苗昆,劉艷,王杰,隗鑫曈,顏培正,張秀云,趙東升

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院,山東 濟南,250355)

大蒜(AlliumsativumL.)別名胡蒜、蒜頭、葫等,屬百合科,是世界上最常食用的蔥屬蔬菜之一,同時也是一種良藥,多用于保健品、膳食補充劑和食物[1]。2020版中國藥典記載大蒜歸脾、胃、肺經(jīng),能夠解毒消腫、殺蟲、止痢,可用于癰腫瘡瘍、疥癬、肺癆、頓咳、泄瀉、痢疾[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明,大蒜具有廣泛的生物活性,能夠預防和治療多種疾病,改善身體機能。大蒜化學成分豐富,主要包括多糖、揮發(fā)油、氨基酸、凝集素、皂苷類化合物、黃酮類化合物等[3]。大蒜多糖(garlic polysaccharide,GPS)是大蒜的主要活性成分之一(約占鮮重的26%～30%),顯現(xiàn)出多種生物活性和健康益處,例如護肝、抗癌、益生、抗氧化、抗凝血及免疫調節(jié)作用等?；趯嶒炘弦约皩嶒灧椒ǖ牟町?學者所獲得的大蒜多糖結構特征及生物活性存在一定差異。因此,通過查閱國內外相關文獻,對大蒜多糖的結構特征、生物活性進行總結概括,并進一步闡明大蒜多糖結構與生物活性之間的聯(lián)系,以期為大蒜多糖深入研究及開發(fā)提供理論支撐。

1 大蒜多糖的結構特征

多糖是大蒜鱗莖中一類極為重要的生物活性物質,其結構多樣且測定受多種因素影響,包括大蒜種類、提取工藝、檢測方法等,因而結構分析的研究難度較大。當前,大蒜多糖的結構特征的研究主要集中在平均分子質量、單糖組成、糖鏈構型等方面(表1)。大蒜多糖平均分子質量的測定常用的儀器分析方法包括高效凝膠過濾色譜法(high performance gel filtration chromatography,HPGPC)、高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC);單糖組成的測定方法包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、離子色譜法(ion chromatography,IC)、薄板層析法(thin layer chromatography,TLC)、氣相色譜法(gas chromatography,GC);紅外光譜(infrared spectroscopy,IR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)則主要對多糖主鏈構型、糖鏈分支的結構進行分析。

表1 大蒜多糖結構信息Table 1 Structure information of garlic polysaccharide

1.1 平均分子質量

大蒜多糖的平均分子質量范圍比較寬廣,目前,從大蒜中分離得到多糖分子質量分布范圍為1 000～10 000 Da。在大蒜多糖平均分子質量的測定中,大蒜的種類、提取純化方法、測定方法的不同對大蒜多糖平均分子質量的測定結果都有影響。從金鄉(xiāng)大蒜中分離得到中性多糖,采用HPGPC法測定其平均分子質量為6.57×103Da[4]。從山東大蒜中分離得到一種雜多糖,純化后,采用 HPLC 法測定其分子質量為7.1×103Da[5]。通過三相分配-梯度乙醇沉淀法從生大蒜鱗莖(蒼山大蒜)中提取和分離出4種果聚糖(GPS35、GPS50、GPS65、GPS80),采用HPSEC法測定4種多糖的平均分子質量分別為10.62×103、9.52×103、9.48×103、8.93×103Da[7]。從白蒜中分離得到果聚糖,采用HPGPC法測定出其平均分子質量為4.54×103Da[9]。

1.2 單糖組成

大蒜多糖的單糖組成種類豐富,但主要由果糖組成,同時還含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等。研究人員得出結果的差異可能是由于大蒜品種或實驗方法不同引起的。此外,在高溫和酸性條件下,果糖容易脫水和氧化為其他產(chǎn)品,如葡萄糖或5-羥甲基糠醛,可能導致測量值與實際值之間存在差異。從大蒜中分離出多糖組分,采用IC-脈沖積分安培檢測法分析其單糖組成,結果表明該多糖主要由果糖及葡萄糖組成,還含有少量的阿拉伯糖、半乳糖、木糖[11]。1個中性多糖從金鄉(xiāng)大蒜中分離得到[4],采用HPLC法分析表明中性多糖由果糖和葡萄糖組成,摩爾比為4：1。從山東大蒜分離得到雜多糖[5],采用TLC、GC對其單糖成分進行分析,結果表明,該雜多糖單糖組成主要為果糖,還含有一定量的葡萄糖及少量半乳糖,摩爾比為85：14：1。從新鮮大蒜中提取出鮮蒜多糖(fresh garlic polysaccharide,FGPS)[8],其水解產(chǎn)物經(jīng)TLC分析,發(fā)現(xiàn) FGPS由果糖、半乳糖、半乳糖醛酸組成,摩爾比為307：25：32。

1.3 化學結構

多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的,其糖鏈構型是確定一級結構的重要依據(jù),同時與多糖的生物活性有著緊密聯(lián)系。目前測定多糖糖殘基組成和糖苷鍵連接位點的方法主要為甲基化-GC-MS測定法,糖環(huán)形式及糖苷鍵連接方式主要由IR、NMR測定。從金鄉(xiāng)大蒜中分離得到小分子水溶性大蒜多糖(water-soluble garlic polysaccharide,WSGP),結合IR、甲基化和GC-MS分析以及NMR分析表明,WSGP主要含有β-D-Fruf-2,1和a-D-Glcp-1兩種單糖殘基,同時存在a-D-Glcp-1→2-β-D-Fruf-1→和2-β-D-Fruf-1→2-β-D-Fruf-1→2種鍵連方式,以β型糖苷鍵為主[15]。從陳化大蒜中分離出兩類不同分子質量的果聚糖HF(分子質量>3.5 kDa)、LF(分子質量<3 kDa)[16],通過NMR檢測確定了純化HF和LF的結構。2種多糖均含有(2→1)-β-D-Fruf糖殘基,非還原末端與葡萄糖相連,且在主鏈上存在β-D-Fruf分支,HF結構見圖1。CHEN等[9]以白蒜為原料提取出果聚糖GF,采用IR和NMR測定了GF的化學結構。結果表明GF屬于新蔗果三糖類果聚糖,其主鏈由(2→1)-β-Fruf組成,非還原末端與(2→1)-a-D-Glcp相連,存在(2→6)-β-D-Fruf支鏈,這與BAUMGARTNER等[17]研究結果(圖1)相似,但二者所得果聚糖聚合度存在差異,分別為28、58。

a-大蒜果聚糖HF結構;b-大蒜果聚糖GF結構圖1 大蒜多糖存在的結構[16-17]Fig.1 The structure of the presence of garlic polysaccharide

1.4 其他

除果聚雜多糖外,研究人員還發(fā)現(xiàn)了大蒜多糖的其他結構。如從湖北恩施大蒜樣品中提取純化出一種含硒多糖[21],通過紙層析法分析出該多糖為與硒有鍵合狀態(tài)的甘露聚糖,HPLC測得平均分子質量為15 kDa,與上述相關的研究結果存在很大差異,這表明生長環(huán)境會對大蒜中多糖的成分及含量產(chǎn)生巨大影響。

2 大蒜多糖的生物活性

2.1 抗氧化作用

2.2 免疫調節(jié)作用

機體免疫系統(tǒng)是由一系列免疫器官、免疫細胞、免疫因子組成,它們在功能上相互協(xié)調,共同維持機體內環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡,一旦其生長或功能表達受到抑制就會導致免疫力低下,誘發(fā)各種健康問題。大蒜多糖能夠激活免疫細胞(巨噬細胞、淋巴細胞)增殖分化,促進免疫器官的生長,刺激相關免疫因子的分泌,包括白細胞介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon,IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)[33],提高血清中免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)水平及巨噬細胞生成NO的能力[34],對機體的固有性免疫和適應性免疫均有促進作用。此外,硒化修飾可進一步增強大蒜多糖的免疫調節(jié)活性[35],具有開發(fā)成為新型免疫增強劑的潛力。大蒜多糖的免疫調節(jié)作用見表3。

表3 大蒜多糖的免疫調節(jié)作用Table 3 Immunomodulatory effect of garlic polysaccharide

2.3 保肝作用

肝臟是機體諸多代謝反應發(fā)生的關鍵器官,多種因素都有可能導致其損傷,如酒精、藥物濫用、病毒感染、生物和化學制劑以及相應的肝細胞自身免疫攻擊[39]。近年來,由于常規(guī)藥物的局限性(誘發(fā)低鉀血癥、高血壓),學者們對于護肝藥物的研究方向逐漸轉為安全、毒性低的植物多糖。大蒜多糖作為一種常見易得的植物多糖,具有一定開發(fā)價值。

研究表明[40]大蒜多糖可抑制酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis,ALF)小鼠肝臟脂質過氧化反應,降低其轉化生長因子β蛋白(transforming growth factor beta,TGF-β)和TNF-a的表達水平,抑制細胞外基質活化,減少肝星狀細胞的生成,提高了肝臟各項指數(shù)。此外,多糖灌胃后,ALF小鼠腸道中乳酸桿菌數(shù)量增加,細菌總數(shù)和厚壁菌數(shù)減少,腸道菌群失調現(xiàn)象得到緩解,這種正向的調節(jié)可以作用于“腸—肝”軸改善肝臟損傷。劉超群等[41]從抗氧化角度探討了大蒜多糖對小鼠酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的影響。ALD導致小鼠機體內的氧化-抗氧化反應失衡,產(chǎn)生了氧化應激的現(xiàn)象,而大蒜多糖的引入能夠增強SOD、GSH-Px活性,提高肝臟系統(tǒng)的抗氧化能力,降低氧化應激對肝臟的損壞。

除酒精性肝損傷外,大蒜多糖對伴刀豆蛋白(ConA)、四氯化碳(CCl4)所致肝損傷同樣有著一定的保護作用。程富勝等[42]研究表明,大蒜多糖可提高肝損傷小鼠肝組織中SOD活性以及GSH含量,降低了丙二醛的含量,以高劑量組(400 mg/kg)效果最好,可顯著緩解ConA所致的免疫性肝損傷,促使SOD的活力和丙二醛的含量恢復至正常水平,其機制與穩(wěn)定細胞膜結構、抑制肝臟脂質過氧化有關。通過大蒜多糖對CCl4導致的小鼠肝損傷保護作用的組織學觀察發(fā)現(xiàn)[43],引入多糖后,小鼠肝臟病變癥狀明顯減輕,包括中央靜脈瘀血現(xiàn)象消失,水泡、變性顆粒數(shù)目減少,肝細胞索排列逐漸清晰,表現(xiàn)出良好的治療效果。綜合上述研究,大蒜多糖對多種原因所致的肝損傷均有保護作用,該功能的實現(xiàn)與大蒜多糖的抗氧化活性、益生作用聯(lián)系密切,腸道菌群作為治療肝損傷的新靶點有著進一步研究的價值[44]。

2.4 抗炎作用

炎癥是機體對于外界刺激引發(fā)的一種防御應激反應,是免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能的重要體現(xiàn)。疾病的產(chǎn)生往往伴隨著炎癥,通常情況下,炎癥能夠促進免疫因子的表達,誘導病變細胞的凋亡。然而,當炎癥反應過強,就會對自身組織攻擊,對機體造成嚴重的危害[45]。大蒜多糖具有免疫調節(jié)的藥理功能,能夠緩解免疫失調而引發(fā)的多種炎癥損傷。SHAO等[46]從金鄉(xiāng)大蒜中提取出WSGP,評價其在小鼠模型中改善葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的結腸炎的效果。結果表明,WSGP 通過抑制結腸炎小鼠結腸NF-kB和STAT3信號通路中p65、IkB-a和STAT3蛋白的磷酸化進而抑制炎癥因子(IL-6、IL-1b、TNF-a)的表達。此外,WSGP還可以通過改善粘膜屏障、調節(jié)腸道微生物群來緩解由DSS誘導的結腸炎。朱薿等[47]研究發(fā)現(xiàn)大蒜多糖可顯著抑制呼吸道合胞病毒誘導的IL-6和IL-8分泌增多的炎癥反應,顯現(xiàn)出了抗炎的功效。黑蒜多糖同樣具有抗炎活性[48],其對脂多糖誘導的小鼠單核巨噬白血病細胞多種炎性因子的釋放均有抑制作用,但效果弱于含硫量高的黑蒜水提物,含硫基團的引入可能對多糖成分的抗炎活性有促進作用。當前,大蒜多糖抗炎活性的研究集中于多糖單體化合物,其化學修飾產(chǎn)物相關報道較少,有必要進一步對其挖掘。

2.5 益生作用

多糖益生效應的關鍵在于其與腸道菌群的相互作用。大蒜多糖不易被小腸消化吸收,但能進入大腸刺激機體腸道多種有益菌屬的選擇性生長(益生元效應),使其成為腸道中的優(yōu)勢菌群,進而抑制致病菌,病原菌等菌群的增殖,發(fā)揮正常腸道菌群的腸道屏障作用。同時,腸道菌群可對多糖分子進行酵解和利用,促進短鏈脂肪酸的生成,進一步改善腸道環(huán)境,維護機體健康[49-50]。張浩琪等[51]分析了大蒜多糖對小鼠腸道菌群的影響,發(fā)現(xiàn)多糖引入后,小鼠腸道菌落多樣性增加,菌群豐度增加,其中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量明顯增多,腸桿菌和真桿菌數(shù)量減少,初步證實了大蒜多糖具有益生元作用。文獻表明大蒜多糖能夠緩解幼年大鼠菌群失調而引發(fā)的腹瀉癥狀,其作用機制與調節(jié)大鼠菌群豐度,促進菌群功能有關[52]。實驗結果顯示,大蒜多糖灌胃后,大鼠腸道擬桿菌門、乳桿菌屬豐度增加,厚壁菌門與變形菌門豐度降低。擬桿菌門和乳桿菌屬可酵解多糖,產(chǎn)生丙酸、丁酸和乳酸等有機酸,抑制腸道腐敗的作用,凈化腸道環(huán)境,平衡腸道微生態(tài),從而改善腹瀉癥狀。

大蒜多糖的益生活性與其分子質量及聚合度聯(lián)系密切,研究表明以不同分子質量聚糖為碳源對長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌進行培養(yǎng),通過對培養(yǎng)液 pH 和光密度的測定發(fā)現(xiàn),分子質量為300～1 000 Da 的大蒜多糖對益生菌的增殖作用最佳[53]。LU等[4]對大蒜多糖進行酸水解,得到低聚多糖,比較二者的益生元效果發(fā)現(xiàn),低聚多糖對人類胃內酸性條件的抵抗力更強,在乳酸桿菌的培養(yǎng)過程中有著更好的益生效應,可作為功能性食品和營養(yǎng)食品的成分。不同分子質量的大蒜多糖對腸道菌群的影響存在差異,明晰這些差異對益生作用的影響,對于大蒜多糖相關藥理活性的改善或許有著一定幫助。

2.6 抗腫瘤、輔助抗腫瘤

大蒜多糖能夠抑制腫瘤細胞生長,誘導癌變細胞的凋亡,具有抗腫瘤的功能。TSUKAMOTO等[54]從大蒜鱗莖中提取純化出分子質量為1 800 Da的新型多糖,研究發(fā)現(xiàn)這種新型多糖在體外對人體惡性淋巴瘤細胞和人結腸癌細胞具有細胞毒活性,能顯著抑制小鼠體內結腸腺癌細胞的生長。LI等[55]通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)大蒜多糖可抑制人體肝癌HepG2細胞的生長,呈時間及濃度依賴性。高濃度(1.0 mg/mL)的大蒜多糖作用48 h對 HepG2細胞的生長抑制率為26.18%,抑制作用主要集中于HepG2細胞生長分裂的G2期。進一步研究證實,除單獨使用外,大蒜多糖還可與順鉑聯(lián)合使用,通過觀察其對人體肝癌HepG2細胞生長的影響,發(fā)現(xiàn)大蒜多糖能夠增強順鉑對于HepG2細胞的選擇性毒性作用,提高促凋亡蛋白Bax活性,加速HepG2細胞的凋亡,降低化療藥物的劑量,表現(xiàn)出了良好的協(xié)同抗癌作用[5]。目前大蒜多糖抗腫瘤機制的研究甚少,因而實現(xiàn)臨床抗癌藥物的轉化較為困難,輔助腫瘤治療的功能性食品或許是其今后的研究方向。

2.7 其他生物活性

除了上述功能外,大蒜多糖還具有改善X射線輻射損傷[56]、緩解疲勞[57]、防治便秘[58]、降低血糖[59]、抑菌[60]、抗凝血[61]等多種生物活性(表4)。作為源于天然產(chǎn)物的活性成分,大蒜多糖在保健食品、藥品上具有良好的開發(fā)價值。

表4 大蒜多糖其他生物活性Table 4 Other biological activities of garlic polysaccharide

3 大蒜多糖的構效關系

結構特征與多糖的生物活性存在緊密的聯(lián)系,通過對大蒜多糖的構效關系進行總結以期促進大蒜多糖在食品及其他領域中的應用。

3.1 大蒜多糖分子質量與其生物活性的關系

分子質量能夠影響大蒜多糖物理化學性質,如溶解度和黏度,從而影響多糖在體內的吸收。一般而言,過高或過低的分子質量都會降低多糖的生物活性。高分子質量將阻礙細胞對多糖分子的攝取與利用[62]。相反,當分子質量過低時,多糖產(chǎn)生活性的聚合結構可能被破壞,導致其喪失活性[63]。在適當?shù)姆肿淤|量范圍內,較低分子質量的大蒜多糖往往有著更強的生物活性。例如,相較于高分子質量(6.07 kDa)的黑蒜多糖,經(jīng)硫酸水解的低分子質量(1.25 kDa)多糖產(chǎn)物具有更強的抗氧化活性[64]。從生大蒜鱗莖提取出多種果糖聚合物,其中最低分子質量(8.93 kDa)的果聚糖在體外顯現(xiàn)出最強的抗氧化能力,同時對RAW264.7巨噬細胞生成一氧化氮的刺激活性最強[7]。在大蒜多糖益生活性的研究中同樣證實,對于多數(shù)益生菌群(雙歧桿菌、乳酸菌)而言,菊糖型果聚糖的益生元效應(促益生菌群生長、促短鏈脂肪酸釋放、發(fā)酵速度)與其分子質量大小呈負相關[4,53]。因此,分子質量的大小與大蒜多糖多種生物活性密切相關,進一步的研究應當明確這些生物活性所處的最佳分子質量的范圍,以優(yōu)化大蒜多糖在應用中的功效和性能。

3.2 大蒜多糖單糖組成與其生物活性的關系

單糖組成主要包括單糖種類及構成比例。大蒜多糖的單糖組成較為多樣,這些不同的單糖組成類型在一定程度上決定了多糖所能顯現(xiàn)出的生物活性。研究發(fā)現(xiàn),高含量的糖醛酸可以提高黑蒜多糖的美白效果,其機制與糖醛酸抑制酪氨酸酶活性,進而抑制黑色素生物合成有關[64]。半乳糖可能是大蒜多糖發(fā)揮抗凝血功效的關鍵單糖,因為其具有凝集素識別的配體, 能夠阻斷凝集素對血液的黏附作用,從而達到抗凝血的效果[61]。甘露糖則具有良好的抗腫瘤活性,在相關實驗中發(fā)現(xiàn),甘露糖能夠降低己糖激酶、磷酸葡萄糖異構酶活性,抑制糖酵解,從而抑制腫瘤細胞生長[65]。此外,甘露糖還能通過多種途徑改善炎癥現(xiàn)象,例如,誘導調節(jié)性T細胞增殖、抑制效應T細胞功能的表達、抑制巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子IL-1b[66-67]。巖藻糖是一種罕見的單糖,在大蒜多糖已知的單糖組成中含量較低,但其具有非常多樣的生物活性,包括抗炎、抗癌、抗過敏、抗凝血、抗衰老和保濕功能[68]。不同的大蒜多糖含有不同的單糖組成,這種變化可以部分地解釋多糖不同組分之間生物活性的差異。然而,應當注意,多糖結構極為復雜,這些結構對于單糖活性同樣存在一定影響,僅僅以單糖來詮釋大蒜多糖整體生物活性存在很大的局限性,其具體關聯(lián)機制仍需進一步探討。

3.3 大蒜多糖糖苷鍵與其生物活性的關系

糖苷鍵是連接2個單糖單元的化學鍵,根據(jù)半縮醛(酮)羥基的構型不同,分為a型和β型。不同糖苷鍵類型的多糖分子,其生物活性存在極大差異。例如,以β-糖苷鍵構型為主的多糖通常具有明顯的生物活性,而以a-糖苷鍵構型為主的多糖生物活性相對較弱[63]。這可能是由于人體中存在a-糖化酶,在一定條件下,它可以水解a-糖苷鍵,致使多糖活性喪失。大蒜多糖為菊糖型果聚糖,其主鏈主要由β-D-Fruf-2,1結構組成,該類型糖苷鍵對益生活性有著極為顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn),β-2,1構型有助于增強菊糖型果聚糖對上消化道中人類消化酶的抵抗力,減少水解對多糖結構的破壞。大腸中的乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌群能夠選擇性發(fā)酵β-2,1果聚糖,生成具有各種功能的代謝物,促進機體維持健康[69]。β-D-Fruf-2,6組成的支鏈是大蒜多糖化學結構中另一個顯著特征。此類構型的果聚糖在調節(jié)機體免疫功能,改善炎癥反應中發(fā)揮著重要作用,其能通過調控炎癥因子功能表達、調節(jié)免疫蛋白水平、改善腸道菌群組成等直接或間接途徑實現(xiàn)促進機體健康的免疫調節(jié)作用[70]。

4 結語

大蒜是生活中常用的補益食品,同時在藥品、保健品、化妝品等領域應用廣泛。多糖是大蒜的主要成分之一,含量較高,生物活性豐富,具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、改善腸道菌群、抗病毒、神經(jīng)保護、緩解疲勞等多種功效,且安全性高、毒副作用小,可藥食兩用。通過查閱相關文獻對大蒜多糖生物活性及結構分析研究進行總結發(fā)現(xiàn),大蒜多糖作為大蒜中重要的天然活性成分,具有一定的臨床藥用價值和良好的保健功能。大蒜多糖主要由果糖組成,不同提取工藝得到的大蒜多糖,其分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型等結構信息存在一定差異。此外,大蒜多糖可經(jīng)發(fā)酵、化學修飾改造為新型多糖產(chǎn)品,如黑蒜多糖、硒化大蒜多糖、磷酸化大蒜多糖、硫酸化大蒜多糖、羧甲基化大蒜多糖等,可用于膳食補充劑、免疫增強劑和輔助藥物等,具有廣泛應用價值。當前,大蒜多糖提取工藝、藥理作用及結構的相關研究取得了一定進展,但也具有局限性,存在諸多亟待解決的問題。比如:a)大蒜多糖的藥理作用研究雖然多有報道,但多是體外實驗或藥效學評價,進一步的作用機制研究仍然較少。b)高級構象是影響多糖生物活性的關鍵因素,但當前大蒜多糖結構的研究多為分子質量大小、單糖組成、糖鏈構型等初級結構,對于高級結構及進一步的構效關系的詮釋不夠清晰。c)大蒜多糖的提取純化方法雖然不斷優(yōu)化,然而在維持提取多糖的活性方面仍然存在許多問題,如何研究新型提取方法,在保證活性前提下提高多糖得率,仍有待深入研究。綜合而言,大蒜多糖的研究依然處于初級階段,其結構及藥理作用的全面揭示還有賴學者們進一步探索。