賈思曈,李曉慧,李志文,閆師杰,梁麗雅,陳存坤

1(天津農(nóng)學院 食品科學與生物工程學院,天津,300392)2(東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院,黑龍江 哈爾濱,150030)3(天津農(nóng)學院 農(nóng)學與資源環(huán)境學院,天津,300392)4(天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室,天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室,天津,300384)

蘋果因具有口味甘甜、便于貯藏,能滿足全年供應等特點而備受廣大種植戶和消費者喜愛[1]。但是蘋果因貯藏及運輸?shù)仍?會造成大量的經(jīng)濟損失,其中采后貯藏過程中由于侵染真菌導致蘋果病害占主要部分,全世界每年大約會有6%～8%的蘋果因為被粉紅單端孢霉侵染引起蘋果腐心病而損失[2]。此病菌主要侵染蘋果、梨等水果,其中蘋果以紅富士蘋果最易染病,在適宜病菌生長且蘋果貯藏不利的條件下,發(fā)病率高達40%[3-4]。

粉紅單端孢霉(Trichotheciumroseum)作為引起果蔬采后病變的重要病原微生物,在我國分布比較廣泛,在谷草、麥草等均有寄生,其可引起蘋果腐心病[5]、芒果果霉病[6]、甜瓜黑斑病[7]等。此外,該病毒還會產(chǎn)生單端孢霉烯毒素,此毒素對人和動物均有一定的危害[8-9]。目前,主要運用高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等方法進行果蔬中真菌毒素的檢測,應用最廣的為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。本研究將采用固相萃取柱結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行毒素的定性定量檢測。

蘋果作為我國產(chǎn)量最高的水果,種植區(qū)域遍布全國各地[14],為了增加蘋果的經(jīng)濟價值,需要將蘋果從產(chǎn)地運往主消費區(qū)。公路運輸作為商業(yè)運輸?shù)闹饕绞奖淮罅坎捎?但是在運輸過程中會因為振動等原因產(chǎn)生機械損傷,從而增加蘋果腐心病的發(fā)生,縮短果實的貯藏期,增加經(jīng)濟損失。到目前為止,國內(nèi)尚無關于運輸及運輸包裝方式對蘋果貯藏期蘋果腐心病、接種粉紅單端孢霉后發(fā)病情況及相關品質(zhì)影響的研究。因此,本研究以富士蘋果為材料,采用固相萃取-超高效液相色譜質(zhì)譜法對不同運輸包裝的染病蘋果毒素含量進行檢測,并測定蘋果的生理指標,探究不同運輸包裝方式對蘋果毒素含量及生理指標的影響,為今后通過調(diào)控運輸包裝方式而降低蘋果中毒素含量和保持品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售煙臺紅富士蘋果,購自天津市紅旗農(nóng)貿(mào)綜合批發(fā)市場;聚氯乙烯(polyvinylchlorid,PVC)膜:膜厚度為50 μm,O2滲透率為4 081.0 mL/(m2·d·101 Pa),CO2滲透率為25 902 mL/(m2·d·101 Pa),環(huán)境相對濕度為50%時透濕率為13.1 g/(m2·d)。

粉紅單端孢霉,北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司;赭曲霉素A(ochratoxin A,OTA)標準品、T-2毒素標準品、HT-2毒素標準品、鐮刀菌烯酮(fusarenon X,Fus-X)標準品、新茄腐鐮刀菌烯醇(neosolaniol,NEO)標準品、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)標準品、乙二酰蔍草鐮刀菌烯醇-蛇形毒素(diacetoxyscirpenol,DAS)標準品、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-AcDON)標準品、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl deoxynivalenol,15-AcDON)標準品,美國Romer公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、乙醇、乙腈(分析純)、乙腈(質(zhì)譜純)、檸檬酸、氯化鈉,天津韻尼科技有限公司;氮氣(純度≥99.999%):天津市津西環(huán)達化工氣體經(jīng)營部。

1.2 儀器與設備

溫濕度記錄儀,深圳市速王科技有限公司;DHP-2042BS恒溫培養(yǎng)箱,美國賽默飛世爾科技公司;TAISITE數(shù)顯恒溫水浴鍋,蘇州江東精密儀器有限公司;PAL-2數(shù)顯糖度計,日本愛拓;PHS-3E數(shù)顯酸度計,上海雷磁儀器廠;振動記錄儀、CA-10呼吸代謝測定儀,美國Stable Systems儀器公司;N-EVAP-112氮吹儀,美國Organomation公司;VORTEX-BE1渦旋混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;臺式高速冷凍離心機,德國Eppendorf公司;GC-14C氣相色譜儀,日本島津公司;Acquity TM超高效液相色譜-Xevo TQ-S串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Waters公司;DT-178A振動記錄儀,美國CEM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗流程

實驗流程如下:

菌種培養(yǎng)→制備孢子懸浮液→接種在蘋果上→培養(yǎng)→測定指標

1.3.2 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺上,將粉紅單端孢霉標準菌株轉(zhuǎn)接于事先配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上,在25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)好后,采用平板劃線法轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)皿上,后將培養(yǎng)皿放在25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8 d,留作備用。

1.3.3 孢子懸浮液制備

將BI等[15]方法稍加修改后進行孢子懸浮液的制備,用血球計數(shù)板進行計數(shù),每個樣品進行2～3次重復計數(shù),計算出每毫升孢子懸浮液中所含孢子細胞數(shù),并計算出孢子懸浮液濃度,將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至108個/mL。每毫升孢子懸浮液中所含孢子細胞數(shù)的計算如公式(1)所示:

(1)

1.3.4 選果與接種

隨機選取成熟度和大小一致的蘋果,用75%(體積分數(shù))酒精對蘋果表面消毒后,放在超凈工作臺上進行接種,用滅菌打孔器在蘋果赤道位置均勻打4個孔,每個孔注入50 μL孢子懸浮液,每個處理組接種35個蘋果。

1.3.5 不同包裝處理及運輸

將PVC膜和帶孔包裝箱用紫外線和臭氧消毒,后將已接種好的蘋果放入到包裝箱內(nèi),并用PVC膜包裝,處理組分別為無PVC膜包裝(裸露包裝),蘋果直接放在已經(jīng)消毒過的帶孔包裝箱中敞口放置;PVC膜不密閉包裝(敞口包裝),蘋果放在已經(jīng)消毒過的帶孔包裝箱中并用PVC膜包裝,PVC膜不進行扎口處理;PVC膜密閉包裝(掩口包裝),蘋果放在已經(jīng)消毒過的帶孔包裝箱中并用PVC膜包裝,PVC膜用繩子扎口并扎緊,后將溫濕度記錄儀和振動記錄儀固定到包裝箱內(nèi),后將已接種且包裝好的蘋果進行運輸,運輸均在一級、二級公路上完成,運輸溫度為(18±5) ℃,運輸時間為12 h,其中4 h在一級公路上運輸,8 h在二級公路上運輸,通過振動記錄儀測得運輸過程中平均振動加速度為1.36 g,將已接種且包裝好但未運輸?shù)奶O果作為對照組,將對照組置于18 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,后將運輸與未運輸蘋果置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中貯藏,每5 d進行1次毒素和生理生化指標測定。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 粉紅單端孢霉含量測定

1.4.1.1 粉紅單端孢霉生長曲線

借助數(shù)顯游標卡尺,采用十字交叉法測定蘋果病斑縱橫直徑,取平均值作為蘋果病斑的腐爛直徑,并以培養(yǎng)時間為橫坐標,腐爛直徑為縱坐標繪制粉紅單端孢霉生長曲線,當腐爛直徑>60 mm時結(jié)束測量。

1.4.1.2 蘋果中TeA毒素含量的測定

將劉文靜等[16]方法稍加修改后,進行已接種蘋果中毒素含量的測定。

1.4.2 生理指標測定

1.4.2.1 可溶性固形物含量的測定

用PLA-2數(shù)顯糖度計測量已接種蘋果中的可溶性固形物含量,隨機選取6個蘋果進行測量,將每個蘋果未發(fā)生腐爛部位切塊榨汁,紗布過濾后測量,每個蘋果測量3次,其結(jié)果用百分比表示。

1.4.2.2 可滴定酸含量的測定

用PHS-3E數(shù)顯酸度計進行已接種蘋果中可滴定酸含量的測定,隨機選取6個蘋果進行測量,將每個蘋果未發(fā)生腐爛部位切塊榨汁,紗布過濾后測量,每個蘋果測量3次,其結(jié)果用百分比表示。

1.4.2.3 呼吸強度測定

將GAO等[17]的方法稍加修改后進行已接種蘋果呼吸強度的測定,隨機選取6個蘋果進行測量,悶氣時間為1 h,每個處理設置3個平行。單位是mg CO2/(kg·h)。

1.4.2.4 乙烯釋放量的測定

將白鴿等[18]方法稍加修改后,采用GC-14C型氣相色譜儀進行乙烯釋放量的測定,單位是(μL/kg·h)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖形分析

實驗所得數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準差(standard deviation, SD)表示,Origin 2021軟件進行作圖及統(tǒng)計分析,SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,用ANOVE分析數(shù)據(jù)間顯著性,置信水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同運輸包裝方式對接種蘋果中粉紅單端孢霉產(chǎn)毒的影響

2.1.1 不同運輸包裝方式對粉紅單端孢霉生長曲線的影響

不同運輸包裝方式的接種蘋果貯藏到第28天時,貯藏效果如圖1所示,裸露包裝運輸?shù)慕臃N蘋果的菌落直徑最大。粉紅單端孢霉生長曲線如圖2所示,在貯藏后期,采用相同的包裝方式時,經(jīng)過運輸?shù)慕臃N蘋果的粉紅單端孢霉生長情況與未運輸?shù)慕臃N蘋果的粉紅單端孢霉生長情況相比,存在顯著性差異(P<0.05),這說明運輸過程會加劇蘋果腐心病的發(fā)病進程。在貯藏期內(nèi),各個處理組接種蘋果中粉紅單端孢霉的生長也會進一步加快。不同的包裝方式會使接種蘋果中粉紅單端孢霉的生長情況產(chǎn)生差別,順序依次是裸露包裝>敞口包裝>掩口包裝。結(jié)果表明接種蘋果在運輸過程中產(chǎn)生的機械損傷會進一步促進粉紅單端孢霉的侵染進程,并且,運輸過程中采取的包裝方式也會使蘋果腐心病的發(fā)病情況受到影響。

2.1.2 不同運輸包裝方式對接種蘋果TeA毒素含量的影響

蘋果在接種粉紅單端孢霉后進行運輸過程中,僅會產(chǎn)生TeA毒素。已接種蘋果中TeA毒素含量如表1所示,在蘋果接種粉紅單端孢霉后運輸之前,均會有TeA毒素的積累。隨著貯藏時間的延長,各組接種蘋果中TeA毒素含量顯著增加(P<0.05)。在常溫運輸后,處理組接種蘋果中TeA毒素顯著高于對照組(P<0.05),這可能是因為接種蘋果在運輸過程中產(chǎn)生一定程度的機械損傷,從而加快了接種蘋果的采后代謝和粉紅單端孢霉的侵染,導致毒素積累量增加。3種包裝方式中,裸露運輸毒素積累量顯著高于敞口運輸和掩口運輸(P<0.05),此結(jié)果與接種蘋果經(jīng)運輸后粉紅單端孢霉的生長情況相對應。

表1 不同運輸包裝方式對接種蘋果TeA毒素含量的影響 單位:μg/LTable 1 Effects of different transportation packaging methods on the content of TeA toxin in inoculated apples

2.2 不同運輸包裝方式對接種蘋果相關生理指標的影響

2.2.1 不同運輸包裝方式對接種蘋果可溶性固形物含量的影響

蘋果中可溶性固形物含量是評價蘋果品質(zhì)的主要指標,不同運輸包裝方式接種蘋果中可溶性固形物含量變化如圖3所示。接種蘋果在運輸過程中會產(chǎn)生一定程度的機械傷,這會使果實的生理代謝紊亂,從而產(chǎn)生不良的生理反應。接種蘋果中的可溶性固形物含量在貯藏前期緩慢上升,且在第15 天、第15 天、第5 天、第5 天、第5 天、第5 天時,裸口未運輸、裸口運輸、敞口未運輸、敞口運輸、掩口未運輸和掩口運輸處理組接種蘋果中可溶性固形物含量達到峰值,除去裸露包裝處理組,其余2個包裝處理組運輸處理與未運輸處理的接種蘋果可溶性固形物含量均存在顯著性差異(P<0.05)。后隨著貯藏時間的延長,各個處理組接種蘋果的可溶性固形物含量開始下降,在貯藏結(jié)束時,處理組接種蘋果可溶性固形物含量均顯著低于與其對應的對照組接種蘋果可溶性固形物含量(P<0.05)。原因可能是運輸過程中產(chǎn)生的振動加快了接種蘋果的生理代謝活動,且產(chǎn)生的機械損傷會進一步促進粉紅單端孢霉的侵染以及TeA毒素的積累,毒素積累的過程需要大量的碳水化合物提供碳源和氮源,從而導致接種蘋果中可溶性固形物含量的降低。

圖3 不同運輸包裝方式對接種蘋果可溶性固形物含量的影響Fig.3 Effects of different transportation packaging methods on the soluble solids content of inoculated apples

2.2.2 不同運輸包裝方式對接種蘋果可滴定酸含量的影響

可滴定酸含量高低可作為評價蘋果品質(zhì)好壞的重要指標。研究表明,振動脅迫能夠顯著降低水果中的總酸含量,且隨著振動時間的延長,果實中總酸含量會大幅下降,這說明運輸過程中的振動作用會使果實中風味物質(zhì)減少[19-20]。接種蘋果中可滴定酸含量在不同運輸包裝方式下變化情況如圖4所示,各處理組及其對照組接種蘋果中可滴定酸含量呈現(xiàn)先升高后降低再趨于穩(wěn)定的態(tài)勢,第5天時接種蘋果中可滴定酸含量達到峰值,且運輸組與未運輸組相比,差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同運輸包裝方式對接種蘋果可滴定酸含量的影響Fig.4 Effects of different transportation packaging methods on the titratable acid content of inoculated apples

2.2.3 不同運輸包裝方式對接種蘋果呼吸強度的影響

果蔬的呼吸強度與其生理變化密不可分,不僅如此,呼吸強度還會影響果蔬的品質(zhì)和抗病性等。果蔬會隨著呼吸強度的升高加快生理代謝活動,且耐貯藏性也會隨之降低[21]。蘋果屬于典型的呼吸躍變型果實,在貯藏的過程中會出現(xiàn)呼吸躍變峰,如圖5所示,在貯藏期間,接種蘋果呼吸強度先升高后降低,并在第10天和第15天時,處理組和對照組相繼出現(xiàn)呼吸高峰,此時相同包裝處理組中運輸處理組接種蘋果呼吸強度顯著低于未運輸處理組接種蘋果呼吸強度(P<0.05)。這種現(xiàn)象說明運輸在一定程度提前呼吸高峰的出現(xiàn)。呼吸高峰出現(xiàn)后,隨著貯藏時間的延長,未運輸處理組接種蘋果呼吸強度高于運輸處理組接種蘋果呼吸強度。在3種運輸包裝方式中,掩口包裝的接種蘋果呼吸強度較弱于另外2個處理。

圖5 不同運輸包裝方式對接種蘋果呼吸強度的影響Fig.5 Effects of different transportation packaging methods on the respiration intensity of inoculated apples

2.2.4 不同運輸包裝方式對接種蘋果乙烯釋放量的影響

接種蘋果在運輸與未運輸過程中乙烯釋放量如圖6所示。處理組與對照組乙烯釋放量整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并在第15天和第10天時,對照組和處理組的乙烯釋放量依次達到峰值,且對照組乙烯釋放量峰值顯著低于所對應的處理組乙烯釋放量峰值(P<0.05),這說明運輸處理不僅加快乙烯高峰的到來,而且增加乙烯的釋放量。在處理組的3個處理方式中,掩口包裝顯著高于另外2種包裝方式(P<0.05)。

圖6 不同運輸包裝方式對接種蘋果乙烯釋放量的影響Fig.6 Effects of different transportation packaging methods on the ethylene release of inoculated apples

3 結(jié)論與討論

粉紅單端孢霉侵染水果后,會產(chǎn)生諸如T-2毒素、HT-2毒素等單端孢烯族毒素,這些毒素與伏馬毒素等均屬于鐮刀菌毒素,鐮刀菌毒素在植物中通過結(jié)合或代謝相繼轉(zhuǎn)化為其他毒素[22-23]。此實驗所檢測到的TeA毒素就是粉紅單端孢霉形成的鐮刀菌毒素轉(zhuǎn)化而來的。但是該毒素產(chǎn)生的途徑目前還不清楚,需要進一步研究。

接種蘋果在運輸過程中會因振動產(chǎn)生機械損傷,這些機械損傷會增加粉紅單端孢霉的侵染速度和TeA毒素的積累,因此運輸處理組接種蘋果的腐爛直徑和TeA毒素含量高于未運輸處理組;有研究表明,氧氣含量與粉紅單端孢霉生長情況呈現(xiàn)正相關[24],實驗測得粉紅單端孢霉菌落直徑與TeA毒素含量變化趨勢相同,所以,TeA毒素含量可能與包裝內(nèi)氧氣含量變化呈現(xiàn)正相關趨勢,3種運輸包裝方式中裸露包裝運輸方式的接種蘋果TeA毒素含量最高也驗證了此觀點。運輸處理會加快接種蘋果的生理代謝速度,增加呼吸強度和乙烯釋放含量,這與劉春娣[25]研究結(jié)果一致,通過振動富士蘋果后測量富士蘋果的呼吸強度和乙烯釋放量發(fā)現(xiàn),相同振動時間和溫度下,經(jīng)過振動的富士蘋果呼吸強度和乙烯釋放量遠遠高于未經(jīng)過振動的富士蘋果。經(jīng)過運輸后的接種蘋果增加了呼吸強度,從而增加了可溶性固形物的消耗,這與陳豫等[26]研究振動對宜賓茵紅李可溶性固形物含量的變化趨勢一致,而可滴定酸含量在運輸前后差異不顯著,這說明接種蘋果的可滴定酸含量受振動的影響較小,此結(jié)果與田津津等[27]探究振動對草莓中可滴定酸含量變化趨勢結(jié)果相似。

本文對接種粉紅單端孢霉的蘋果采取不同的運輸和包裝方式,探究接種蘋果在不同運輸和包裝情況下,貯藏期間各項指標的變化情況,結(jié)果表明,運輸處理后的接種蘋果腐爛直徑和毒素含量顯著高于未經(jīng)過運輸?shù)慕臃N蘋果(P<0.05),且在運輸處理組3種包裝方式中,掩口包裝方式的接種蘋果TeA毒素含量低于另外2個處理;接種蘋果經(jīng)過運輸后,可溶性固形物含量顯著低于未運輸處理組(P<0.05);但可滴定酸含量在運輸前后差異不顯著(P>0.05);運輸處理組接種蘋果呼吸強度和乙烯釋放含量高于未運輸處理組,且經(jīng)過運輸后會提前呼吸高峰和乙烯高峰的到來,這會加快蘋果的成熟衰老的速度,使蘋果不易貯藏。