曹子健， 邱艷紅， 王爽， 趙娟， 鄭素月， 喬廣行， 秦文韜*

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100097； 2.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038； 3.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，北京 100097； 4.北京市頤和園管理處，北京 100097）

受氣候環(huán)境、種植模式、經(jīng)濟(jì)全球化等因素的影響，重大植物病害頻發(fā)，引發(fā)了一系列嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)安全問題，成為全球農(nóng)業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)[1-2]。病原物能侵染不同生長階段的植物引起嚴(yán)重的植物病害，危害農(nóng)業(yè)安全。對(duì)病原物進(jìn)行檢測(cè)和診斷有助于掌握植物病害的流行病學(xué)、地理分布等重要信息，從而對(duì)植物病害綜合管理和控制策略提供依據(jù)，有效避免植物病原物的引入和傳播[3]，因此，建立高效準(zhǔn)確的病原早期預(yù)警和快速診斷體系是防控植物病害的關(guān)鍵[4]。

早期植物病原的診斷依賴于癥狀識(shí)別和簡單的分離培養(yǎng)技術(shù)。傳統(tǒng)檢驗(yàn)技術(shù)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前農(nóng)業(yè)精準(zhǔn)化發(fā)展需求。隨著技術(shù)的發(fā)展逐漸出現(xiàn)了蛋白水平鑒定、核酸分子檢測(cè)、光譜分析檢測(cè)及多技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)等方法。其中，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)衍生出的一系列核酸分子檢測(cè)方法憑借檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)得以快速發(fā)展并廣為利用。1988 年，Chamberlain 等[5]首次報(bào)道了多重PCR（multiplex PCR，mPCR）技術(shù)，并將其用于同步擴(kuò)增多個(gè)序列以檢測(cè)基因的缺失情況。由于具有高效、操作簡便、成本低廉以及系統(tǒng)性的明顯優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)在近幾十年來得以迅速發(fā)展，在植物病原檢測(cè)上的應(yīng)用尤為突出。因此本文系統(tǒng)綜述了多重PCR 技術(shù)在植物病原真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并分析了該技術(shù)目前存在的問題，展望了該技術(shù)未來的發(fā)展前景，以期為植物病原物的早期診斷和植物病害的科學(xué)防控提供技術(shù)支撐，同時(shí)也為該技術(shù)更好地應(yīng)用提供借鑒。

1 多重PCR技術(shù)的原理

多重PCR 技術(shù)在傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來，可在單一反應(yīng)體系中針對(duì)多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)病原的檢測(cè)（圖1），具有通量高、成本低的優(yōu)點(diǎn)[6]。由于多重PCR 是在同一反應(yīng)中利用多對(duì)引物進(jìn)行靶標(biāo)擴(kuò)增，隨著引物的增加，引物間的相互作用會(huì)降低檢測(cè)靈敏度，增加檢出難度[7]，因此在構(gòu)建多重PCR 體系時(shí)，要求引物之間的退火溫度盡可能相近，引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物能夠區(qū)分，且在反應(yīng)過程中引物間不能交叉。經(jīng)過多年發(fā)展，多重PCR 衍生出多種類型，根據(jù)靶標(biāo)類型可分為巢式PCR（nested PCR，nPCR）、系統(tǒng)型特異多重PCR（phylotype-specific multiplex PCR，Pmx-PCR）、多重串聯(lián)PCR（multiplexed tandem PCR，MT-PCR）等；依據(jù)PCR種類又包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）等；依據(jù)PCR 反應(yīng)平臺(tái)分為微流控的PCR、固相載體的PCR 等[8-9]。目前，多重PCR 不僅能進(jìn)行基因分型以及多病原快速檢測(cè)，還可以用來研究某些微生物群落的結(jié)構(gòu)，并評(píng)估微生物的群落動(dòng)態(tài)或?qū)Νh(huán)境變化的響應(yīng)[10]。

圖1 多重PCR原理Fig. 1 Principle of multiplex PCR

2 多重PCR 技術(shù)在植物病原物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 植物病原真菌檢測(cè)

真菌是第一大植物病原，植物病原真菌快速檢測(cè)是植物病害綜合防控的重要基礎(chǔ)[11]。植物病原真菌的傳統(tǒng)診斷方法需要對(duì)病原培養(yǎng)，然后進(jìn)行顯微鏡觀察及致病性試驗(yàn)，該方法周期較長，且要求檢驗(yàn)人員具備一定的專業(yè)知識(shí)；此外，不同病原真菌形態(tài)特征較相似，在同一寄主上可能導(dǎo)致相似的癥狀，因此，病原真菌的精準(zhǔn)診斷是制定科學(xué)防控策略的前提和關(guān)鍵。利用高特異性的DNA 檢測(cè)技術(shù)可有效提高植物病原真菌鑒定的速度和準(zhǔn)確性[12]。目前，多重PCR 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于常見的植物病原真菌檢測(cè)過程中，并為植物真菌病害的防控提供了技術(shù)支撐。

炭疽菌（Colletotrichum）是引起禾本科植物、果樹、花卉、蔬菜等多種植物炭疽病的全球性植物病原真菌[13]。楊怡華等[14]通過巢式雙重PCR 技術(shù)檢測(cè)麥冬炭疽病病原菌山麥冬炭疽菌（C. liriopes）和黑斑病病原菌互隔交鏈孢菌（Alternaria alternata），靈敏度高達(dá)100 pg?μL-1DNA。Wang等[15]應(yīng)用高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）技術(shù)對(duì)Colletotrichum spp.、疫霉菌（Phytophthora spp.）和菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）的多重PCR反應(yīng)產(chǎn)生的特異性融化峰進(jìn)行分析，提高了草莓冠腐病病原體檢測(cè)和分化的準(zhǔn)確性。

立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的植物根腐病是常見的土傳病害，可為害多種蔬菜的幼苗、根、葉和莖。Wallon 等[16]建立了基于ITS（internally transcribed spacer）序列的R. solani及其融合群AG1-IB 的雙重qPCR 體系，靶標(biāo)的檢測(cè)限達(dá)到1 μg菌核·g-1干燥土壤。

鐮刀菌屬（Fusarium spp.）在自然界分布極廣，普遍存在于土壤及動(dòng)植物有機(jī)體，能引起小麥、水稻和蔬菜等植物的根腐、莖腐、花腐和穗腐等多種病害[17]。劉芮池等[18]建立了土傳病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）的三重PCR（triplex PCR）檢測(cè)體系，檢測(cè)靈敏度分別為每克土壤105個(gè)孢子、106個(gè)孢子及10-2mg菌絲。Villarino 等[19]建立的雙重PCR 體系每克土壤中可最低檢測(cè)出107孢子和105孢子的腐皮鐮刀菌（F. Solani）和F. oxysporum。

疫霉屬（Phytophthora spp.）真菌是馬鈴薯和番茄晚疫病的病原，常引發(fā)毀滅性災(zāi)害[20]。Liao等[21]通過優(yōu)化引物、模板濃度以及擴(kuò)增程序，建立能同時(shí)檢測(cè)疫霉屬以及樹莓疫霉根腐病菌（P.rubi）、草莓疫霉紅心病菌（P. fragariae）、栗黑水疫霉（P. cambivora）的四重PCR 反應(yīng)體系，與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，四重PCR 技術(shù)對(duì)靶標(biāo)病原的檢測(cè)靈敏度雖有所降低，但特異性和通量均有提升。同時(shí)，多重PCR 技術(shù)也被用來檢測(cè)仙人掌上的病原煙疫霉（P. nicotinae）和惡疫霉（P. cactorum）[22]。

腐霉屬（Pythium spp.）屬于卵孢菌綱，許多腐霉屬物種對(duì)植物具有致病性，在苗圃、農(nóng)田等不同生產(chǎn)系統(tǒng)中引起諸多植物病害，如濕腐、根腐、軟腐和莖腐等[23-25]。Ishiguro 等[26]開發(fā)了用以鑒定瓜果腐霉菌（Py. aphanidermatum）、旋柄腐霉（Py.helicoides）和群結(jié)腐霉（Py. myriotylum）的多重PCR技術(shù)。

此外，大斑突臍蠕孢（Exserohilum turcicum）和玉蜀黍平臍蠕孢（Bipolaris maydis）引起的大斑病和小斑病是影響玉米健康生長的2 種重要病害。代玉立等[27]基于交配型基因建立的多重PCR檢測(cè)體系能夠很好地區(qū)分上述2 種病原及其相應(yīng)的近緣種，靈敏度可達(dá)0.1 ng?μL-1DNA。

2.2 植物病原細(xì)菌檢測(cè)

細(xì)菌作為植物病害的第二大病原，可在種子、病殘?bào)w、土壤、糞肥、雜草寄主或昆蟲體內(nèi)越冬或越夏，侵染植物后可出現(xiàn)腐爛、壞死、萎蔫、變色、畸形等癥狀。有些植物細(xì)菌病害和生理性病害癥狀相似，一些病原難以人工培養(yǎng)，采用多重PCR技術(shù)可有效提高植物病原細(xì)菌的檢測(cè)效率。

黃單胞菌屬（Xanthomonas spp.）細(xì)菌能導(dǎo)致多種植物產(chǎn)生非特異性的癥狀，形態(tài)上難以區(qū)分，因此相關(guān)學(xué)者開發(fā)了許多快速、靈敏和特異的診斷方法[28]。Strayer 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，4 種黃單胞菌的hrpB7 基因存在單核苷酸序列多態(tài)性，基于此設(shè)計(jì)了4組特異性探針和2對(duì)引物，開發(fā)的多重實(shí)時(shí)熒光PCR 能夠檢測(cè)105~108CFU?mL-1的細(xì)菌DNA。在柑橘潰瘍病檢測(cè)方面，建立了針對(duì)X.citri pv. citri、X. citri pv. aurantifolii B 型和C 型3 種柑橘潰瘍病菌的多重PCR 檢測(cè)方法[30-31]。Jouen等[32]基于2 套引物和探針建立的雙重qPCR 方法可檢測(cè)Xanthomonas spp.，其中一套引物源于紅掌細(xì)菌性枯萎病病原X. phaseoli pv. dieffenbachiae 的ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；另一套源于紅掌的查爾酮合酶基因作為內(nèi)參。Webber 等[33]基于膜蛋白基因（filamentation temperature sensitive X，ftsX）和奎尼酸代謝基因（quinate metabolicgene，qumA）設(shè)計(jì)引物，建立了X. arboricolapv.corylina的雙重PCR 檢測(cè)方法。

棒形桿菌屬（Clavibacterspp.）能侵染多種植物，引起細(xì)菌性潰爛、葉片萎蔫，形成水皰樣斑點(diǎn)，最終導(dǎo)致整株壞死。Thapa 等[34]基于番茄細(xì)菌潰瘍病病原菌（C. michiganensis）的染色體基因rhuM和tomA設(shè)計(jì)引物，并以植物16S rDNA 基因作為內(nèi)參建立了多重PCR 的診斷平臺(tái)，檢測(cè)限為0.01 ng DNA。

茄科雷爾氏菌群（Ralstonia solanacearumspecies complex，RSSC）引起的植物青枯病是一種破壞性極強(qiáng)的細(xì)菌性病害，RSSC 包含1 個(gè)高度異質(zhì)性的細(xì)菌群，且種群的寄主范圍十分廣泛。He等[35]利用Pmx-PCR結(jié)合基于巨胞質(zhì)內(nèi)切葡聚糖酶基因（egl）的系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)不同植物RSSC 菌株進(jìn)行系統(tǒng)分型。Sharma等[36]同樣通過多重PCR檢測(cè)對(duì)盧旺達(dá)馬鈴薯青枯病RSSC 進(jìn)行系統(tǒng)分型，并依此繪制流行病學(xué)推斷分布圖。研究青枯病RSSC 群體分布和系統(tǒng)發(fā)育變異可為制定植物青枯病的防治策略提供依據(jù)[37]。李得銘等[38]利用3 對(duì)特異性引物構(gòu)建了番茄青枯病菌（R.solanacea）的三重PCR體系，可以精準(zhǔn)的從植株與土壤中定性監(jiān)測(cè)到該病原菌，單一PCR 檢測(cè)靈敏度為5 ng?μL-1DNA，而三重PCR 方法對(duì)青枯菌的模版DNA 檢測(cè)濃度最低為10-3ng?μL-1，大大提高了土壤中青枯病病原菌的監(jiān)測(cè)監(jiān)控能力，并能有針對(duì)性地預(yù)防和控制番茄病害，為番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

谷枯病、白葉枯病、細(xì)菌性褐條病是水稻生產(chǎn)中的3 種主要細(xì)菌性病害，病原菌分別為莢殼伯克霍爾德氏菌（Burkholderia glumae）、稻黃單胞菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）和燕麥?zhǔn)人峋帑渷喎N（Acidovorax avenaesubsp.avenae）。Kang 等[39]根據(jù)16S 和23S rDNA 序列及轉(zhuǎn)座酶A 基因序列構(gòu)建了這3 種細(xì)菌的檢測(cè)體系，檢測(cè)限分別為10-2~10-4的稀釋液。

2.3 植物病毒檢測(cè)

病毒作為植物病害的第三大病原，種類繁多、變異快，且大多具有潛伏侵染的特點(diǎn)，常導(dǎo)致毀滅性的病害，對(duì)植物的生長發(fā)育造成了嚴(yán)重威脅[40]，因而應(yīng)用分子技術(shù)檢測(cè)植物病毒十分必要[41-42]。由于植物病毒大多數(shù)為RNA 病毒，多用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并且仍可利用多重PCR 技術(shù)提高檢測(cè)效率。

在糧食作物病害研究領(lǐng)域，大豆是全球重要的油料作物，而病毒病嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus，SMV）、豆類普通花葉病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是大豆生長過程中為害最嚴(yán)重的3種病毒，Xue 等[43]基于病毒的外殼蛋白基因構(gòu)建了上述3 種病毒的三重PCR 檢測(cè)體系，檢測(cè)限為7×10-1ng?μL-1RNA?；ㄉ《荆≒eanut stunt virus，PSV）和番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物，可通過染病大豆進(jìn)行傳播，袁俊杰等[44]利用雙啟動(dòng)寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）建立了能同時(shí)檢測(cè)上述2 種病毒的雙重RT-PCR 檢測(cè)體系，該體系具有對(duì)45~65 ℃退火溫度不敏感的優(yōu)點(diǎn)。 Maina 等[45]基于高通量測(cè)序（highthroughput sequencing，HTS）技術(shù)開發(fā)了靶向基因組測(cè)序（targeted genome sequencing，TG-Seq），并將其應(yīng)用于谷類作物上常見的CMV、豌豆早褐病毒（Pea early browning virus，PEBV）、菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）和豌豆種傳花葉病毒（Pea seedborne mosaic virus，PSbMV）4 種病毒的檢測(cè)，TG-Seq 能檢測(cè)出凝膠電泳檢測(cè)不到的BYMV 和CMV 的擴(kuò)增子，表明TG-Seq 具有更高靈敏度。針對(duì)玉米病毒病，李明駿等[46]建立了5 種玉米病毒的多重PCR 檢測(cè)體系，可同時(shí)檢測(cè)出甘蔗花葉病毒（Sugar-cane mosaic virus，SCMV）、玉米褪綠斑駁病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV）、水稻黑條矮縮病毒（Rice black streaked dwarf virus，RBSDV）、玉米黃化花葉病毒（Maize yellow mosaic virus，MaYMV）和留尼旺玉米線條病毒（Maize streak reunion virus，MSRV）。Li等[47]建立了基于延伸因子1α（TEF1-α）基因檢測(cè)玉米上常發(fā)生的MCMV、SCMV、MaYMV以及相關(guān)的整體病毒（Maize-associated totivirus，MATV）的多重RTPCR檢測(cè)方法，靈敏度可達(dá)100 pg?μL-1DNA。

在果樹病害研究領(lǐng)域，黃愛軍等[48]基于文獻(xiàn)以及CP和p25基因成功建立了柑橘病害多重RTPCR 檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)出柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎葉病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）和柑橘葉斑病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）4 種病毒。Peng等[49]基于CP基因設(shè)計(jì)引物以分別擴(kuò)增獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒（Actinidia chlorotic ringspotassociated virus，AcCRaV）、獼猴桃病毒1（Actinidia virus 1，AcV-1）、獼猴桃病毒A（Actinidia virus A，AcVA）和CLBV，并以肌動(dòng)蛋白基因（ACT1）為內(nèi)部對(duì)照成功構(gòu)建多重RT-PCR，檢測(cè)限為10-4cDNA。

此外，多重PCR 技術(shù)還廣泛應(yīng)用于觀賞花卉和熱帶經(jīng)濟(jì)作物的病毒和類病毒研究領(lǐng)域，目前已報(bào)道的可侵染菊花的病毒和類病毒超過20 種，能夠?qū)е戮栈p產(chǎn)10%~30%。Zhao 等[50]建立菊花病害的多重RT-PCR 用以同時(shí)檢測(cè)番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、菊花B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、CMV、煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）、菊花矮化類病毒（Chrysanthemum stunt viroid，CSVd）和菊花褪綠斑駁類病毒（Chrysanthemum chlorotic mottle viroid，CChMVd），為大規(guī)模調(diào)查病毒病害提供一種可行的方法。Muller 等[51]發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)可可的基因組中整合了內(nèi)源性可可桿狀病毒（endogenous T.cacao bacilliform virus，eTcBV）的序列，對(duì)插入病毒序列的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物組，陽性結(jié)果會(huì)擴(kuò)增出2 條帶，陰性結(jié)果只有1 條帶，可以準(zhǔn)確檢測(cè)eTcBV 的存在，降低經(jīng)濟(jì)損失。

2.4 植物病原線蟲

植物寄生線蟲是常見的土傳植物病原，包括孢囊線蟲（Globoderaspp.）、根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）、莖線蟲（Ditylenchusspp.）等，它們的寄主范圍十分廣泛，可引起植物褪綠、發(fā)育不良，降低農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，部分種類可誘導(dǎo)寄主植物形成根結(jié)狀腫瘤，在世界范圍內(nèi)普遍存在。此外，線蟲通常能在土壤中長期存活，一旦發(fā)生很難根除，嚴(yán)重影響下季茬口的安全生產(chǎn)[52-53]。

馬鈴薯孢囊線蟲包括馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）和馬鈴薯白線蟲（G.pallida），是馬鈴薯生產(chǎn)的重要瓶頸，因其嚴(yán)重的破壞性被世界各國列入檢疫對(duì)象。Nikitin 等[54]基于ITS1 區(qū)域建立的微陣列實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)體系可同時(shí)檢測(cè)G. rostochiensis和G. pallida，檢測(cè)限分別達(dá)到1 和10 pg?μL-1。針對(duì)阿爾及利亞的馬鈴薯孢囊線蟲，Djebroune 等[55]應(yīng)用前人研究的常規(guī)多重PCR 和熒光實(shí)時(shí)PCR 對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以明確線蟲的地理分布情況。Gamel 等[56]基于微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)TaqMan 探針可以同時(shí)檢測(cè)G. rostochiensis、G. Pallida和Heterodera schachtii。 種植對(duì)G. rostochiensis具有抗性的馬鈴薯品種導(dǎo)致近年來各地為害馬鈴薯的其他種類線蟲檢出量增加[57]，因此，多重PCR的應(yīng)用有助于植物線蟲的綜合檢測(cè)。

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是世界上最具破壞性的植物寄生線蟲之一[58]。Hu等[59]提取根結(jié)線蟲不同生活期的蟲癭DNA，基于28S rRNA 和rDNA-IGS2 區(qū)域建立了針對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲（M.enterolobii）、南方根結(jié)線蟲（M. incognita）和爪哇根結(jié)線蟲（M. Javanica）的多重PCR 檢測(cè)體系，檢出率隨線蟲發(fā)育而增加。Devran 等[60]利用特異性引物建立的多重PCR 方法可成功檢測(cè)M. incognita、M. javanica和花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）。

莖線蟲屬（Ditylenchus）的鱗球莖線蟲（D.dipsaci）、腐爛莖線蟲（D. destructor）和D. gigas是3種寄主廣泛的線蟲。Jeszke等[61]通過對(duì)18S rRNA和rDNA-ITS1區(qū)域進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)引物，分別成功建立了三重PCR 和qPCR 快速檢測(cè)方法，qPCR 的靈敏度可達(dá)0.016 ng?rxn-1。

傘滑刃屬（Bursaphelenchus）是一類具有破壞性的嗜木線蟲。Filipiak 等[62]利用2 種通用引物和3 種特異TaqMan 探針建立了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可對(duì)松材線蟲（B. xylophilus）、擬松材線蟲（B. mucronatus）、偽傘滑刃線蟲（B. fraudulentus）進(jìn)行有效檢測(cè)，檢測(cè)限為30 fg DNA?μL-1。

擬毛刺線蟲（Paratrichodorusspp. ）俗稱粗短根線蟲（stubby root nematodes），可為害寄主植物的根系而引起病變，一些種類還可充當(dāng)植物病毒的傳播介體。Huang等[63]通過對(duì)18S rDNA 和ITS1區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)引物可同時(shí)檢測(cè)Paratrichodorus allius、較小擬毛刺線蟲（P.minor）、胼胝擬毛刺線蟲（P. porosus）和Trichodorus obtusus共4種線蟲。

此外，多重PCR 技術(shù)在植原體等病原物的檢測(cè)方面也有應(yīng)用。植原體可導(dǎo)致寄主植物代謝紊亂，表現(xiàn)黃化、簇生、矮化、小葉等癥狀，引發(fā)棗瘋病、杏褪綠等重要病害。此外，植原體可通過取食植物韌皮部的昆蟲宿主在上千種植物宿主間傳播，造成巨大的損害。由于植原體不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此采用分子檢測(cè)方法診斷該病害尤為重要[64]。Gholami 等[65]基于16-23S rRNA 基因間隔區(qū)建立了侵染馬鈴薯的3 組重要植原體16SrⅠ、16SrⅥ和16SrⅫ的多重巢式PCR。Galvao 等[66]應(yīng)用多重PCR 技術(shù)快速檢測(cè)植原體Phytoplasma和Spiroplasma，以助于掌握玉米叢矮病的流行病學(xué)。

3 多重PCR技術(shù)存在的問題及發(fā)展前景

植物病害的發(fā)生是病原、寄主、環(huán)境相互作用的結(jié)果，發(fā)病過程中往往還會(huì)受到多種生物或非生物因素的影響，因此依賴于癥狀識(shí)別、分離培養(yǎng)等的傳統(tǒng)診斷方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確率低，遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)需求。多重PCR可在同一反應(yīng)體系中對(duì)不同靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，大大提高了樣品檢測(cè)通量，可應(yīng)用于未表現(xiàn)出明顯癥狀或侵染初期的植物病原診斷。該技術(shù)的使用可擺脫傳統(tǒng)分離培養(yǎng)診斷方法的束縛，開辟了植物病原物診斷的新途徑。

多重PCR 檢測(cè)技術(shù)目前在敏感性、穩(wěn)定性、靶標(biāo)通量等方面仍存在不少問題（表1）。首先，多個(gè)引物對(duì)、模板等在同一反應(yīng)中易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，引起檢測(cè)結(jié)果假陽性或假陰性的問題；其次，mPCR 的產(chǎn)物檢測(cè)主要依賴凝膠電泳檢測(cè)手段，雖然快速便捷且成本較低，但存在明顯局限性，如其擴(kuò)增片段長度差異受瓊脂糖凝膠電泳分辨率的限制，可能影響檢測(cè)靈敏度；此外，使用凝膠電泳來觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或區(qū)分特定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小容易產(chǎn)生假定的光學(xué)誤差，增加人工成本等[67]；最后，多重PCR技術(shù)不能確定所檢測(cè)到的病原體是否具有活性和侵染性，無法推斷出有關(guān)的微生物細(xì)胞完整性信息，影響流行病學(xué)判斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，從而限制了應(yīng)用場(chǎng)景[28]。因此，多重PCR檢測(cè)技術(shù)在未來有待繼續(xù)逐步完善。

表1 多重PCR的優(yōu)缺點(diǎn)及可結(jié)合的技術(shù)Table 1 Advantages， disadvantages and the combinable technologies of multiplex PCR

多重PCR 技術(shù)與一些分子技術(shù)的結(jié)合在一定程度上彌補(bǔ)了上述不足。如多重PCR 與qPCR或dPCR 技術(shù)結(jié)合可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。qPCR 往往利用植物DNA 作為內(nèi)參評(píng)估病原的相對(duì)量，而dPCR 能直接表征檢測(cè)物的絕對(duì)量[17,68]；微流控芯片和液滴式數(shù)字PCR 技術(shù)與多重PCR 的結(jié)合可使靶標(biāo)處于不同空間進(jìn)而提高檢測(cè)準(zhǔn)確率；毛細(xì)管電泳、limunex xMAP 等檢測(cè)手段能實(shí)現(xiàn)更有效的檢測(cè)，也為多重PCR 技術(shù)結(jié)果的分析提供了更優(yōu)越的手段，具有高靈敏、高通量、高分辨的優(yōu)勢(shì)；膜層析、液相芯片等技術(shù)可很好地解決電泳條帶檢測(cè)通量小的問題[9]。

現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展也在不斷促進(jìn)和提升多重PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍和水平。新一代高通量測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)、微生物基因庫快速擴(kuò)張以及比較基因組學(xué)等方法的發(fā)展加速了新DNA 分子標(biāo)記的出現(xiàn)，提高了檢測(cè)體系的靈敏度[69]。Li 等[70]利用大量李斯特菌（Listeriaspp.）的基因組序列進(jìn)行泛基因組分析，確定了L. monocytogenes、L.ivanovii的特異性基因靶點(diǎn)和Listeriaspp.共有的基因靶點(diǎn)，據(jù)此設(shè)計(jì)引物并建立多重PCR 檢測(cè)體系，檢測(cè)限為103~104CFU?mL-1。此外，在特異性引物設(shè)計(jì)方面可選擇DNA 雜交、BLAST 比對(duì)識(shí)別等方法，并且隨著大量測(cè)序數(shù)據(jù)的獲得可針對(duì)具有種屬間差異的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)大了引物的設(shè)計(jì)選擇范圍，提高了篩選效率。因此，針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景及應(yīng)用要求，有選擇性地將多重PCR技術(shù)與qPCR、dPCR、熒光等技術(shù)相結(jié)合，能發(fā)揮更好的檢測(cè)效果，適應(yīng)更多的植物病原檢測(cè)應(yīng)用需求，及時(shí)防止植物病害集中暴發(fā)，為科學(xué)防控植物病害奠定基礎(chǔ)。