洪鑫月,張國(guó)文

(南昌大學(xué)食品科學(xué)資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO),也被稱為酪氨酸酶,廣泛存在于蔬菜、水果和許多其他生物體中[1]。如圖1A所示,多酚氧化酶通常以四聚體形式存在[2]。作為一種金屬氧化酶,其雙核銅活性中心的兩個(gè)銅離子分別與3個(gè)組氨酸配位(圖1B)[3]。PPO催化氧化酚類物質(zhì)形成黑色素:在氧分子存在下,PPO將單酚鄰羥基化,隨后將鄰二酚氧化為多巴醌,并最終形成黑色素,這個(gè)過(guò)程通常伴隨著體系顏色的加深[4]。在食品工業(yè)中,由PPO導(dǎo)致的褐變會(huì)降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,不良的顏色變化也使消費(fèi)者難以接受,使食品喪失其商業(yè)價(jià)值,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。目前,人們對(duì)典型的PPO抑制劑如對(duì)苯二酚、熊果苷和曲酸等使用的安全性仍存在一些爭(zhēng)論[6]。因此,從天然產(chǎn)物中發(fā)掘高效、安全的PPO抑制劑已成為食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

圖1 (A) 四聚體形式的多酚氧化酶;(B) 多酚氧化酶的雙核銅活性中心Fig.1 (A) PPO in the form of tetramer;(B) The binuclear copper active center of PPO

香葉木素(Diosmetin)是一種常見(jiàn)于各種柑橘類果實(shí)中的膳食黃酮,具有抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多重生物活性[7,8],其作為酶抑制劑也有較大潛力。Liu等[9]報(bào)道香葉木素以可逆競(jìng)爭(zhēng)的方式抑制黃嘌呤氧化酶的活性,抑制機(jī)制可能是香葉木素能夠與酶結(jié)合并改變酶的構(gòu)象從而降低酶的催化活性。同時(shí),許多黃酮類化合物已被證實(shí)具有PPO抑制能力。桑色素[10]和槲皮素[11]是可逆競(jìng)爭(zhēng)型的PPO抑制劑,二氫楊梅素[12]和芹菜素[13]對(duì)PPO表現(xiàn)出較強(qiáng)的混合型抑制活性,柚皮素是一種非競(jìng)爭(zhēng)型PPO抑制劑[14]。Si等[15]運(yùn)用分子模擬發(fā)現(xiàn)橙皮素可以螯合活性中心的銅離子并推測(cè)這可能是其具有抑制活性的原因之一。Jeong等[16]報(bào)道黃芩苷可能通過(guò)控制細(xì)胞中酪氨酸酶的含量從而抑制黑色素的合成。然而,有關(guān)香葉木素對(duì)PPO的抑制效果及抑制機(jī)制的研究卻十分有限。因此,本文運(yùn)用多種光譜學(xué)方法聯(lián)合計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),系統(tǒng)研究了香葉木素對(duì)PPO的抑制作用及機(jī)制,以期為香葉木素作為新型PPO抑制劑的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2450型,島津公司,日本);熒光分光光度計(jì)(F-7000型,日立公司,日本);圓二光譜儀(MOS-450型,Bio-Logic公司,法國(guó));電子天平(BSA224S型,Sartorius公司,德國(guó));酸度計(jì)(pHS-3C型,雷磁公司,上海);恒溫水浴鍋(HH-6型,上海騰林)。

PPO(EC 1.14.18.1,128 kDa,Worthington公司,美國(guó));香葉木素(純度≥98%)和左旋多巴(純度≥98%)均購(gòu)自阿拉丁生化科技有限公司(中國(guó)上海);曲酸(純度≥99%)購(gòu)自?shī)W德福尼生物技術(shù)有限公司(中國(guó)南京)。用DMSO配制香葉木素溶液(40.0 mmol·L-1);PPO儲(chǔ)備液(20.0 μmol·L-1)和左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)用PBS(50.0 mmol·L-1,pH 6.8)配制,底物現(xiàn)用現(xiàn)配。其他藥品試劑的純度均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香葉木素對(duì)PPO的抑制活性測(cè)定

采用Li等[17]的方法,對(duì)香葉木素的抑制能力進(jìn)行測(cè)定。在總體積為2 mL的PBS(50.0 mmol·L-1,pH 6.8)反應(yīng)體系中,分別加入20 μL PPO儲(chǔ)備液(20.0 μmol·L-1)和不同體積(2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 μL)的香葉木素(40.0 mmol·L-1),置于30℃水浴中孵化1 h。隨后加入200 μL左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開(kāi)啟反應(yīng)。使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中的時(shí)間-動(dòng)力學(xué)程序,每5 s測(cè)定一次475 nm處的吸光度,測(cè)定41次,共200 s。使用相對(duì)酶活來(lái)表示樣品的抑制能力。不加抑制劑時(shí)PPO的活性定義為100%。陽(yáng)性對(duì)照為曲酸。

相對(duì)酶活性(100%)=(K1/K0)×100%

(1)

K0和K1分別表示未加入和加入抑制劑后反應(yīng)體系的吸光度隨時(shí)間變化的斜率。

1.2.2 香葉木素對(duì)PPO的抑制動(dòng)力學(xué)

抑制可逆性的測(cè)定:在不同濃度(0、200、400、700 μmol·L-1)的香葉木素存在下,加入不同體積(10、15、20、25、30 μL)的PPO儲(chǔ)備液(20.0 μmol·L-1),于30 ℃水浴中孵化1 h后加入200 μL左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開(kāi)啟反應(yīng)。吸光度的測(cè)定同1.2.1。以酶促反應(yīng)速率(v=ΔOD/min)對(duì)酶濃度作圖,根據(jù)曲線特性判定香葉木素的抑制可逆性。

抑制類型的判斷:在不同濃度(0、200、400、700 μmol·L-1)的香葉木素存在下,加入20 μL的PPO溶液(20.0 μmol·L-1),于30 ℃水浴中孵化1 h后加入不同體積(100、150、200、250、300 μL)的左旋多巴溶液(5.0 mmol·L-1)開(kāi)啟反應(yīng)。吸光度的測(cè)定同1.2.1。以酶促反應(yīng)速率(v=ΔOD/min)對(duì)底物濃度作圖并結(jié)合Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程對(duì)香葉木素的抑制類型進(jìn)行判斷。

1.2.3 熒光光譜法

熒光猝滅實(shí)驗(yàn):不同溫度(298、301、310 K)下,在2 mL PPO溶液(2.0 μmol·L-1)中,逐次加入5 μL的香葉木素(1.0 mmol·L-1),共10次。每次加入香葉木素,溶液需混勻并靜置3 min,然后掃描290～500 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,狹縫寬度2.5 nm。

同步熒光實(shí)驗(yàn):將激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)始終保持在15 nm(60 nm)的差值條件下,掃描酪氨酸(或色氨酸)的同步熒光光譜,分析香葉木素的加入對(duì)PPO中這兩種氨基酸殘基的影響。在298 K,發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm,其他實(shí)驗(yàn)條件同熒光猝滅實(shí)驗(yàn)。

三維熒光實(shí)驗(yàn):在2 mL實(shí)驗(yàn)體系中,PPO和香葉木素濃度分別為2.0 μmol·L-1和15.0 μmol·L-1,分別掃描PPO和香葉木素-PPO體系的三維熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描范圍均為200～600 nm,步長(zhǎng)為5 nm。Matlab軟件繪制三維熒光圖。

香葉木素的紫外吸收可能會(huì)產(chǎn)生“內(nèi)濾光效應(yīng)”,因此,實(shí)驗(yàn)測(cè)得的熒光數(shù)據(jù)用下式進(jìn)行校正[18]:

(2)

FM和FC分別是熒光的測(cè)量值和校正值。A1和A2分別是香葉木素在280和340 nm處的紫外吸收值。

1.2.4 CD光譜法

掃描不同反應(yīng)體系(c香葉木素:c多酚氧化酶=0：1、1：1和4：1)的CD光譜,掃描范圍設(shè)置為190～250 nm。CD光譜儀在室溫下運(yùn)行,氮?dú)饬鞅３衷? MPa左右。掃描光譜時(shí)應(yīng)扣除背景吸收(PBS,50.0 mmol·L-1,pH 6.8)。利用SELCON3程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行處理后獲得多酚氧化酶各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.5 分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬

應(yīng)用分子對(duì)接軟件(Discovery Studio 2016 v16.1.0)預(yù)測(cè)香葉木素與PPO的結(jié)合位點(diǎn)。PPO(PDB ID:2Y9X)的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),香葉木素的3D結(jié)構(gòu)(Compound CID:5281612)來(lái)自PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)。PPO進(jìn)行預(yù)處理(去水,加氫,加極性)后被定義為受體,與配體香葉木素進(jìn)行100次的分子對(duì)接模擬。選取最優(yōu)構(gòu)象(最低的CDOCKER結(jié)合能和最低的CDOCKER相互作用能量)進(jìn)行結(jié)果分析[19]。

使用GROMACS 5.1軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,采用Acpype Server程序?qū)ο闳~木素的拓?fù)湮募M(jìn)行預(yù)處理。香葉木素與PPO分別使用AMBER和AMBER99SB-ILDN protein力場(chǎng)。加入Na+和Cl-中和電荷后進(jìn)行能量最小化操作,隨后在300 K溫度下分別進(jìn)行100 ps的NVT和NPT平衡。分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)間為150 ns[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 香葉木素對(duì)PPO的抑制作用分析

圖2A顯示香葉木素和曲酸均具有PPO抑制能力,隨著體系內(nèi)二者濃度的增加,PPO的相對(duì)酶活性不斷下降。香葉木素的濃度從50.0 μmol·L-1增加至1 000.0 μmol·L-1時(shí),PPO的相對(duì)活性從85.24%降至21.5%,而50.0 μmol·L-1的曲酸使PPO的活性降低至27.50%。香葉木素和曲酸的IC50值分別為(302.9±1.82) μmol·L-1和(15.0±0.24) μmol·L-1,盡管香葉木素對(duì)PPO的抑制活性要弱于經(jīng)典抑制劑曲酸,但也顯示出較好的PPO抑制能力。

圖2B顯示,在不同濃度的香葉木素體系中,PPO濃度與酶促反應(yīng)速率的擬合直線都經(jīng)過(guò)原點(diǎn),且香葉木素濃度增大,擬合直線斜率下降。以上結(jié)果表明香葉木素可逆地抑制PPO的催化活性,而不是使酶完全失活[21]。

利用雙倒數(shù)曲線判斷香葉木素對(duì)PPO的抑制類型。圖3A中四條擬合直線均有良好的線性關(guān)系且相交于第二象限。香葉木素濃度增加,Km值增加而Vmax值減小。由此判斷香葉木素為PPO的混合型抑制劑。下列公式通常用以描述混合型抑制[22]:

(3)

(4)

(5)

計(jì)算得到抑制常數(shù)Ki為327.9±2.46 μmol·L-1,表觀系數(shù)α為2.78,α>1意味著香葉木素與單獨(dú)PPO的結(jié)合親和力強(qiáng)于香葉木素與PPO-底物復(fù)合物的結(jié)合,即香葉木素更傾向于與游離酶結(jié)合[3,12]。圖3B和C中斜率和截距分別對(duì)香葉木素濃度作圖,曲線均顯示出良好的線性關(guān)系,表明香葉木素在PPO上只有一個(gè)或一類抑制位點(diǎn)。

[Diosmetin]/(μmol·L-1) [PPO]/(μmol·L-1)

1/[L-DOPA/(μmol·L-1)] [Diosmetin]/(μmol·L-1) [Diosmetin]/(μmol·L-1)c(PPO)=0.2 μmol·L-1;c(diosmetin)=0、200、400、700 μmol·L-1 for curves a→d。

2.2 香葉木素對(duì)PPO熒光光譜的影響

2.2.1 熒光猝滅機(jī)制分析

當(dāng)λex=280 nm時(shí),由于PPO含有色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳香族氨基酸,其在340 nm處有一個(gè)特征熒光發(fā)射峰。圖4A中香葉木素的加入令酶的熒光強(qiáng)度從570.2下降至323.1,這意味著香葉木素能夠通過(guò)影響PPO中的Trp和Tyr殘基而猝滅PPO內(nèi)源熒光。

香葉木素對(duì)PPO的猝滅方式可利用Stern-Volmer方程[23]進(jìn)行描述:

(5)

F0、F分別表示PPO和PPO-香葉木素體系的熒光強(qiáng)度,[Q]為香葉木素濃度。計(jì)算得到的熒光猝滅常數(shù)Ksv和生物分子猝滅常數(shù)Kq均列與表1中。在未添加猝滅劑時(shí),熒光團(tuán)平均壽命τ0約為10-8s[11]。

圖4B所示,不同溫度下F0/F對(duì)[Q]作圖,三條擬合直線都表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。溫度升高,Ksv值增大,但Kq值遠(yuǎn)大于2.0 1010L·mol-1·s-1,表明香葉木素對(duì)PPO的猝滅方式為單一的靜態(tài)猝滅[24]。

aR為Ksv的相關(guān)系數(shù),bR為Ka的相關(guān)系數(shù)。

λ/nm >[Diosmetin]/(μmol·L-1)

2.2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

用下列方程求得不同溫度下香葉木素與PPO的結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[10]:

(6)

[Qt]和[Pt]分別是香葉木素和PPO的濃度。在實(shí)驗(yàn)溫度(298、304和310 K)下,Ka值分別為1.20×104、1.80×104和2.28×104L·mol-1(表1),即香葉木素和PPO顯示出中等強(qiáng)度的結(jié)合親和力。溫度升高,Ka值增加,意味著PPO-香葉木素復(fù)合物的形成與溫度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)溫度下的n值均接近1,表明PPO中僅存在一個(gè)或一類香葉木素的結(jié)合位點(diǎn),這些結(jié)果與酶促動(dòng)力學(xué)結(jié)論一致。

2.2.3 熱力學(xué)分析

通過(guò)van’t Hoff方程[3]計(jì)算香葉木素與PPO結(jié)合過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)值,并列于表1:

(7)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(8)

R是氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)。吉布斯自由能(ΔG°)為負(fù)值,表明香葉木素與PPO是自發(fā)結(jié)合;熵變(ΔS°)和焓變(ΔH°)均為正值,表示疏水相互作用是二者結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力[25]。

2.3 香葉木素對(duì)PPO結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜是檢測(cè)PPO中Tyr和Trp殘基微環(huán)境變化的常用手段。向PPO溶液中不斷加入香葉木素,Tyr和Trp殘基的熒光強(qiáng)度分別從108.8降至70.26,和435.4減少到233.2,二者的特征峰無(wú)顯著改變,表明香葉木素對(duì)這兩種氨基酸殘基微環(huán)境的極性和疏水性基本沒(méi)有影響(圖5A和B)[18]。圖5C所示,Trp殘基的同步熒光猝滅比率(RSFQ=1-F/F0)高于Tyr殘基,表明在香葉木素猝滅PPO時(shí)Trp殘基的貢獻(xiàn)更大。

2.3.2 三維熒光光譜分析

通過(guò)三維熒光光譜分析了PPO與香葉木素相互作用引起的構(gòu)象變化。圖6A是PPO的三維熒光光譜。峰a(λex=λem)是瑞利散射峰,峰b(2λex=λem)是二階散射峰。峰1(λex=280 nm,λem=340 nm)為T(mén)yr和Trp殘基的特征峰,峰2(λex=230 nm,λem=340 nm)主要反映多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的熒光特征吸收峰。表2中,香葉木素的加入使得峰1的熒光強(qiáng)度下降28.87%,但不改變其峰位置,表明香葉木素幾乎不影響Tyr和Trp殘基的微環(huán)境,這與同步熒光結(jié)果一致。峰2的熒光強(qiáng)度降低了66.60%,且其峰位也發(fā)生變化,意味著香葉木素與PPO的相互作用影響了酶的結(jié)構(gòu)[22]。

λ/nm λ/nm [Diosmetin]/(μmol·L-1)(A) Δλ=15 nm (B) Δλ=60 nm (C) 同步熒光猝滅百分比(RSFQ)

c(PPO)=2.0 μmol·L-1,c(diosmetin)=15.0 μmol·L-1。

表2 PPO和PPO-香葉木素體系的三維熒光光譜特征峰Tab.2 haracteristic peaks in 3D fluorescence spectra of PPO and PPO-diosmetin systems

2.3.3 圓二色譜分析

CD光譜對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化非常敏感,是檢測(cè)香葉木素對(duì)PPO構(gòu)象影響的有力手段。210和220 nm處的兩個(gè)負(fù)峰被認(rèn)為是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[18]。當(dāng)香葉木素與PPO的濃度比增加時(shí)(0：1→1：1→4：1),圖7A中負(fù)峰強(qiáng)度增強(qiáng)峰形改變暗示著香葉木素與PPO的相互作用影響了酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。PPO的α-螺旋含量增加(32.81%→36.00%→42.38%),β-折疊(19.11%→18.10%→13.82%)和無(wú)規(guī)則卷曲(27.28%→26.50%→23.78%)含量降低(圖7B),表明香葉木素可能誘導(dǎo)PPO的結(jié)構(gòu)部分緊縮,使底物更難進(jìn)入活性中心,從而降低了PPO的催化活性。

λ/nm The molar ratio of [diosmetin]vs.[PPO]

2.4 香葉木素與PPO的結(jié)合模式

2.4.1 分子對(duì)接

分子對(duì)接可以直觀地觀察香葉木素與PPO的結(jié)合,通過(guò)分析二者結(jié)合的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象得到結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式和作用力類型等信息。結(jié)果顯示,香葉木素插入PPO的疏水空腔(圖8A),結(jié)合在酶的雙核銅活性中心附近(圖8B),并與周圍的氨基酸殘基His244、Asn260、His85、Val248、Phe264、Val283及His263等發(fā)生疏水相互作用(圖8C),且香葉木素的A環(huán)C-7位OH還能與Met280形成一個(gè)氫鍵,結(jié)合距離為4.82 ?。另外兩個(gè)氫鍵在香葉木素C環(huán)的羰基與His85和His259之間形成,結(jié)合距離

圖8 (A)香葉木素結(jié)合于PPO的疏水空腔(藍(lán)色和橙色分別代表酶的親水和疏水部分);(B)香葉木素與PPO的最佳結(jié)合構(gòu)象;(C)香葉木素與PPO結(jié)合的2D圖Fig.8 Diosmetin binds in the hydrophobic cavity of PPO.Blue and orange represent the hydrophilic and hydrophobic parts of the enzyme surface,respectively;(B) Optimal binding conformation of diosmetin and PPO;(C) 2D image of diosmetin binding to PPO

分別為4.39 ?和5.64 ?。香葉木素還能與His244、Asn260、Glu256、Phe90、His61、Phe292、Phe264、Gly281及Ser282等通過(guò)范德華力發(fā)生相互作用。此外,香葉木素的A環(huán)與氨基酸殘基Val283和Ala286,B環(huán)與殘基Val248以及C環(huán)與殘基Val283之間均存在π-烷基鍵,其A環(huán)還與His263形成酰胺-π堆積(圖8C)。因此,氫鍵、疏水相互作用和范德華力在香葉木素與PPO的結(jié)合過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。由此推斷,香葉木素結(jié)合于酶的疏水空腔,與酶活性中心周圍的氨基酸相互作用,誘導(dǎo)酶的構(gòu)象發(fā)生改變,阻礙底物進(jìn)入酶的活性中心,因而降低PPO的催化活性[3]。

2.4.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬直觀展示了PPO及PPO-香葉木素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。均方根偏差(RMSD)可以用來(lái)評(píng)估體系的穩(wěn)定性,其值波動(dòng)越小體系越穩(wěn)定[26]。圖9A顯示PPO-香葉木素復(fù)合物的RMSD值波動(dòng)較大,其值最終穩(wěn)定在約0.25 nm處,整體上略高于單獨(dú)酶體系,這表示復(fù)合體系更不穩(wěn)定。均方根波動(dòng)(RMSF)有助于了解結(jié)合過(guò)程中蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象變化,其值越高表示氨基酸殘基的靈活性越好[27]。圖9B中氨基酸殘基65～75,180～185,245～253,320～330,354～360的RMSF值波動(dòng)較大,表明這些殘基積極參與了香葉木素與PPO的結(jié)合過(guò)程,并通過(guò)調(diào)整自身構(gòu)象來(lái)形成PPO-香葉木素復(fù)合物。回旋半徑(Rg)的值與酶的結(jié)構(gòu)致密性呈負(fù)相關(guān)[28]。圖9C顯示,PPO-香葉木素復(fù)合物的Rg值在前20 ns內(nèi)高于PPO,表明這t/ns Residues

t/nst/ns

Tyr Trp

段時(shí)間內(nèi)PPO的結(jié)構(gòu)伸展以容納香葉木素。在20 ns后,復(fù)合物的Rg值整體上低于PPO表明酶與香葉木素的結(jié)合令酶的結(jié)構(gòu)更加緊密,與圓二結(jié)果具有一致性。溶劑可及表面積(SASA)反映了體系與溶劑接觸表面積的變化,其值增大酶的疏水性降低[29]。圖9D中PPO-香葉木素復(fù)合物的SASA值整體上低于PPO,表明PPO與香葉木素結(jié)合后親水性降低疏水性增加,香葉木素誘導(dǎo)了酶結(jié)構(gòu)緊縮。圖9E和F中Tyr和Trp殘基的SASA值整體上沒(méi)有顯著改變,說(shuō)明與香葉木素結(jié)合對(duì)PPO中Tyr和Trp殘基的極性和疏水性的影響不明顯,分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證了同步熒光的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié)論

香葉木素可逆混合地抑制PPO的催化活性,并能以靜態(tài)方式猝滅PPO的內(nèi)源熒光,疏水相互作用是穩(wěn)定PPO-香葉木素復(fù)合物結(jié)構(gòu)的主要作用力,兩者之間只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。香葉木素進(jìn)入PPO的疏水空腔,結(jié)合在PPO的雙核銅活性中心附近,并與其周圍的氨基酸殘基主要通過(guò)氫鍵、疏水作用力和范德華力相互作用,使得PPO的穩(wěn)定性和親水性下降,結(jié)構(gòu)的致密性增加。香葉木素抑制PPO活性的機(jī)制可能主要是由于該黃酮化合物結(jié)合在PPO活性中心附近,與其周圍的一些氨基酸殘基相互作用,占據(jù)了底物進(jìn)入酶活性中心的通道,誘導(dǎo)了PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,阻止了底物被酶催化,從而降低了PPO的活性。研究結(jié)果為香葉木素作為新型PPO抑制劑應(yīng)用于食品工業(yè)提供科學(xué)依據(jù)。