王瑢, 佘志強, 張少杰

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣西南寧 530000); 2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣西南寧 530000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的發(fā)生是一項多階段、多路徑、多機制的進程,多種炎癥介質(zhì)、細胞因子參與其中[1],而腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate、lung、nasal epithelium clone,PLUNC)基因被認(rèn)為是一種在黏膜下腺和呼吸道上皮細胞表面表達的固有免疫蛋白,氣道不同炎癥感染狀態(tài)與其表達水平的改變有密切關(guān)系[2]?；蛞赘行?遺傳傾向是變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的一個重要因素,大量的數(shù)據(jù)證實,不同人群的個體在對患某種疾病的敏感性、對藥物的反應(yīng)等具有差別,這些差異通常來自相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)[3-4]。我們已在前期的科學(xué)研究中,檢測出了PLUNC基因中8個SNPs位點,其啟動子區(qū)兩個多態(tài)位點C-1888T和C-2128T,與我國人鼻咽癌的易感性關(guān)聯(lián)極為緊密(OR=2.8～3.3,P<0.001)[5],但是與變應(yīng)性鼻炎的關(guān)系卻從未見有相關(guān)研報道。我們選擇其中一個多態(tài)位點C-1888T作為研究對象,采取病例對照的研究方法,分析其與變應(yīng)性鼻炎易感的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月至2022年2月期間于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院就診治療的225例變應(yīng)性鼻炎患者臨床資料,設(shè)為AR組,其中男115例,女110例,漢族89例,壯族136例,年齡18～65歲,平均(38.07±12.67)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)參考2022年修訂版《中國變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》,符合變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)抽血檢測十種吸入性變應(yīng)原,包括屋塵螨、粉塵螨、狗毛、艾蒿、貓毛、樹組合(柳樹/楊樹/榆樹)、矮豚草、蟑螂、真菌、葎草,至少有一種變應(yīng)原反應(yīng)試驗為陽性。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并哮喘、濕疹、特應(yīng)性皮炎等變應(yīng)性疾病病史;(2)有慢性鼻-鼻竇炎或鼻息肉病史;(3)合并腫瘤病史;(4)采集標(biāo)本前全身或局部使用激素病史;(5)采集標(biāo)本前有上、下呼吸道感染病史。

另選取同期150例健康體檢人群設(shè)為對照組,其中男80例,女70例,漢族52例,壯族98例,年齡12～78歲,平均(40.50±19.35)歲。兩組人員的年齡、性別、民族等資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過(KY2022-25)

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 血液DNA及RNA提取試劑盒購至常州百代生物,逆錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)PCR均購至Servicebio公司,擴增儀購至北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,電泳儀購至Servicebio公司,引物由捷尼斯生物公司合成,凝膠成像儀購至上海天能科技有限公司。

1.2.2 DNA提取及基因分型 采集AR組和對照組外周靜脈血3 mL并分裝備用。根據(jù)血液DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA,分光光度計定量。PCR引物設(shè)計及反應(yīng)體系和條件參考文獻[5],擴增PLUNC基因上游啟動子區(qū)全長為192 bp的DNA序列。PCR產(chǎn)物直接送檢測序,部分經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀觀察目的條帶是否清晰、大小是否正確。

1.2.3 Quantitative real-time PCR(QPCR)檢測不同組別、不同基因型中PLUNC基因的相對表達水平 根據(jù)血液RNA提取試劑盒操作步驟,提取各組外周血中總RNA,異丙醇沉淀,分光光度計定量。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以β-actin為內(nèi)參,每個樣本做3個復(fù)孔,使用熒光定量PCR儀進行實時定量PCR擴增,各自引物序列見表1。QPCR反應(yīng)條件為95℃,10 min,1cycle;95℃,15 s、60℃,30 s,40cycle。反應(yīng)結(jié)束后自動計算出Ct值,用2-ΔΔCt表示PLUNC基因在不同組別中及不同基因型中的相對表達水平。

表1 QPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件處理分析數(shù)據(jù),檢驗研究對象的Hardy-Weinberg平衡。不同基因型和等位基因頻率采用頻率計數(shù)法計算;不同基因型和等位基因之間頻率比較采用2檢驗;AR組與對照組間PLUNC基因的相對表達量比較采取t檢驗;不同基因型與對照組之間PLUNC基因的相對表達量差異采用方差分析。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡驗證 PLUNC基因的C-1888T位點基因型分布,實際值與預(yù)測值比較無明顯差異,且各基因型頻率穩(wěn)定,符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,見表2。

表2 PLUNC基因C-1888T位點基因型頻率Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

2.2 C-1888T位點3種基因型鑒定 PCR電泳圖見擴增產(chǎn)物大小為192 bp,條帶清晰(圖1)。PCR產(chǎn)物直接測序鑒定出C-1888T位點3種基因型,即TT型、CC型、CT型(圖2)。

圖1 部分樣本PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

A:CT型;B:TT型;C:CC型

2.3 C-1888T位點基因型和等位基因頻率對比 AR組CC基因型30例(13.33%),CT基因型60例(26.67%),TT基因型135例(60.00%);C等位基因頻率為26.67%,T等位基因頻率為73.33%。對照組CC基因型、CT基因型、TT基因型分別為50例(33.33%)、76例(50.67%)、24例(16.00%);C等位基因頻率為58.67%,T等位基因頻率為41.33%。AR組與對照組相比,TT基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。相對于等位基因C,等位基因T可能增加變應(yīng)性鼻炎發(fā)生的危險性(OR=3.903,P=0.000)。TT基因型較CC基因型,使變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病風(fēng)險增加(OR=9.375,P=0.000)。見表3。

表3 C-1888T位點等位基因與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病危險性

2.4 PLUNC基因在對照組和AR組中的相對表達量比較 PLUNC基因在AR組的相對表達量為1.449±0.898,在對照組的相對表達量為2.345±0.668,兩組方差齊,PLUNC基因在AR組中的相對表達量明顯低于對照組(P=0.000)。

2.5 PLUNC基因在對照組和AR組不同基因型中的相對表達量比較 PLUNC基因在對照組和不同基因型中的相對表達水平見表4,Levene檢驗方差不齊,總體均數(shù)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。進一步Dunnett′s法多重比較發(fā)現(xiàn),TT型與對照組相比,PLUNC基因表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);而CT型、CC型與對照組相比,相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.189和P=0.695)。

表4 PLUNC基因在對照組和不同基因型中的相對表達量比較

3 討論

PLUNC基因表達具有相對的組織特異性[7],最初的研究主要集中在與鼻咽癌的相關(guān)性方面[8],但隨著研究的推進,發(fā)現(xiàn)PLUNC同時還是一種新的上呼吸道分泌性蛋白質(zhì),屬抗炎因子,能抑制炎癥反應(yīng)[9-10],在多種氣道變應(yīng)性疾病中發(fā)揮了免疫應(yīng)答作用[11]。變應(yīng)性鼻炎是機體接觸變應(yīng)原后主要由 IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子參與的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病,Ghafouri等[12]、Irander等[13]學(xué)者通過收集變應(yīng)性鼻炎及健康人群的鼻腔灌洗液分析差異表達基因,發(fā)現(xiàn)PLUNC基因在變應(yīng)鼻炎患者中表達下調(diào)。而本研究中首次采取收集變應(yīng)性鼻炎及健康人群血液標(biāo)本,從全血中提取RNA,通過QPCR得出PLUNC基因在變應(yīng)性鼻炎患者中的相對表達量明顯低于健康對照組(P=0.000),與前期學(xué)者報道結(jié)果相符。且血標(biāo)本可在進行專項變應(yīng)原篩查時一并抽取,臨床上比收集鼻腔灌洗液方便,執(zhí)行性強,有利于今后的進一步推廣。

變應(yīng)性鼻炎的發(fā)展過程受遺傳和環(huán)境因素共同影響,而基因多態(tài)性則可以上調(diào)或者下調(diào)變應(yīng)性鼻炎的易感性,這也造成了不同個體在臨床癥狀和治療效果、轉(zhuǎn)歸之間存在多樣化、差異性[14]。我們的前期研究顯示,在PLUNC基因啟動子區(qū)的多態(tài)位點C-1888T可以影響該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能,進而引起對鼻咽癌易感性/風(fēng)險上升[15],而此項研究首次表明該多態(tài)位點也和變應(yīng)性鼻炎的易感性顯著相關(guān)。在健康對照組中,多態(tài)位點C-1888T基因型以CT型居多,但在變應(yīng)性鼻炎組中TT型比率卻顯著上升,兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。QPCR結(jié)果提示,在變應(yīng)性鼻炎患者該位點的3種基因型中,TT型PLUNC基因相對表達量明顯下降,較健康對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而CT型和CC型相對表達量與健康對照無明顯差異?；蛐秃偷任换蝾l率資料表明,TT基因型和T等位基因分別使變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生率提高了9.375倍和3.903倍,這些結(jié)果提示T等位基因增加了變應(yīng)性鼻炎的易感性。

我們注意到,Irander等[13]發(fā)現(xiàn)PLUNC基因在持續(xù)性鼻炎患者鼻腔灌洗液中表達水平低于健康人群,可對于目前未暴露于變應(yīng)原下的間歇性變應(yīng)性鼻炎患者,PLUNC基因表達水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但如果加入吸煙這個變量因素,不論是持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎還是間歇性鼻炎,吸煙者PLUNC基因表達水平均低于不吸煙者。所以PLUNC表達水平可受變應(yīng)性鼻炎不同時期狀態(tài)、是否暴露于致敏和理化刺激因素等影響,這種表達變化是否會影響疾病的易感性?目前并無相關(guān)研究,且其他變態(tài)反應(yīng)性疾患中亦無經(jīng)驗可循。其次,本次研究對象來源與廣西地區(qū),廣西民族以壯族人群為主,雖實驗前已驗證PLUNC基因的C-1888T位點基因型在研究人群中分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,試驗組和對照組民族資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但我們此次研究并沒有進一步深入對比該基因位點在不同民族中的表型差異。這些都是作為我們下一個課題研究的重要方向,將各種參雜因素細化、深入的分類剖析,增大樣本量,進行多族群、多種族、多地域群體的檢測,有助于更加全面的闡述PLUNC基因多態(tài)性、易感性與變應(yīng)性鼻炎的相關(guān)性。

綜上所述,由于PLUNC基因在變應(yīng)性鼻炎患者中表達下調(diào), C-1888T位點的單核苷酸多態(tài)性也和變應(yīng)性鼻炎存在著明顯相關(guān)性,TT基因型和T等位基因為易感性因素。針對該位點的生物學(xué)功能,推測可能機理為通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,從而改變蛋白產(chǎn)物,引起信號通路異常,最終引發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)于PLUNC基因C-1888T位點與變應(yīng)性疾病易感性關(guān)聯(lián)的研究,開辟了探索變應(yīng)性疾病分子生物學(xué)發(fā)病機制的新途徑。

利益相關(guān)聲明:本研究不存在研究者與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻說明:王瑢負責(zé)提出研究選題、設(shè)計研究方案、實施研究過程和分析數(shù)據(jù);王瑢、張少杰負責(zé)起草論文、修訂論文;佘志強負責(zé)調(diào)研整理文獻、采集整理數(shù)據(jù)。