金璟, 何路路, 陳園, 張麗, 劉國成

廣東省婦幼保健院產(chǎn)科(廣東廣州 511400)

子癇前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特發(fā)性疾病之一,全球的發(fā)病率為2%～8%[1],其嚴重威脅母親和嬰兒的健康,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[2]。其病因及發(fā)病機制目前尚未被闡明,目前,普遍認為與滋養(yǎng)細胞分化障礙、異常血管重鑄、母胎免疫平衡失調(diào)、內(nèi)皮細胞損傷、遺傳與環(huán)境交互作用等有關(guān)[3]。近年來,胎盤源性學(xué)說認為其發(fā)病與胎盤不良發(fā)生發(fā)育有關(guān),本研究旨在利用高通量測序技術(shù)對正常妊娠和PE患者胎盤組織進行測序,構(gòu)建PE 相關(guān)的mRNA差異表達譜。隨后用生物信息學(xué)分析差異表達mRNA,揭示差異mRNA可能的功能和主要參與的信號傳導(dǎo)途徑及代謝途徑。試圖更全面地尋找與PE發(fā)生相關(guān)的新的基因,篩選特定基因作為PE的早期診斷標志物和治療靶點以進行早期預(yù)測和臨床精細化管理。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2019年12月在廣東省婦幼保健院剖宮產(chǎn)分娩孕產(chǎn)婦共49例。其中足月正常妊娠孕產(chǎn)婦23例作為對照組,診斷為PE孕產(chǎn)婦26例作為觀察組。采集樣本中選擇對照組3例(CK),觀察組6例(T)[其中早發(fā)型PE 3例(T1),晚發(fā)型PE 3例(T2)],共9例送往廣州基迪奧生物科技公司,以協(xié)助高通量測序。利用實時熒光定量PCR,選擇對照組中剩余的20例及觀察組中剩余的20例,驗證差異表達基因。研究對象入組標準:選擇的孕婦為單胎自然妊娠,入組觀察組的孕婦符合PE診斷標準(參見《妊娠期高血壓疾病:ISSHP分類、診斷和管理指南(2018)》)。排除標準:排除妊娠期合并癥,如妊娠期糖尿病、肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)、原發(fā)性高血壓、腎炎、心臟病、肝炎以及其他內(nèi)外科妊娠合并癥;排除妊娠期和(或)分娩期并發(fā)癥,如前置胎盤、胎盤早剝、胎兒窘迫、羊水過多、羊水過少、巨大兒、胎兒生長受限、胎兒先天性疾病等。所有研究對象知情同意并簽屬知情同意書。

研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過(廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202101205]號)

1.2 研究方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建 正常物種中,90%以上的RNA為rRNA,因此需要在提取樣本的總RNA后,通過常規(guī)試劑盒去除rRNA,將mRNA富集。進一步將富集得到的mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成雙鏈cDNA,修復(fù)cDNA雙端后,加上接頭和PCR擴增,構(gòu)建上機文庫。

1.2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控 為保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量,信息分析之前,對原始數(shù)據(jù)進行過濾,以減少無效數(shù)據(jù)的分析的干擾。過濾數(shù)據(jù)后,分析堿基的組成及質(zhì)量分布,以直觀展示數(shù)據(jù)質(zhì)量情況。堿基組成越平衡,質(zhì)量越高,后續(xù)分析則越準確。

1.2.3 序列比對分析 (1)核糖體比對:使用短 reads 比對工具 bowtie2將clean reads 與該物種的核糖體數(shù)據(jù)庫進行比較。在正常匹配情況下,把比對上核糖體的 reads刪除,將保留下來的unmapped reads用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析。(2)參考比對:使用HISAT2軟件進行比對分析,該項目選擇比對的是參考基因組。HISAT2采用的策略是層級比對,最大限度地保證reads的比對率以及準確性。(3)比對區(qū)域統(tǒng)計:根據(jù)全部定位到基因組的reads結(jié)果,計算reads在參考基因組中的分布。將參考基因組比對到的區(qū)域劃分為外顯子,內(nèi)含子和基因間區(qū)域。

1.2.4 基因表達量統(tǒng)計 (1)校正測序的深度;(2)校正基因或轉(zhuǎn)錄本的長度;(3)得到基因的FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值,然后進行后續(xù)分析。

1.2.5 樣本關(guān)系分析 基于各樣本表達量結(jié)果,通過PCA分析和計算樣本間Pearson相關(guān)系數(shù),了解樣本之間的重復(fù)性情況。

1.2.6 組間差異分析 用DESeq2軟件分析時所輸入的數(shù)據(jù)是在基因表達水平分析中得到的reads count數(shù)據(jù)。分析主要分為三個部分:(1)將read count標準化;(2)計算假設(shè)檢驗概率(P值);(3)對多重假設(shè)檢驗進行校正,得到FDR值。根據(jù)差異分析結(jié)果,顯著性差異表達基因的篩選條件是:FDR<0.05且|log2FC|>1。根據(jù)各比較組的顯著性差異基因。

1.2.7 qRT-PCR驗證差異表達基因 結(jié)合上述富集分析,篩選出差異表達基因。擴大樣本量,選擇足月正常妊娠和子癇前期胎盤組織樣本各20例,進行qRT-PCR檢測上述基因的表達,驗證其與高通量測序結(jié)果是否一致。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕產(chǎn)婦一般臨床資料比較 觀察組平均最大收縮壓、最大舒張壓大于對照組(P<0.05), 觀察組分娩孕周、新生兒體重、新生兒出生時的身長小于對照組(P<0.05),觀察組和對照組孕產(chǎn)婦的年齡、體重、體質(zhì)指數(shù)及早產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)控 信息分析之前,進行原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過濾,以減少無效數(shù)據(jù)帶來的分析干擾。表2顯示的是原始數(shù)據(jù)過濾后,得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量情況。Clean Data(%)是數(shù)據(jù)過濾后得到的高質(zhì)量reads數(shù)目及占原始下機的reads數(shù)目的百分比;Clean Data(bp)是數(shù)據(jù)過濾后得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)堿基總數(shù);AF(After filter)是原始數(shù)據(jù)過濾后樣本堿基信息。表中Clean Data(%)>99%,過濾后的數(shù)據(jù)Q30(錯誤率<0.1%)>90%,說明測序數(shù)據(jù)可信。

表2 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計表

2.3 比對參考基因組分析 以參考基因組為模板,將原始數(shù)據(jù)過濾后得到的Clean Data與其比對,得出每個樣本測序的數(shù)據(jù),比對率,基因組在三個區(qū)域的比對情況,用于后續(xù)基因表達量的計算。如表3所示,Total是核糖體過濾后得到的有效reads數(shù)量;Unique Mapped(%)是在參考基因組上唯一比對的 reads 數(shù)及占Total的比例;Multiple Mapped(%)是在參考基因組上多處比對的 reads 數(shù)及占Total的比例;Total Mapped(%)是在參考基因組比對上的reads的總數(shù)及占Total的比例。比對結(jié)果顯示,所有測序樣本的Total Mapped>96%,說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)控良好。

表3 基于參考基因組的比對分析統(tǒng)計情況

2.4 基因表達量的統(tǒng)計 通過比較Clean Data和參考基因組,用FPKM公式計算基因表達量,根據(jù)正常妊娠和PE胎盤組織樣本基因表達情況繪制基因表達量小提琴圖(圖1)。

圖1 基因表達量小提琴圖

2.5 差異表達基因分析 基因表達量統(tǒng)計完成后,使用DESeq2軟件分析差異表達基因,比較正常妊娠組(CK)和PE組(T)以及早發(fā)型PE組(T1)和晚發(fā)型PE組(T2)差異基因表達情況。結(jié)合差異分析結(jié)果,顯著差異表達基因的篩選條件為:FDR<0.05 且 |log2FC|>1。結(jié)果顯示,正常妊娠組和PE組相比,有12個基因表達上調(diào),39個基因表達下調(diào);早發(fā)型PE組和晚發(fā)型PE組相比,有15個基因表達上調(diào),17個基因表達下調(diào)。見表4。

表4 差異表達基因分析結(jié)果統(tǒng)計表

2.5.1 PE胎盤組織顯著差異上調(diào)表達基因 PE胎盤組織基因的差異表達與其病理的發(fā)生、發(fā)展密不可分,找出正常妊娠和PE胎盤組織顯著差異表達的基因,有助于我們明確病理情況下異?；虻恼{(diào)控模式,在細胞分子水平深入研究PE的發(fā)病機制。根據(jù)差異表達基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出前十個顯著差異上調(diào)表達基因(表5)。

表5 PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達基因

2.5.2 PE胎盤組織顯著差異下調(diào)表達基因 顯著差異上調(diào)表達基因在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用,但同時基因下調(diào)表達可能使機體抑制疾病發(fā)生的能力降低,導(dǎo)致某些通路的異常激活。因此,根據(jù)差異表達基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出前十個顯著差異下調(diào)表達基因(表6)。

表6 PE胎盤組織中前十個顯著差異下調(diào)表達基因

2.5.3 早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達基因 根據(jù)孕周將PE分為早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE。早發(fā)型PE往往伴隨著嚴重的母嬰并發(fā)癥,而晚發(fā)型PE的預(yù)后要比早發(fā)型PE的好。造成這種差異的原因可能是二者的發(fā)病機制不同。因此,可以將PE分為早發(fā)型和晚發(fā)型進行分別研究,探討該病的早期診斷標志物。因此,根據(jù)差異表達基因Fold change倍數(shù)從高到低篩選出早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達基因(表7)。

表7 早發(fā)型與晚發(fā)型PE胎盤組織中前十個顯著差異上調(diào)表達基因

2.6 差異表達基因功能富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 差異表達基因GO富集分類結(jié)果顯示:(1)差異表達mRNA參與生物過程主要富集在:GO:0006954 inflammatory response(炎癥反應(yīng));GO:0002376 immune system process(免疫系統(tǒng)過程);GO:0045321 leukocyte activation(白細胞活化);GO:0042108 positive regulation of cytokine biosynthetic process(細胞因子生物合成過程的正調(diào)控);GO:0042107 cytokine metabolic process(細胞因子代謝過程)等GO Term上。(2)差異表達mRNA作為細胞組分主要富集在:GO:0005886 plasma membrane(質(zhì)膜);GO:0036019 endolysosome(溶酶體);GO:0005615 extracellular space(細胞外區(qū)域);GO:0031982 vesicle(囊泡);GO:0009986 cell surface(細胞表面)等GO Term上。(3)差異表達mRNA執(zhí)行分子功能主要富集在:GO:0050840 extracellular matrix binding(細胞外基質(zhì)結(jié)合);GO:0005344 oxygen transporter activity(氧轉(zhuǎn)運蛋白活性);GO:0004872 receptor activity(受體活性);GO:0038021 leptin receptor activity(瘦素受體活性);GO:0004915 interleukin-6 receptor activity(白細胞介素6受體活性)等GO Term上。

2.6.2 KEGG信號通路富集分析 KEGG中富集了前20條信號通路,Toll樣受體信號通路、Notch信號通路、HIF-1信號通路、脂肪細胞因子信號通路均與PE的發(fā)病有著顯著相關(guān)性,從這些方面進一步研究其發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點,可能有助于PE的早期診斷和治療。

2.6.3 DO功能富集分析 疾病相似性研究對了解PE發(fā)病機制、早期預(yù)防、診斷及新藥的研究和開發(fā)具有重要意義。因此,分析差異表達基因的疾病本體論(disease ontology,DO)富集具有重要的生物學(xué)意義。結(jié)果顯示,免疫系統(tǒng)疾病、血管功能障礙、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等可能與PE的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.7 qRT-PCR結(jié)果 與對照組相比,觀察組孕婦胎盤組織中ENG和TREM1基因表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);APLN和RGS5基因表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表8。

表8 qRT-PCR驗證結(jié)果與RNA-Seq測序結(jié)果比較

3 討論

PE是一種常見且復(fù)雜的妊娠疾病,其發(fā)病學(xué)說多樣,既往研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制涉及母胎免疫平衡失調(diào)、氧化應(yīng)激、代謝紊亂、遺傳與環(huán)境交互作用等,其中涉及到多個致病基因的異常表達[3]。

胎盤是人類妊娠的重要器官,其發(fā)育和功能的失常與多種病理妊娠有關(guān)。人胎盤是由滋養(yǎng)細胞、免疫細胞、間充質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、造血干細胞等組成的復(fù)雜器官,每一種細胞都在妊娠期間發(fā)揮著不同的關(guān)鍵作用[4]。包括滋養(yǎng)細胞浸潤,蛻膜免疫,絨毛血管生成,母體和胎兒的內(nèi)分泌調(diào)節(jié),以及營養(yǎng)物質(zhì)/廢物的運輸?shù)萚5]。因此,胎盤有一個獨特的轉(zhuǎn)錄組,包括許多在其他人體器官中不存在的mRNA。使用高通量測序研究轉(zhuǎn)錄組的方法,已經(jīng)被廣泛用于研究PE、胎兒生長受限、早產(chǎn)等病理過程中胎盤發(fā)育和功能的障礙。全面了解胎盤轉(zhuǎn)錄組在PE病理過程中的變化,對理解PE病因?qū)W的分子機制、開發(fā)新的生物標志物或識別治療靶點具有重要意義。

本實驗通過RNA-Seq明確了正常妊娠和PE胎盤組織存在多個基因的差異表達,結(jié)果表明,PE組篩選出51個差異表達基因,其中包括ENG、TREM1、NLRP10、DHRS2、AREG、ALPG等12個基因上調(diào);APLN、RGS5、ANGPTL1等39個基因下調(diào)。差異表達基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞因子代謝等多種生物過程。生物學(xué)通路分析結(jié)果顯示,Toll樣受體信號通路、Notch信號通路、HIF-1信號通路、脂肪細胞因子信號通路與PE的發(fā)病顯著關(guān)聯(lián)。DO分析結(jié)果表明差異基因主要富集的疾病有:免疫系統(tǒng)疾病、血管功能障礙、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等有關(guān)。差異基因富集分析為我們進一步了解PE的發(fā)生發(fā)展機制提供了新的依據(jù)。通過對GO、KEGG和DO富集綜合分析,篩選出4個差異表達基因(ENG、TREM1、APLN和RGS5),采用qRT-PCR驗證上述基因,結(jié)果顯示ENG和TREM1基因在子癇前期胎盤組織中表達上調(diào),APLN和RGS5基因在子癇前期胎盤組織中表達下調(diào)。與高通量測序結(jié)果相吻合,說明測序結(jié)果可信,提示這些可能是參與子癇前期疾病發(fā)生發(fā)展的主要基因。

ENG(Endoglin)基因編碼的蛋白是一種同型二聚體跨膜蛋白,作為血管內(nèi)皮細胞的主要糖蛋白,其對調(diào)控血管的生成起重要作用[6]。該蛋白是正常胚胎外血管生成和胚胎心臟發(fā)育所必須的,可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的遷移及對血流的反應(yīng),從而促進血管重建和血管生成過程中正常血管形態(tài)的建立[6-7]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括蛋白同型二聚活性和糖胺聚糖結(jié)合。其相關(guān)通路包括TGF-β受體信號通路和TGF-β信號通路。Levine等[8]的研究顯示,PE患者血清中sEng水平顯著增加,且這種增加開始于PE發(fā)病前2～3個月。與晚發(fā)型PE相比,早發(fā)型PE循環(huán)中sEng的水平明顯升高。體外動物實驗證實,阻斷Eng的表達可以促進滋養(yǎng)細胞的分化和浸潤。因此,我們推測Eng的異常表達可能會抑制滋養(yǎng)細胞的生長和遷移,導(dǎo)致胎盤血管重鑄失敗,從而導(dǎo)致胎盤血流灌注減少,誘發(fā)PE的一系列癥狀。

TREM1基因編碼一種在骨髓細胞上表達的免疫球蛋白超家族受體[9]。該蛋白通過刺激促炎性趨化因子和細胞因子的釋放以及細胞活化標記物的表面表達增加,從而來增強由中性粒細胞和單核細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[10]。研究證實,TREM1是炎癥反應(yīng)的重要啟動因子,一旦TREM1激活,可以促進多種炎癥介質(zhì)的合成,從而放大炎癥反應(yīng)[11]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括支架蛋白結(jié)合;其相關(guān)通路包括Toll樣受體信號通路和血管壁的細胞表面相互作用。近年來,有學(xué)者對PE患者胎盤組織進行微陣列分析,結(jié)果顯示,與正常妊娠孕婦相比,PE患者胎盤組織中的TREM1表達水平顯著上調(diào)。大量研究顯示,激活TREM1可以誘發(fā)炎癥趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生,如TNF-S、IL-6、GM-CSF等[10-11]。過度激活的炎癥因子可影響滋養(yǎng)細胞的浸潤和凋亡,也可導(dǎo)致PE患者血管內(nèi)皮損傷。

APLN(Apelin)基因編碼的肽作為G蛋白偶聯(lián)的Apelin受體的內(nèi)源性配體。編碼的前蛋白被蛋白水解加工成具有生物活性的C末端肽片段。這些肽片段激活不同的組織特異性信號通路,調(diào)節(jié)不同的生物功能,包括體液平衡、心血管功能、免疫調(diào)節(jié)和胰島素分泌[12]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括信號受體結(jié)合和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合;其相關(guān)通路包括GPCR和肽配體結(jié)合受體。Apelin在人體內(nèi)廣泛表達,尤其在胎盤組織中顯示高表達,且從早期妊娠到晚期妊娠其在胎盤組織中的表達呈下降趨勢,提示Apelin可能參與調(diào)控胎盤的形成和胎兒的生長發(fā)育[13]。研究發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤組織中Apelin水平較正常妊娠降低;給妊娠14天的PE模型小鼠每天注射Apelin-13,連續(xù)5 d,發(fā)現(xiàn)孕鼠的血壓明顯下降,尿蛋白定量減少,心功能也有所改善;此外胚胎存活數(shù)和胎盤的重量也增加了[14]?；贏pelin擴張血管的生理功能,我們推測胎盤組織中Apelin表達的減少可能影響滋養(yǎng)細胞向子宮螺旋動脈的浸潤,從而導(dǎo)致胎盤循環(huán)阻力增加,誘發(fā)PE。

PE根據(jù)孕周不同分為早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE。早發(fā)型PE常伴有嚴重的母嬰并發(fā)癥,而晚發(fā)型PE的預(yù)后優(yōu)于早發(fā)型PE。造成這種差異的原因可能是二者的發(fā)病機制不同。因此,可以將PE分為早發(fā)型和晚發(fā)型進行分別研究,探討該病的早期診斷標志物。我們選取早發(fā)型和晚發(fā)型PE差異表達的RGS5基因進一步討論分析。RGS5基因編碼G蛋白信號(RGS)家族的一個調(diào)節(jié)因子。RGS蛋白是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,通過發(fā)揮GTPase激活子的作用參與異三聚體G蛋白的調(diào)控[15]。該基因是染色體1q上導(dǎo)致血壓升高的三個基因之一,也是缺氧誘導(dǎo)因子-1依賴的缺氧誘導(dǎo)基因,參與內(nèi)皮細胞凋亡的誘導(dǎo)[16]。與該基因相關(guān)的基因本體注釋包括GTPase激活劑活性;其相關(guān)通路包括GPCR信號通路和肌層松弛和收縮信號通路。既往研究顯示RGS5作為G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要負性調(diào)節(jié)因子,在血壓的調(diào)節(jié)和血管的再生中發(fā)揮作用,這與PE的發(fā)病機制有關(guān)。動物實驗表明,敲除RGS5的孕鼠可通過增強血管對AngⅡ的敏感性引起妊娠期高血壓[17]。目前對RGS5的研究主要集中在腫瘤方面,RGS5在PE發(fā)病機制中的作用有待進一步探索。

總之,本研究運用RNA-Seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平篩查了正常妊娠和PE胎盤組織的差異表達基因,并對差異基因進行生物學(xué)功能分析,初步定位出候選關(guān)鍵基因ENG、TREM1、APLN和RGS5,下一步我們將對這些候選基因進行動物模型基因表達驗證,并計劃通過增加樣本量繼續(xù)研究PE胎盤組織基因差異性表達及調(diào)控機制,以期揭示PE的發(fā)生發(fā)展機制,獲得藥物治療靶點。

利益相關(guān)聲明:作者聲明無任何利益相關(guān)。

作者貢獻說明:金璟醞釀和設(shè)計實驗,實施研究,起草論文;何路路實施研究,采集數(shù)據(jù),分析解釋數(shù)據(jù)及支持性貢獻;陳園實施研究,采集數(shù)據(jù),分析解釋數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析及支持性貢獻;張麗醞釀和設(shè)計實驗,設(shè)計論文框架結(jié)構(gòu),收集標本;劉國成確定論文選題,修改論文,設(shè)計研究方法。