趙倩倩，孫之，潘月眉，胡雪雪，王傳璽

0 引言

肺癌是全世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占85%。晚期NSCLC治療通常包括化療、放療，以及目前新興的免疫治療和靶向治療等[2]，其中，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）旨在增強免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來，免疫治療在晚期NSCLC中得到了廣泛的應(yīng)用，其效果在腫瘤早期治療中可謂鼓舞人心，但總有效率僅有20%，主要是因為腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）之間的免疫調(diào)節(jié)相互作用，共同介導(dǎo)腫瘤的免疫耐受，從而影響對免疫治療的陽性反應(yīng)。鐵死亡作為一種新的細(xì)胞死亡形式，在許多疾病中起著重要作用，特別是影響腫瘤的惡性進展和抗腫瘤治療[3]。研究表明，靶向鐵死亡有望提高抗腫瘤免疫治療的療效，提示鐵死亡與免疫治療之間存在潛在的關(guān)系。因此，本文擬對鐵死亡在晚期NSCLC免疫治療及免疫治療耐藥中的作用及研究進展進行綜述，為后續(xù)研究提供參考和提示。

1 鐵死亡

鐵死亡是Dixon在2012年首次提出的一種新的調(diào)控性細(xì)胞死亡方式。與自噬和凋亡不同，鐵死亡是一種依賴鐵和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的細(xì)胞死亡[4]，其特征主要是細(xì)胞學(xué)變化，包括線粒體嵴減少或消失，線粒體外膜破裂，線粒體膜濃縮。鐵死亡受多種細(xì)胞代謝途徑調(diào)控，包括氧化還原穩(wěn)態(tài)、鐵穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝等，見表1。

表1 鐵死亡調(diào)控途徑及分子的具體作用Table 1 Specific roles of ferroptosis regulatory pathways and molecules

1.1 氧化還原穩(wěn)態(tài)途徑

氧化還原穩(wěn)態(tài)經(jīng)典通路為SLC7A11-GPX4。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是一種硒蛋白，使用GSH作為必需的輔因子，可以減少細(xì)胞膜中的過氧化氫[5]，是鐵死亡的關(guān)鍵抑制劑。胞膜上的谷氨酸/半胱氨酸反向轉(zhuǎn)運體（systemXc-）將半胱氨酸與谷氨酸以1:1的比例轉(zhuǎn)運，半胱氨酸轉(zhuǎn)運進入細(xì)胞內(nèi)，繼而在細(xì)胞內(nèi)合成谷胱甘肽（GSH）[6-7]。GSH可通過GPX4轉(zhuǎn)化為氧化谷胱甘肽（GSSG），恢復(fù)活性氧和活性氮，從而限制脂質(zhì)過氧化在膜內(nèi)的擴散，緩解鐵死亡引起的氧化應(yīng)激損傷。

最近的研究表明，F(xiàn)SP1-CoQ是一種與GPX4途徑平行的抗氧化系統(tǒng)[8]，僅作用于GPX4耗盡的細(xì)胞。FSP1是一種氧化還原酶，通過n端肉豆蔻?；荒技劫|(zhì)膜上，將泛醌（CoQ10）還原為親脂性自由基清除劑泛醇（CoQ10H2），從而限制脂質(zhì)過氧化物（ROS）在沒有GPX4的情況下在膜上的積累[8]。CoQ10是甲羥戊酸代謝途徑的產(chǎn)物之一，抑制甲羥戊酸代謝途徑會誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。

1.2 鐵代謝途徑

鐵是生命體中不可缺少的微量元素，游離亞鐵離子（Fe2+）是鐵死亡的主角。細(xì)胞內(nèi)過量的亞鐵離子會發(fā)生Fenton反應(yīng)，導(dǎo)致ROS積累，ROS可被多不飽和脂肪酸（PUFA）氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物大量積累，從而造成DNA損傷[4]。當(dāng)體內(nèi)Fe2+過載，超過了鐵蛋白的緩沖能力，核受體共激活因子4（NCOA4）與鐵蛋白重鏈FTH1形成鐵蛋白復(fù)合物，靶向溶酶體進行“鐵蛋白自噬”，促進鐵蛋白降解[9]，F(xiàn)e2+被釋放出來，以游離形式存在于細(xì)胞內(nèi)。另外，進入細(xì)胞內(nèi)的二價鐵也被儲存在血紅素中，后者在血紅素加氧酶-1（HO-1）的催化下釋放Fe2+，在心肌細(xì)胞中積累并誘導(dǎo)鐵死亡[9]。核因子-紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）在接受外部刺激時從Keap1上解離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與啟動子區(qū)結(jié)合，并激活下游分子HO-1，介導(dǎo)鐵過載鐵死亡[10]。

1.3 脂質(zhì)代謝途徑

脂質(zhì)過氧化是鐵死亡發(fā)生的重要標(biāo)志，其通過以下途徑引起細(xì)胞損傷：首先，芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物與亞鐵粒子反應(yīng)產(chǎn)生ROS，加重了鐵死亡；其次，脂質(zhì)過氧化物的醛降解產(chǎn)物4-HNE和MDA產(chǎn)生細(xì)胞毒性；最后，過氧化物反應(yīng)干擾細(xì)胞膜的滲透性和流動性[11]。多不飽和脂肪酸（PUFAs）是脂質(zhì)過氧化的主要靶點之一，因此，脂質(zhì)分解代謝和合成代謝變化都影響脂質(zhì)過氧化，從而介導(dǎo)鐵死亡過程。鐵死亡過程中的脂質(zhì)過氧化需要酰基輔酶a合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）、溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（LPCAT3）和脂氧合酶（LOX）。ACSL4和LPCAT3將游離的長鏈多不飽和脂肪酸活化，促進溶血卵磷脂轉(zhuǎn)換為卵磷脂，參與氧化細(xì)胞膜磷脂質(zhì)的合成，進而介導(dǎo)鐵死亡過程[12]。另外，ACSL4將花生四烯酸輔酶A酯化成?；o酶A（coenzyme A, CoA），乙酰輔酶A羧化酶（ACC）直接從?；鵆oA合成PUFAs，促進鐵死亡的發(fā)生。

2 非小細(xì)胞肺癌免疫治療耐藥機制

2.1 腫瘤內(nèi)在因素所致免疫治療耐藥

ICIs治療的最主要機制為阻斷特定的免疫檢查點，使免疫細(xì)胞重新獲得識別腫瘤的能力，避免免疫逃逸。然而，在免疫治療過程中，由于補償效應(yīng)，其他免疫檢查點通路的表達會升高，進而引起治療耐藥。目前研究發(fā)現(xiàn)的替代免疫檢查點有T細(xì)胞免疫球蛋白-3（T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因-3分子（lymphocyte activating-3,LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）、T細(xì)胞活化的V結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白抑制劑（V-Set immunoregulatory receptor, VISTA）等[13]。它們在用抗PD-1或抗CTLA-4治療產(chǎn)生耐藥性的動物T細(xì)胞中高表達，利用上述替代免疫檢查點的抑制劑聯(lián)合治療時可以逆轉(zhuǎn)免疫治療耐藥的發(fā)生。

另外，腫瘤內(nèi)在因素所致免疫治療耐藥發(fā)生的原因還包括腫瘤免疫原性的喪失。目前已經(jīng)確定引起免疫原性喪失的原因，包括活化的絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、PTEN表達的缺失、WNT/β-catenin信號通路的表達、干擾素-γ信號通路的缺失[14]。腫瘤通過下調(diào)腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原的表達，導(dǎo)致T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor, TCR）無法對MHC分子特異性識別與結(jié)合，這些變化導(dǎo)致機體無法產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

2.2 腫瘤微環(huán)境所致免疫治療耐藥

TME主要由腫瘤細(xì)胞及其周圍的免疫和炎性反應(yīng)細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞和附近的間質(zhì)組織、微血管以及各種細(xì)胞因子和趨化因子構(gòu)成，是一個復(fù)雜的綜合系統(tǒng)，可以分成以免疫細(xì)胞為主的免疫微環(huán)境和成纖維細(xì)胞為主的非免疫微環(huán)境。當(dāng)TME中免疫抑制細(xì)胞增加、免疫毒性細(xì)胞缺失或功能失調(diào)將導(dǎo)致免疫治療耐藥。

2.2.1 TME中抑制性免疫細(xì)胞的浸潤 Tregs是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，通過抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)促進腫瘤進展。Tregs可以產(chǎn)生IL-10或IL-35，通過它們的相互作用促進CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的耗竭，從而限制了抗腫瘤免疫效應(yīng)[15]。大多數(shù)晚期惡性腫瘤患者中，髓系細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)化為骨髓衍生抑制性細(xì)胞（myeloidderived suppressor cells, MDSCs）從而起到免疫抑制的作用[16]。吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）是Tregs和MDSCs增殖/激活的重要啟動子[17]。另外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAMs）可分化為M1、M2型巨噬細(xì)胞。通過阻斷CSF1/CSF1R重編程TAMs，使TAM2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門AM1型，增強ICIs在胰腺癌中的療效[18]。

2.2.2 T細(xì)胞耗竭和T細(xì)胞功能異常 在腫瘤病程中，由于抗原的持續(xù)性刺激，CD8+T細(xì)胞逐漸分化為“耗竭”T細(xì)胞[19]，其特征是T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力降低、趨化因子表達增加、多種抑制性受體如PD-1、TIM-3、 LAG3、CTLA-4和TIGIT表達增加，即T細(xì)胞的效應(yīng)功能低下，因此對免疫治療產(chǎn)生耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，核受體亞家族4A組成員1（nuclear receptor subfamily 4 group a member 1,NR4A1）在調(diào)節(jié)誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭時發(fā)揮關(guān)鍵的作用。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，免疫耐受T細(xì)胞以及TME所有的耗竭T細(xì)胞都高表達轉(zhuǎn)錄因子NR4A1。

近日有研究在NSCLC腫瘤微環(huán)境（TME）中發(fā)現(xiàn)一種功能失調(diào)的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor infilter lymphocyte, TIL）亞群—Ebo CD8+TILs[21]，以PD通路依賴的方式在TME內(nèi)特異性擴展。Ebo CD8+ TILs具有很高的增殖特性，但也更傾向于凋亡。因為有過多不可恢復(fù)的凋亡TILs，可能與其他CD8+ TIL群體競爭空間和資源[20]，所以免疫治療可能對含有大量Ebo CD8+ TIL的T細(xì)胞炎性腫瘤效果差。

3 鐵死亡在非小細(xì)胞肺癌免疫治療中的作用

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，免疫治療與鐵死亡可以協(xié)同發(fā)揮作用，增強抗腫瘤治療效果?？筆D-L1抗體可促進腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化依賴的鐵死亡，而鐵死亡抑制劑Liproxstatin 1降低這些藥物的抗癌活性。此外，抗PD-L1抗體和鐵死亡激活劑（如erastin, RSL3和胱氨酸酶）在體外和體內(nèi)協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤生長抑制。鐵死亡可能通過各種途徑逆轉(zhuǎn)免疫耐藥，提高免疫治療療效。

3.1 鐵死亡激活腫瘤細(xì)胞本身免疫原性逆轉(zhuǎn)免疫耐藥

早期鐵死亡細(xì)胞釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）——三磷酸腺苷（ATP）和高遷移率基團盒（HMGB1），并促進骨髓來源的樹突狀細(xì)胞表型成熟。此外，研究發(fā)現(xiàn)在鐵死亡細(xì)胞表面表達“eat-me”信號-SAPE-OOH，SAPE-OOH的富集通過靶向巨噬細(xì)胞上的toll樣受體2促進吞噬作用[22]。綜上所述，在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)鐵死亡可能激活免疫原性來刺激抗腫瘤免疫，從而克服免疫治療耐藥性。

3.2 鐵死亡作用于免疫微環(huán)境抵抗免疫治療耐藥

GPX4可以保護調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）免于鐵死亡。GPX4缺陷的Tregs產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β，促進T輔助性17細(xì)胞反應(yīng)，從而增強抗腫瘤免疫。結(jié)果表明，通過抑制GPX4誘導(dǎo)Tregs鐵死亡可能逆轉(zhuǎn)免疫治療耐藥性。T細(xì)胞衍生的干擾素（IFN）γ與花生四烯酸（AA）聯(lián)合誘導(dǎo)免疫原性腫瘤鐵死亡，作為CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤殺傷的作用模式[23]。Jiang等在臨床前小鼠模型和患者中發(fā)現(xiàn)TYRO3高表達與抗PD-1/PD-L1免疫治療耐藥性相關(guān)[24]。TYRO3抑制腫瘤細(xì)胞鐵死亡，促進TAM1向TAM2極化。抑制TYRO3也引發(fā)鐵死亡和重編程TAMs，從而使癌細(xì)胞對免疫治療重新敏感。

3.3 聯(lián)合治療方案誘導(dǎo)NSCLC發(fā)生鐵死亡從而增強免疫治療療效

3.3.1 順鉑 在一線化療藥物中，順鉑可以殺死癌細(xì)胞，并觸發(fā)促炎介質(zhì)的釋放，增加腫瘤浸潤免疫細(xì)胞。有研究表明，相比單獨應(yīng)用erastin或順鉑，erastin聯(lián)合順鉑，可顯著增強抗腫瘤活性[25]。Zhou等研究表明，順鉑可促進腫瘤細(xì)胞鐵死亡，進而增強N1中性粒細(xì)胞極化。在TME中，N1極化中性粒細(xì)胞釋放趨化因子促進T細(xì)胞浸潤并促進Th1分化。CD8 T細(xì)胞作為抗腫瘤免疫最直接的效應(yīng)體，在N1型中性粒細(xì)胞或Th1細(xì)胞的相互作用下被激活，其浸潤和增殖能力明顯增強[26]。這與之前的研究結(jié)果一致，即鐵死亡介導(dǎo)的DAMPs可以與特定受體結(jié)合激活炎癥，并啟動免疫細(xì)胞招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，啟動促炎TME[27]。

3.3.2 放療 與既往傳統(tǒng)研究不同，最近研究發(fā)現(xiàn)，放療不僅可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，還可以誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡。ATM介導(dǎo)的SLC7A11表達下調(diào)是放療誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡的原因，在皮下腫瘤模型中，當(dāng)放療聯(lián)合ICIs時，這種抗癌作用得到增強。除了下調(diào)SLC7A11外，放療還上調(diào)ACSL4表達，增加了脂質(zhì)合成和隨后的氧化損傷，從而引起鐵死亡[28]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，CoQ-FSP1軸的藥理抑制通過誘導(dǎo)鐵死亡，使KEAP1缺陷的肺癌細(xì)胞或患者來源的異種移植腫瘤對放療敏感[29]。被照射的腫瘤細(xì)胞釋放的微粒具有進一步增強放療的能力，部分是通過傳播鐵死亡信號或增加與氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)表達。CD8+T細(xì)胞分泌的IFNγ被證明促進放療誘導(dǎo)的鐵死亡，這可能是由放療和IFNγ協(xié)同抑制SLC7A11表達引起的[30]。System Xc-的表達下調(diào)，減少了細(xì)胞對胱氨酸的攝取，從而導(dǎo)致GPX4合成底物谷胱甘肽的減少。因此，腫瘤細(xì)胞促進脂質(zhì)過氧化，最終引發(fā)鐵死亡。

3.3.3 新型納米材料 納米載體是一種新型的納米級藥物傳遞系統(tǒng)。納米載體因其尺寸合適、易修飾、靶向性強、細(xì)胞攝取高、生物相容性好等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于診斷和精準(zhǔn)治療藥物輸送，具有較好的療效和較少的不良反應(yīng)，提供了一種治療惡性腫瘤的新策略[31-32]。到目前為止，各種基因、小分子和納米材料已被闡明具有誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的能力，有望成為腫瘤治療中的潛在靶點。但是由于內(nèi)源性鐵的不足和半螺旋基因或分子試劑的缺乏并沒有提高芬頓反應(yīng)的效率，給腫瘤治療帶來實際的效益。在這種情況下，納米藥物的引入為開發(fā)新型腫瘤特異性鐵死亡誘導(dǎo)劑帶來了光明的前景。

Pa-M/Ti-NCs是由超順磁性和可控的Fe3O4納米團簇（NCS）為核心、N3覆蓋的白細(xì)胞膜為生物膜、膜內(nèi)裝載上TGF-β抑制劑（Ti）和膜外附著耦合的PD-1抗體（Pa）共同組成。Pa和Ti進入腫瘤后，共同創(chuàng)造免疫遺傳微環(huán)境，提高極化M1巨噬細(xì)胞內(nèi)H2O2的濃度，促進NCS釋放鐵離子的Fenton反應(yīng)。產(chǎn)生的羥基自由基（·OH）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，暴露的腫瘤抗原進一步增強了微環(huán)境的免疫原性[33]。

Hu等開發(fā)了外泌體樣納米囊泡（eNVs-FAP）作為一種易于制備和大量制備的腫瘤疫苗。eNVs-FAP疫苗通過誘導(dǎo)針對腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化蛋白-α（FAP）+癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的強特異性CTL免疫應(yīng)答，在結(jié)腸癌、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌模型中重新編程免疫抑制TME來抑制腫瘤生長。此外，eNVs-FAP疫苗激活的細(xì)胞免疫反應(yīng)可以通過從CTL釋放IFN-γ和消耗FAP+CAFs來促進腫瘤鐵死亡[34]。

另外，Liang等合成了超小單晶鐵納米顆粒（bcc-USINPs）。超薄的氧化鐵殼層可以使bcc-USINPs在儲存及正常生理環(huán)境中保持穩(wěn)定；而在腫瘤酸性微環(huán)境中快速蝕刻并暴露出Fe（0）核，使其恢復(fù)超高的Fenton催化活性；實現(xiàn)在較低濃度（IC50=15.72 μg/ml）作用下使腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫原性死亡。結(jié)合程序性死亡配體1（PD-L1）免疫檢查點阻斷免疫治療，iRGD-bcc-USINPs介導(dǎo)的鐵死亡治療可以極大地增強免疫反應(yīng)，形成強大的免疫記憶[35]。

葡萄糖氧化酶-聚陽離子-鐵納米偶聯(lián)物的納米材料利用葡萄糖氧化酶消耗葡萄糖產(chǎn)生饑餓效應(yīng)，并利用自激活級聯(lián)生物催化產(chǎn)生劇毒的羥基自由基進行癌癥治療。另外，使用該納米材料治療癌癥有效地觸發(fā)免疫原性細(xì)胞死亡程序，以增強免疫檢查點封鎖治療。鐵死亡可以增強免疫治療的抗癌效果[36]。

4 總結(jié)及展望

免疫治療由于其固有的耐藥性及獲得性耐藥，在晚期NSCLC中獲益仍較低。最近的鐵死亡研究使得人們關(guān)注其在抗免疫耐藥中的作用。本文綜述了鐵死亡在晚期非小細(xì)胞肺癌中臨床前研究中逆轉(zhuǎn)免疫治療耐藥的機制。然而，在實際應(yīng)用前還有很長的路要走。首先，很難確定鐵死亡誘導(dǎo)劑的逆轉(zhuǎn)耐藥作用是僅針對某些具有獨特特征的癌癥，還是普遍適用于大多數(shù)癌癥。考慮到腫瘤細(xì)胞系對鐵死亡誘導(dǎo)劑的敏感度差異很大，我們需要確定一個最可能從該策略中受益的適當(dāng)目標(biāo)人群，深入了解鐵死亡和耐藥性相關(guān)機制將有助于實現(xiàn)這一目標(biāo)。其次，在避免全身不良反應(yīng)的同時，開發(fā)誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡的特異性治療方法尤為重要。在這方面，納米顆粒鐵死亡誘導(dǎo)劑具有獨特的優(yōu)勢。最后，我們?nèi)狈υ隗w內(nèi)標(biāo)記鐵死亡的生物標(biāo)志物。探索合適的生物標(biāo)志物將促進進一步的體內(nèi)研究和臨床監(jiān)測的發(fā)展。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。