柳雷振,鄭 卓, 王世偉,高騰云,劉深賀

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,河南省家畜營養(yǎng)調(diào)控與生態(tài)養(yǎng)殖國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046)

溫濕度指數(shù)(Temperature-Humidity Index, THI)是衡量家畜受環(huán)境溫濕度影響程度的常用指標(biāo)[1],當(dāng)THI>72時(shí),牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)[2]。熱應(yīng)激影響種公牛的性欲,造成精液品質(zhì)下降,受胎率下降[3]。關(guān)于緩解奶牛熱應(yīng)激的措施,已有較多研究報(bào)道,但關(guān)于如何減緩熱應(yīng)激對兼用型牛的影響的研究,報(bào)道較少[4]。本研究通過比較熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激條件下西門塔爾種公牛的生理常值和血液生理生化指標(biāo),解析熱應(yīng)激影響西門塔爾種公牛精液品質(zhì)的機(jī)制,并篩選出評價(jià)西門塔爾種公牛熱應(yīng)激程度的參考指標(biāo),為耐熱公牛篩選和耐熱分子機(jī)制的解析奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于5月和7月在位于河南省中牟縣的鼎元種牛育種有限公司種牛場內(nèi)開展。

1.2 試驗(yàn)動物

選擇年齡2～5歲、體重相近、健康狀況良好且正常采精的西門塔爾種公牛34頭。飼喂相同的基礎(chǔ)日糧并自由飲水。

1.3 樣品采集和指標(biāo)測定

距離地面1.5 m處安裝溫濕度儀,每間隔1 h自動測定和記錄一次。

采用Ingraham[5]的公式計(jì)算THI值:

THI(%)=(1.8×T+32)-0.55×(1-RH)×(1.8×T-26)

其中T是攝氏溫度,RH是相對濕度。

1.3.1 生理指標(biāo)的測定 在試驗(yàn)期間,每天中午12:00使用獸用體溫計(jì)測定公牛直腸溫度;每天14:00使用計(jì)數(shù)器測定公牛呼吸頻率(1次起伏記錄為1次呼吸),連續(xù)記錄3 min并求其平均值。

1.3.2 血液參數(shù)的測定 分別在5月份試驗(yàn)開展第3天和7月份試驗(yàn)最后1 d的上午08:00對所有試驗(yàn)牛進(jìn)行頸靜脈采血。使用真空采血管(EDTA抗凝管)采集血液樣本10 mL,采集后進(jìn)行離心,3000 r/min離心10 min,取上清液分裝至離心管中,-20 ℃冷凍保存。采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA試劑盒)對三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、睪酮(T)、皮質(zhì)醇(CoR)、熱休克蛋白HSP70和HSP90進(jìn)行測定。

1.3.3 精液品質(zhì)的檢測 射精量:采用假陰道法采集鮮精,采精員將假陰道豎起,使精液充分地流入集精管內(nèi),然后取下集精管,迅速轉(zhuǎn)移至精液處理室,記錄射精量。

精子密度:取40 μL新鮮精液,加3 960 μL稀釋液,稀釋后采用全自動密度儀測定;

精子活力:取5～10 μL新鮮精液置于載玻片上,環(huán)境溫度或載物臺溫度保持在37～38 ℃,蓋上蓋玻片后立即在200和400倍顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,使用SPSS 26.0軟件中的配對樣本T檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并對熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激期間生理常值、血清生化指標(biāo)和精液品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種公牛牛舍溫濕度

分別在5月份和7月份期間連續(xù)記錄牛舍溫濕度18 d,結(jié)果顯示,試驗(yàn)期間5月份THI變化范圍為60.08～70.46,平均THI=66.67±0.91;7月份THI變化范圍為73.18～87.71,平均THI=80.10±1.13,牛舍THI值隨著時(shí)間的推移逐漸增加(表1)。表明試驗(yàn)牛在5月份處于非熱應(yīng)激狀態(tài),在7月份處于熱應(yīng)激環(huán)境狀態(tài)。

表1 牛舍5月份和7月份的溫濕度Table 1 The temperature and humidity of the cattle house in May and July

2.2 熱應(yīng)激環(huán)境對西門塔爾種公牛生理指標(biāo)的影響

與非熱應(yīng)激環(huán)境下試驗(yàn)牛的呼吸頻率(34.7±0.8 breaths·min-1)和直腸溫度(38.6±0.02 ℃)相比,熱應(yīng)激環(huán)境下試驗(yàn)牛的呼吸頻率(43.4±1.0 breaths·min-1)和直腸溫度(38.8±0.02 ℃)極顯著升高(P<0.01);呼吸頻率和直腸溫度隨著THI的升高整體有上升的趨勢,非熱應(yīng)激環(huán)境下試驗(yàn)牛的呼吸頻率和直腸溫度隨THI的升高有窄幅上升;熱應(yīng)激環(huán)境下試驗(yàn)牛的呼吸頻率和直腸溫度隨THI的升高有大幅上升(圖1和表2)。表明試驗(yàn)牛在7月份時(shí)處于熱應(yīng)激狀態(tài)。

圖1 呼吸頻率(左)和直腸溫度(右)隨THI的變化趨勢圖Fig. 1 Respiratory rate and rectal temperature variation trend with THI

表2 種公牛在非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激時(shí)的呼吸頻率和直腸溫度Table 2 Respiratory rate and rectal temperature of bulls in non-heat stress and heat stress

2.3 熱應(yīng)激對西門塔爾種公牛血液生化指標(biāo)的影響

如表3所示,熱應(yīng)激時(shí)試驗(yàn)牛CoR、T3、T4以及HSP70含量和非熱應(yīng)激時(shí)相比差異極顯著(P<0.01),皮質(zhì)醇和HSP70含量極顯著上升(P<0.01),CoR含量上升30.81%,HSP70含量上升16.41%;T3和T4含量極顯著降低(P<0.01),T3含量下降了14.77%,T4含量下降了24.04%;睪酮和HSP90含量沒有顯著差異。

表3 種公牛在非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激時(shí)血液參數(shù)指標(biāo)的變化Table 3 Changes in blood parameters of bulls under non-heat stress and heat stress

2.4 熱應(yīng)激對種公牛精液品質(zhì)的影響

在5月份非熱應(yīng)激和7月份熱應(yīng)激狀態(tài)下,各測定了20 d試驗(yàn)牛的射精量、精子密度、精子活力指標(biāo),結(jié)果見表4。熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激時(shí)相比,精子活力極顯著降低(P<0.01),降低了55.6%;精子密度顯著降低,每毫升下降2.01×108;射精量無顯著性差異(P>0.05)。

表4 非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激狀態(tài)下精液指標(biāo)的差異Table 4 Differences in semen indexes between non-heat stress and heat stress

2.5 非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激期間各項(xiàng)指標(biāo)間的相關(guān)性

由圖2可知,RR、RT、CoR、HSP70與THI呈極顯著正相關(guān)(P<0.05),T3、T4與THI呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);THI、RR、RT、CoR、HSP70與精子活力呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),T3、T4與精子活力呈極顯著正相關(guān)(P<0.05);血清睪酮、射精量、精子密度和各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

圖2 非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激期間各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001Fig. 2 Correlation analysis of various indicators during non-heat stress and heat stress* represents P<0.05,** represents P<0.01,*** represents P<0.001

3 討 論

3.1 熱應(yīng)激對生理生化指標(biāo)、精液品質(zhì)的影響

THI是綜合環(huán)境溫濕度來判斷熱應(yīng)激狀態(tài)的常用環(huán)境參數(shù)。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)THI<72時(shí),肉牛無應(yīng)激反應(yīng);當(dāng)7390時(shí),肉牛正在遭受重度熱應(yīng)激,嚴(yán)重時(shí)可能引起死亡[2]。李付娟等[4]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)THI達(dá)到72以上時(shí),種公牛采食量降低、射精量減少、精子密度及活力降低,造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)夏季THI>73時(shí),初步判定試驗(yàn)牛已受到熱應(yīng)激的作用,其射精量無顯著變化,精子密度和精子活力等生產(chǎn)性能降低,機(jī)體處于熱應(yīng)激狀態(tài)。在熱應(yīng)激環(huán)境下,射精量所受影響的結(jié)果不盡一致。張顯華等[6]對北京市種公牛站公牛的研究表明,氣溫的變化對采精量的影響不大,這可能是因?yàn)榫影l(fā)生主要受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié),而氣象因子僅起約30%的作用。因此,當(dāng)熱應(yīng)激時(shí)間較短或強(qiáng)度較小時(shí),很可能對射精量的影響不顯著[7]。這也就解釋了試驗(yàn)牛熱應(yīng)激時(shí)射精量無顯著變化的原因。在熱應(yīng)激的作用下,種公牛的精液品質(zhì)和受精率下降[8]。熱應(yīng)激影響機(jī)體內(nèi)分泌水平,通過下丘腦-垂體-睪丸軸,使雄性激素睪酮分泌減少,生殖功能下降,甚至導(dǎo)致不孕[9]。本研究中,試驗(yàn)牛熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激時(shí)相比,血清睪酮含量無顯著差異,精子活力顯著降低,可能是試驗(yàn)牛熱應(yīng)激時(shí)附睪中精子代謝加強(qiáng),消耗大量的代謝物質(zhì),導(dǎo)致精子外排后活力明顯降低,或直接影響了種公牛的睪丸,從而影響精子發(fā)生過程,此過程嚴(yán)重時(shí)會造成永久性的繁殖障礙[9]。

動物的RR和RT被認(rèn)為是評價(jià)熱應(yīng)激的良好指標(biāo)[10]。血液在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中有重要作用,機(jī)體中各種代謝反應(yīng),神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)都需要血液的參與,所以血液中的生化指標(biāo)也可以反映出肉牛的熱應(yīng)激狀態(tài)[11]。許紅喜等[12]根據(jù)婆羅門公牛不同季節(jié)生理、激素和毛發(fā)特征來評估婆羅門公牛的適應(yīng)性反應(yīng)。使用RR、RT等生理指標(biāo),T3、T4、CoR等血清激素指標(biāo),被毛厚度等毛發(fā)指標(biāo)對熱應(yīng)激程度進(jìn)行評估。Kamal[13]研究表明, 美國荷斯坦牛和水牛在發(fā)生熱應(yīng)激后,血清中T3含量在72 h時(shí)降到機(jī)體最低水平。T3和T4的分泌量減少被認(rèn)為是動物努力減少體熱的產(chǎn)生和積累所導(dǎo)致的,對保持機(jī)體熱量平衡起作用[14-15]。宋小珍等[16]報(bào)道,錦江黃牛在熱應(yīng)激期第20、40、60天時(shí)血清中的T3含量比非熱應(yīng)激時(shí)分別下降了15.65%、23.48%和37.39%。因此,種公牛為防止夏季過分產(chǎn)熱,降低代謝率,必須通過內(nèi)分泌途徑減少產(chǎn)熱,使甲狀腺機(jī)能減弱,血清T3、T4水平的下降正是這種調(diào)節(jié)的表現(xiàn),這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。Lan等[13]研究表明,將未懷孕的雌性水牛暴露在42.1 ℃的高溫環(huán)境中2～3 h,其血漿CoR含量迅速上升,30 min后開始緩慢下降。本研究中試驗(yàn)牛熱應(yīng)激時(shí)CoR顯著增加,CoR增加有利于修復(fù)熱應(yīng)激造成的組織損傷,而且CoR的增加是應(yīng)激反應(yīng)最重要的特征。HSP70在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較低或者不表達(dá),但是在熱應(yīng)激或者其它應(yīng)激源的作用下,表達(dá)量迅速增加。Liu等[17]研究表明,隨著溫濕度指數(shù)升高,HSP70表達(dá)量呈上升趨勢,高溫期奶牛的外周血淋巴細(xì)胞HSP70表達(dá)豐度極顯著高于臨界高溫期和適溫期(P<0.01),且與奶牛的耐熱指標(biāo)具有一定的遺傳相關(guān),表明HSP70可以作為奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)的候選基因。對種公牛而言,HSP70在整個(gè)精子發(fā)生過程中不僅起到保護(hù)的作用,而且參與熱損傷蛋白的修復(fù),減少熱應(yīng)激對精子發(fā)生的破壞作用,對精子發(fā)生至關(guān)重要。

3.2 生理常值、血液參數(shù)和精液品質(zhì)的相關(guān)性

鐘代彬等[18]研究了環(huán)境溫濕度對種公牛健康及精液品質(zhì)的影響。李俊杰等[19]研究了不同季節(jié)肉用種公牛精液品質(zhì)與生理常值、血清及精清生化指標(biāo)相關(guān)關(guān)系,結(jié)果表明,呼吸頻率、直腸溫度與血清皮質(zhì)醇、三碘甲狀腺原氨酸均呈顯著負(fù)相關(guān)。史彬林等[20]認(rèn)為可將直腸溫度和呼吸頻率作為評定奶牛耐熱性指標(biāo)。本研究對生理常值、血液參數(shù)和精液品質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)性分析,表明各項(xiàng)指標(biāo)和射精量、精子密度間均無顯著相關(guān)性;呼吸頻率、直腸溫度與精子活力呈極顯著負(fù)相關(guān);皮質(zhì)醇、HSP70與精子活力呈顯著負(fù)相關(guān);甲狀腺素與精子活力呈極顯著正相關(guān);三碘甲狀腺原氨酸與精子活力呈顯著正相關(guān)。熱應(yīng)激造成機(jī)體血清T3、T4、CoR含量的降低,機(jī)體糖類吸收與利用以及脂肪的分解率降低,可能與熱應(yīng)激導(dǎo)致精液品質(zhì)降低,生精過程缺失大量的營養(yǎng)和代謝物有關(guān)。培育抗熱應(yīng)激種公牛新品系,從遺傳本質(zhì)上解決種公牛熱應(yīng)激問題是最具前景的方案[21]。本研究通過熱應(yīng)激對生理常值、血清生化指標(biāo)和精液指標(biāo)造成的變化以及相關(guān)性分析,認(rèn)為生理指標(biāo)(RR、RT),血液生理生化指標(biāo)(T3、T4、CoR、HSP70含量)的變化可作為種公牛是否發(fā)生熱應(yīng)激的參考指標(biāo),亦可作為篩選耐熱性種公牛的參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

在夏季高溫引起的熱應(yīng)激條件下,西門塔爾種公牛的RR和RT升高,血清中T3、T4含量及精子密度和精子活力降低,CoR和HSP70含量增加可能是引起精液品質(zhì)下降的原因。RR、RT、CoR、HSP70與精子活力呈極顯著負(fù)相關(guān),T3、T4與精子活力呈極顯著正相關(guān)。生理常值RR和RT,血清生化指標(biāo)T3、T4、CoR和HSP70可以作為評估西門塔爾種公牛遭受熱應(yīng)激的參考指標(biāo)。