張瀟,周海旭,高晗,賈亞茹

（1.河南科技學院食品學院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.漯河食品職業(yè)學院,河南 漯河 462300）

紫甘藍又稱紫卷心菜,屬十字花科（Cmciferae）,具有色彩靚麗、營養(yǎng)豐富、生長期短、產(chǎn)量大、適應性強等優(yōu)點,世界各地均有種植[1].但因其含水量高、貯存期短、易腐爛變質(zhì)而造成資源浪費.研究表明,紫甘藍中含有大量的多酚類物質(zhì),主要包括單寧、兒茶酚、原花青素、沒食子酸、類黃酮和多巴酚等成分[2],具有減緩衰老、抗腫瘤、解酒護肝、抗炎等功效[3-5],現(xiàn)已被廣泛應用于食品、化妝品、化工等領域[6-7].

目前,多酚提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等.傳統(tǒng)的溶劑提取法具有易操作、耗時長、效率低、占資源等特點[8].微波輔助提取法能迅速穿透萃取介質(zhì)轉(zhuǎn)化為熱能,使細胞內(nèi)部溫度快速上升,細胞內(nèi)部壓力超過耐受力而破裂,有效成分隨即流出.但與傳統(tǒng)溶劑提取法相比,其具有易操作、受熱均勻、節(jié)能省時等優(yōu)點.不過微波處理易導致熱敏感性物質(zhì)變性或失活,另外設備如果有泄漏將造成人體慢性損傷[9].超聲波輔助提取法是在機械、空化及熱效應作用下,促進組織細胞分裂,細胞壁破壞使細胞內(nèi)物質(zhì)完全釋放,可有效提高多酚提取率.此方法具有操作簡便、耗時短、損耗小、提取率高[10]等優(yōu)點.曹葉霞[11]采用超聲波輔助提取法從羅望子中提取總多酚，提取率為1.57%.采用超聲波輔助法提取紫甘藍中的多酚未見報道.因此,本文以紫甘藍為原料,在單因素基礎上采用正交試驗優(yōu)化超聲波輔助法提取多酚工藝,對其抗氧化活性進行初步研究,以期為紫甘藍中多酚的綜合利用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料紫甘藍購于新鄉(xiāng)市世紀華聯(lián)超市；沒食子酸、無水乙醇、福林酚、95%乙醇、DPPH 干粉、FeSO4粉末、H2O2溶液來自天津市科密歐化學試劑有限公司,均為AR.

1.1.2 主要設備S-JB21F 型攪拌機,安徽合肥榮事達有限公司；722 可見分光光度計,北京臺絲特科技有限公司；H165KR 型高速冷凍離心機,長沙翔宇科技有限公司；HB-W410 型電子恒溫水浴鍋,鄭州明途機械有限公司；UF2020 型分析天平,上海市圣匯儀器有限公司；DKG201-0 型電熱恒溫鼓風干燥箱,浙江紹興恒幸儀器有限公司；YSE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,廣東玉華儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 原材料加工工藝紫甘藍→清洗→剝?nèi)~→65 ℃烘干→粉碎→過篩（80 目）備用.

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 最佳乙醇料液比的確定在原材料加工工藝的基礎上,保持體積分數(shù)為50%乙醇溶液,超聲時間20 min,固定其他條件不變,選取料水比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL,通過多酚提取量測定分析,確定最佳乙醇料液比.

1.2.2.2 最佳超聲時間的確定在原材料加工工藝的基礎上,保持乙醇溶液料液比1∶30 mL,超聲時間20 min,其他條件固定不變,選取乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%,通過多酚提取量測定分析,確定最佳乙醇體積分數(shù).

1.2.2.3 最佳超聲時間的確定在原材料加工工藝的基礎上,保持乙醇溶液料液比1∶30 mL,乙醇體積分數(shù)65%,其他條件固定不變,選取超聲時間分別為10、20、30、40、50 min 通過多酚提取量測定分析,確定最佳超聲時間.

1.2.3 正交試驗優(yōu)化在單因素基礎上設置合理的參數(shù),分別選取料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間3 個因素,各因素進行3 水平即L9（33）正交試驗,由多酚提取量確定紫甘藍中多酚提取最佳提取工藝.

1.2.4 標準曲線的制作參照文獻[12]方法略作修改,稱取沒食子酸0.2 g,定容至100 mL,吸取1 mL 稀釋至100 mL,分別量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于容量瓶中,依次加入福林酚試劑2 mL,靜置反應3 min,加入2 mL 碳酸鈉（10%）,室溫下靜置1 h,蒸餾水定容至10 mL,制得沒食子酸含量分別為2、4、6、8、10 mg/L的溶液.用同法來配制所需空白試劑,測吸光值,對應波長為760 nm.以吸光值為（y）、沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為（x）繪制標準曲線.

1.2.5 紫甘藍中多酚提取量的測定取0.5 g 紫甘藍粉末加入乙醇溶液,進行超聲波處理,控制不同的單因素條件提取多酚.提取液4 000 r/min,15 min 離心取上清液,記錄其體積.將樣液稀釋100 倍,加入2 mL福林酚試劑,靜置反應3 min,加入2 mL 10%的Na2CO3溶液,室溫避光靜置1 h,蒸餾水定容至10 mL,混勻后測定吸光值,波長為760 nm,記錄測定結(jié)果.

1.2.6 樣品多酚類物質(zhì)提取量的計算

式（1）中：C/mg 為待測液中多酚類物質(zhì)的含量；V/mL 為提取液體積；N 為稀釋倍數(shù)；W/g 為樣品的質(zhì)量.

1.2.7 DPPH·清除能力的測定根據(jù)參考文獻[13]略作修改.取2 mL 不同質(zhì)量濃度的多酚提取液,加入2 mL DPPH（0.2 mmol/L）混合后,置于室溫避光的條件下反應30 min,波長為517 nm,測定吸光值,同時用VC做陽性對照.

根據(jù)式（2）計算,并繪制所需曲線

式（2）中：A1為樣品吸光值,A2為樣品本底吸光值,A0為空白對照吸光值.

1.2.8 OH 清除能力的測定測定方法根據(jù)參考文獻[14]略作修改.取2 mL 質(zhì)量濃度不同的多酚溶液,依次加入2 mL FeSO2（0.45 mmol/L）溶液,2 mL H2O2（4.4 mmol/L）溶液,靜置反應10 min,加入2 mL 水楊酸-乙醇（4.5 mmol/L）溶液,置于37 ℃的水浴中放置30 min；波長為510 nm,測定吸光值,用VC做陽性對照.

式（3）中：A1為樣品吸光值,A2為樣品本底吸光值,A0為空白對照吸光值.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 和orgin 6.0 對數(shù)據(jù)進行分析,每組試驗重復3 次,確保結(jié)果有效性.

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

福林酚試劑氧化多酚中的-OH 基團并使其顯藍色,藍色的深淺與多酚的含量成正相關[15].如圖1 所示,得到?jīng)]食子酸含量在2～10 μg 范圍內(nèi)的標準曲線方程為：y=0.084 7x+0.031 8,R2=0.999 6,說明該模型具有良好的線性關系,其中x/μg 為沒食子酸含量,y 為吸光度.

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 料液比對紫甘藍中多酚類物質(zhì)提取量的影響

如圖2 所示,多酚在溶液中的質(zhì)量濃度差異主要來源于料液比的影響,質(zhì)量濃度差異越大,提取的推動力越強,萃取速度越快.

圖2 不同料液比對紫甘藍中多酚提取量的影響Fig.2 Effects of different ratios of solid and liquid on the extraction amount of polyphenol in Purple Cabbage

由圖2 可以看出,當料液比在1∶10～1∶30 g/mL 范圍內(nèi)多酚提取量逐步呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,料液比為1∶25 g/mL 時多酚含量最高.

2.3 乙醇體積分數(shù)對紫甘藍中多酚提取量的影響

如圖3 所示,植物內(nèi)所含的大量多酚羥基極性較強,多酚以氫鍵的形式與細胞內(nèi)其他化合物相結(jié)合[16].

圖3 乙醇體積分數(shù)對紫甘藍中多酚提取量的影響Fig.3 Effects of ethanol volume fractions on the extraction amount of polyphenol from Purple Cabbage

由圖3 可以看出,根據(jù)相似相溶原理,乙醇體積分數(shù)對紫甘藍中多酚的溶解具有較強的促進作用[17].乙醇體積分數(shù)在30%～70%范圍內(nèi),紫甘藍中多酚提取量呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢,當乙醇體積分數(shù)為60%時,其多酚含量最高.

2.4 超聲時間對紫甘藍中多酚提取量的影響

如圖4 所示,在超聲波機械、空化及熱效應下,促進了組織和細胞分裂,細胞壁破壞使細胞內(nèi)物質(zhì)完全釋放[18].如圖4 可以看出,超聲時間在10～50 min 范圍內(nèi),紫甘藍中多酚提取量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢,當超聲時間為20 min 時,其多酚含量達到最高值.

圖4 超聲時間對紫甘藍多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on the extraction Amount of polyphenol from Purple Cabbage

2.5 正交試驗優(yōu)化提取條件

為獲得香菇多糖提取的最佳工藝條件,在上述探索性試驗的基礎上,選用3 因素3 水平L9（33）正交試驗,考察超聲時間、乙醇體積分數(shù)、料液比對香菇多糖提取率的影響,篩選出所需的最佳提取組合.正交試驗因素水平,如表1 所示.

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Level table of orthogonal experimental factors

由表1、2 可知,各因素對紫甘藍多酚提取率的影響具有一定差異,根據(jù)極差Ri可判斷影響紫甘藍多酚提取量的因素順序為A＞C＞B,即影響樣品中紫甘藍中多酚提取率的主要因素是超聲時間,可以得出最優(yōu)組合為A3B3C3,即當超聲時間為25 min,乙醇體積分數(shù)為65%,料液比為1∶30 g/mL 時,紫甘藍多酚提取量最大.

2.6 最優(yōu)組合的驗證

為驗證紫甘藍中多酚提取最優(yōu)組合A3B3C3,對該組合進行5 次平行試驗驗證,試驗結(jié)果分別為18.81%、18.86%、18.73%、18.78%、18.70%,平均值為18.776%,表2 中的提取值基本一致,表明該組合為最優(yōu)組合.

表2 正交試驗的數(shù)據(jù)與分析Tab.2 Data and analysis of orthogonal experiment

2.7 紫甘藍多酚的抗氧化活性研究

2.7.1 DPPH·自由基清除能力的測定多酚與DPPH·自由基中的單一電子配對,DPPH·醇溶液在517 nm條件下有吸收峰,其顏色變化程度與多糖的質(zhì)量濃度呈正相關性[19],如圖5 所示.

圖5 紫甘藍多酚類物質(zhì)對DPPH·的清除能力Fig.5 DPPH·scavenging activity of polyphenols in Purple cabbage

由圖5 可以看出,樣液質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL 范圍內(nèi),對DPPH·清除率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,當質(zhì)量濃度為60 μg/mL 時,清除率達到90.64%.

2.7.2·OH 清除能力的測定·OH 自由基是探究抗氧化活性的一個重要指標,它是一種活性極強的自由基,通過紫甘藍中多酚類物質(zhì)清除自由基的能力,可判斷其是否具有抗氧化活性,如圖6 所示.

圖6 紫甘藍多酚類物質(zhì)對·OH 的清除能力Fig.6 Scavenging ability of purple cabbage polyphenols on·OH

由圖6 可以看出,質(zhì)量濃度在50～300 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐步升高的變化趨勢,紫甘藍中多酚比對照物VC具有更強的清除作用,并高于同等質(zhì)量濃度下VC對·OH 的清除能力.當紫甘藍中多酚質(zhì)量濃度為300 μg/mL 時,清除率達到75.21%.

3 小結(jié)

本研究以紫甘藍為材料,通過單因素結(jié)合正交試驗,在超聲波輔助條件下,以超聲時間、乙醇體積分數(shù)、料液比為影響因素,對紫甘藍中多酚類物質(zhì)提取工藝及抗氧化活性進行了研究,每組試驗進行三次重復.

提取工藝優(yōu)化結(jié)果表明：①當料液比為1∶30 g/mL,乙醇體積分數(shù)為65%,超聲時間為25 min 時,提取效果最佳,多酚提取量可達18.78 mg/g.在三個因素中超聲時間對多酚提取率的影響最大,其次是料液比,次之為乙醇體積分數(shù).②抗氧化試驗表明：紫甘藍中多酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化能力,當多酚質(zhì)量濃度為60 μg/mL 時,對DPPH·的清除率達到了90.64%；當多酚質(zhì)量濃度為300 μg/mL 時,對·OH 清除率達到75.21%.