，結合方差分析表可知P<0.05，等高線呈橢圓形且密集，說明這2 個因素有較強的交互作用；隨著NaNO3和Na2SiO3質量濃度的增加，藻細胞密度先上升后下降，NaNO3的幅度大于Na2SiO3的幅度，表明NaNO3在兩者之間的交互影響大于Na2SiO3；同時質量濃度適當?shù)腘aNO3和Na2SiO3可在一定程度上提高藻細胞密度。由圖5 結合表4可知，等高線明顯呈橢圓形且較密集，說明各因素間交互作用強，對密度影響極顯著；隨著質量濃度的增加，曲面呈先升后降趨勢，在水平靠近0時，藻密度（Y）最大。Na2SiO3（C）和C6H8FeNO7（D）分別為50 和0.3 mg·L-1時，NaNO3（A）和NaH2PO4·H2O（B）的交互作用對牟氏角毛藻密度的影響，等高線呈橢圓形，說明NaNO3和NaH2PO4·H2O 有交互作用，結合方差分析可知P>0.05，表明這2 個因素交互作用較弱；隨著NaNO3和NaH2PO4·H2O 質量濃度的增加，細胞密度分別在水平0右側和靠近水平1的地方達到最大密度。NaNO3和C6H8FeNO7等高線呈橢圓特征，說明 NaNO3和C6H8FeNO7有交互作用，在表4中2因素表現(xiàn)為P>0.1，密度影響不顯著，交互作用較弱。

圖5 各因素交互作用對細胞密度的等高線和響應面圖Fig. 5 Contour line and response surface diagram of interaction of various factors on cell density

2.3 驗證試驗分析

通過響應面軟件Design-Expert 11.0對數(shù)據(jù)進一步的擬合分析，得到NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質量濃度分別為21.8、2.93、54.2 和0.158 mg·L-1時，藻細胞密度達到最大值。

將牟氏角毛藻接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基，NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質量濃度分別為21.8、2.93、54.2 和0.158 mg·L-1，其余營養(yǎng)鹽以f/2 培養(yǎng)基為標準。牟氏角毛藻生長曲線見圖6，在培養(yǎng)12 d 時藻密度達到最大值，為10.62×106cell·mL-1，顯著高于對照組（8.3×106cell·mL-1），藻細胞密度提高27.95%。從圖7 可以看出，試驗組與對照組中都具有一定的光合活性。試驗組中光合系統(tǒng)PSⅡ最大光能轉換效率的值逐漸上升，一直在較高的范圍內(nèi)浮動，而對照組在第8天后開始緩慢下降。

圖6 試驗組與對照組的生長曲線Fig. 6 Growth curves of experimental and control group

圖7 試驗組與對照組的最大光能轉化效率Fig. 7 Maximum light energy conversion efficiency of experimental group and control group

3 討論

氮、磷、硅和鐵是藻類生長所必需的營養(yǎng)元素，在硅藻培養(yǎng)過程中發(fā)揮不可替代的作用。其中,氮可以讓藻類大量繁殖，促進細胞生長、成熟和分裂；磷是細胞膜的重要組成成分，在細胞中起傳遞能量的作用，還可以通過調節(jié)酸堿度對培養(yǎng)基起緩沖作用；硅不僅是硅藻細胞壁的主要組成成分，而且還是生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，參與細胞的多種生長代謝過程；鐵是底棲硅藻重要的電子傳遞體，也是細胞內(nèi)某些還原酶系的組成成分，鐵源缺乏會降低硝態(tài)氮的還原水平，同時會抑制藻類細胞的生長[16]。

研究表明，氮、磷、硅和鐵均對藻類的生長有顯著性影響，其中氮的影響最顯著。張國慶等[17]研究表明，氮、磷、硅和鐵濃度分別在30、2、10、0.2 mg·L-1時細胞密度最大。本研究中，當?shù)獮?0 mg·L-1時，細胞密度達到6.93×106cell·mL-1，顯著高于對照組和其他試驗組(P<0.05)，隨著氮質量濃度的升高，牟氏角毛藻可能通過增加細胞內(nèi)蛋白質和葉綠素的合成，提高光合系統(tǒng)PSⅡ最大光能轉換效率，促進藻類的生長。通過對比發(fā)現(xiàn)，張國慶等[17]試驗周期和選用藥品與本研究不同，可能是周期較短，藻類生長速率較低，故造成密度上的差異；NaH2PO4·H2O 培養(yǎng)液呈酸性，牟氏角毛藻在消耗硝酸鹽并進行光合作用的過程中pH會逐漸上升，酸性NaH2PO4·H2O培養(yǎng)液可維持相對穩(wěn)定的pH，為牟氏角毛藻創(chuàng)造良好的生長和增殖環(huán)境。硅是微型硅藻合成細胞壁的必需元素，缺硅則無法形成外殼并完成其正常生長周期[6]。Shifrin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，微藻在缺硅的條件下1 周，細胞就會停止分裂甚至死亡。本研究中硅源的最適質量濃度為50 mg·L-1，藻細胞密度可達5.15×106cell·mL-1，培養(yǎng)溫度及光強分別為（22±1）℃和50 μmol·m-2·s-1，明顯低于張國慶等[17]培養(yǎng)條件，由此可見牟氏角毛藻對溫度和光照比較敏感，培養(yǎng)液中添加C6H8FeNO7后，牟氏角毛藻的密度試驗組顯著高于對照組，印證了鐵是硅藻生長中必需的微量元素，由單因素試驗結果可知在0.1～0.5 mg·L-1時最適宜牟氏角毛藻生長。

綜合上述研究發(fā)現(xiàn)，前人試驗大多集中在篩選營養(yǎng)鹽的種類并使用單因素試驗得出各最適水平。本研究采用響應面法進行優(yōu)化，考慮到多種營養(yǎng)鹽種類并結合起來優(yōu)化對比分析，更系統(tǒng)地得到牟氏角毛藻最佳的營養(yǎng)鹽水平，對局部最具特征的點進行研究試驗，又在點的基礎上對整體的“面”進行精準地預測，回歸擬合整體范圍內(nèi)各因素之間的雙方的關系[19-21]。結合方差分析和等高線圖得到各營養(yǎng)鹽間存在交互作用，進而得出4因素對提升牟氏角毛藻細胞密度的最優(yōu)值，平衡各營養(yǎng)鹽，提高藻的生長速率。從回歸模型方差分析中可以看出NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、NaNO3和Na2SiO3、NaH2PO4·H2O和Na2SiO3、NaH2PO4·H2O和C6H8FeNO7、Na2SiO3和C6H8FeNO7均對牟氏角毛藻生長有顯著性影響，而NaNO3和NaH2PO4·H2O 與C6H8FeNO7影響不顯著，可能磷和鐵的水平較低，氮起主導性作用會對磷和鐵有一定的抑制。于瑾等[9]表明，當?shù)|量濃度為35 mg·L-1時，顯著抑制牟氏角毛藻對鐵的吸收。響應面反映的是NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO74 個因素中任意2個取零水平時，剩余2個因素相互作用對牟氏角毛藻密度的影響。通過軟件對數(shù)據(jù)進一步擬合分析，給出最佳反應條件，得到最優(yōu)值，即在NaNO3為21.8 mg·L-1、NaH2PO4·H2O 為2.93 mg·L-1、Na2SiO3為54.2 mg·L-1、C6H8FeNO7為0.158 mg·L-1時藻細胞密度達到最大值，對比原培養(yǎng)基，藻細胞密度提高了27.95%。