軒銀霜,李亞,卞晴晴,毛靜,李曉俊,李素云,4?

(1.河南中醫(yī)藥大學,鄭州 450046;2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室中藥藥理(呼吸)實驗室河南省呼吸病防治中醫(yī)藥重點實驗室,鄭州 450000;3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸科,鄭州 450000;4.河南中醫(yī)藥大學呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,鄭州 450046)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)作為一種全身性的疾病,其肺外常見并發(fā)癥有心血管疾病、糖尿病、骨骼肌功能障礙和腸道功能障礙等[1-3],其中腸道功能障礙的癥狀包括腹脹、食欲減退、便秘、腹瀉等[4-6],并進一步導致肺功能損害,影響疾病的預后。

COPD 與腸道功能障礙在病理上相關,主要表現(xiàn)在炎癥、免疫、缺氧、微生物失衡等方面[7-9],尤其在炎癥方面。前期臨床研究表明,調(diào)補肺腎三法可以提高COPD 患者肺通氣功能,改善臨床癥狀,并可降低血清白細胞介素(interleukin,IL)-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C-反應蛋白(CRP)水平,減輕炎癥反應[10]。動物實驗中也發(fā)現(xiàn),調(diào)補肺腎三法可以改善COPD 大鼠肺功能,減輕肺病理組織損傷,降低大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥指標,改善局部及系統(tǒng)性炎癥反應,且具有較明顯的遠后效應。研究還發(fā)現(xiàn)其對疾病所引起的食量與飲水量減少、形體消瘦、大便溏薄等胃腸道癥狀也具有改善作用[11-12],但是具體機制尚不清楚。因此,本研究采用病理學、免疫組化技術(shù)方法,觀察并檢測肺部與腸道炎癥介質(zhì)IL-6、IL-33 和干擾素(interferon,IFN)-γ 的表達,旨在探討調(diào)補肺腎三法對COPD 穩(wěn)定期大鼠肺與腸道炎癥指標的調(diào)控,從炎癥方面闡釋“肺與大腸相表里”的科學內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

60 只8 周齡的SPF 級SD 大鼠,雌雄各30 只,體重為(200 ± 20) g,購買于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司【SCXK(魯)20190003】,并在河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室飼養(yǎng)【SYXK(豫)2017-0001】,期間自由飲水、攝食,晝夜各半循環(huán)照明,相對濕度40%～ 70%,溫度21～ 25℃。實驗通過河南中醫(yī)藥大學的實驗動物倫理委員會批準(DWLL2019020002)。

1.1.2 藥物

脂 多 糖(LPS),美 國 Sigma 公 司,批 號:028M4094V;補肺健脾方(黃芪、白術(shù)、黨參、茯苓等),補肺益腎方(人參、山茱萸、黃芪、枸杞子等),益氣滋腎方(人參、麥冬、五味子、黃精等),來源于河南中醫(yī)藥大學藥學院的藥物分析實驗室;氨茶堿,海南制藥廠有限公司制藥一廠,批號:國藥準字H41020704。

1.1.3 主要試劑與儀器

紅旗渠香煙,河南中煙工業(yè)有限責任公司;IFNG Polyclonal Antibody,武漢Elabscience 公司,批號:E-AB-40075;HE 染色試劑盒(批號:G1120)、羊抗兔IgG-HRP(批號:SE134)、5% BSA 封閉液(批號:SW3015)、PBS 磷酸鹽緩沖液(批號:P1010),北京Solarbio 公司;0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(批號:AR0024)、Anti-IL-6 Antibody(批號:BA4339)、Anti-IL-33 Antibody(批號:M00113-2)、SABC 試劑盒(批號:SA1021)、3%過氧化氫(批號:AR1108)、中性樹膠(批號:AR0038),武漢BOSTER 公司。

獨立送風隔離籠具(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司,中國),OLYMPUS-DP70 型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(Olympus 公司,日本),DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司,中國),全自動生物組織脫水機、超低溫冰箱、生物組織石蠟包埋機(Thermo 公司,美國),RM2245 型切片機(LEICA 公司,德國)。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1 周,采用香煙煙霧暴露聯(lián)合LPS 滴注法建立COPD 穩(wěn)定期大鼠模型[13]:每天煙霧暴露2 次(煙熏箱煙霧濃度達到3000 ± 500 ppm),每次30 min;每周2 次將1 mg/kg 的LPS 滴入大鼠鼻腔,造模持續(xù)8 周。大鼠被隨機分為空白(Control) 組、COPD 模型(Model) 組、補肺健脾(Bufei Jianpi,BJ)組、補肺益腎(Bufei Yishen,BY)組、益 氣 滋 腎(Yiqi Zishen,ZS) 組、氨 茶 堿(aminophylline,Am)組,每組10 只,雌雄各半。第9～ 12 周,治療組分別給予補肺健脾方、補肺益腎方、益氣滋腎方、氨茶堿灌胃,劑量分別: 12.42 g/(kg·d)、11.61 g/(kg·d)、12.42 g/(kg·d)、27 mg/(kg·d),其余大鼠通過灌胃給予生理鹽水,每日2 次,每周給大鼠稱重以調(diào)整滴鼻及灌胃的劑量。藥物劑量的計算使用等效劑量換算公式[14]。

1.2.2 指標檢測

(1)大鼠一般情況

觀察所有大鼠每天精神狀態(tài)、皮毛光澤度及活動靈敏度、進食飼料量及大小便的情況,記錄每周的體重。

(2)大鼠肺組織與結(jié)腸組織形態(tài)學

將大鼠麻醉,先后取出結(jié)腸組織與肺組織,用中性甲醛進行固定,經(jīng)過石蠟包埋后切片,脫蠟后HE 染色,使用光鏡觀察組織的形態(tài)學變化。

(3)大鼠肺組織與結(jié)腸組織IL-6、IL-33 和IFNγ 蛋白水平

肺與結(jié)腸組織石蠟包埋后進行4 μm 切片,采用免疫組化試劑盒測定肺與結(jié)腸組織IL-6、IL-33 和IFN-γ 蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

用SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計分析。結(jié)果用平均值±標準差()表示。采用單因素方差分析進行計量資料的組間比較。方差齊使用最小顯著差法,方差不齊使用Dunnett’ sT3 法。采用Pearson 或Spearman 相關性分析,探討大鼠肺中炎癥介質(zhì)水平與腸道炎癥介質(zhì)水平的相關性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

Control 組大鼠狀態(tài)良好。Model 組大鼠皮毛枯黃雜亂、無光澤,行動遲緩,精神逐漸萎靡,偶有喘鳴音,食量減少,大便稀溏或干結(jié),消瘦。各治療組大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)、反應較靈敏,進食與體重增加,大便正常。

2.2 肺組織病理變化

Control 組大鼠支氣管管壁與肺泡結(jié)構(gòu)完整,黏膜上皮細胞整齊,偶有炎癥細胞。Model 組大鼠支氣管黏膜皺襞增多、變厚,管腔狹窄;肺泡壁斷裂形成大氣腔,支氣管與肺泡腔出現(xiàn)大量炎癥細胞及炎性滲出。各治療組支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)明顯恢復,炎癥細胞減少。見圖1。

2.3 結(jié)腸組織病理變化

Control 組大鼠結(jié)腸黏膜完整而連續(xù),未見炎癥細胞。Model 組大鼠結(jié)腸黏膜損傷,上皮細胞破損、脫落,杯狀細胞明顯減少,炎癥細胞浸潤增多。各治療組經(jīng)藥物干預后黏膜上皮恢復完整,偶有少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4 肺與結(jié)腸中IL-6 的變化

肺組織IL-6 主要表達于氣管與支氣管上皮細胞、炎癥細胞、小血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)中,結(jié)腸組織IL-6 主要表達于結(jié)腸吸收上皮細胞、固有層炎癥細胞、小血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)中。與Control 組比較,Model 組肺組織與結(jié)腸組織IL-6 陽性染色增強,各藥物干預組肺與結(jié)腸組織的IL-6 陽性表達均較Model 組有減少趨勢。見圖2A、2B。

圖2 各組大鼠肺組織與結(jié)腸組織IL-6 的表達變化(,n=6)Note.A,C.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IL-6 in lung tissue (light microscope).B,D.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IL-6 in colon tissue (light microscope).Brown yellow is positive expression.Compared with control group,?P <0.05,??P <0.01.Compared with Model group,#P <0.05,##P <0.01.Compared with BJ group,ΔP <0.05,ΔΔP <0.01.Compared with BY group,▲P <0.05.Compared with ZS group,□□P <0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Changes in levels of IL-6 in the lung and colon tissues of rats(,n=6)

Model 組肺組織IL-6(圖2C)和結(jié)腸組織IL-6(圖2D)與Control 組比較均明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與Model 組比較,各治療組上述指標均有不同程度降低,其中BY、ZS 和Am 組肺組織IL-6顯著降低(P<0.01),各治療組結(jié)腸組織IL-6 均明顯降低(P<0.05),且肺組織IL-6 在Am 組降低水平最為顯著,結(jié)腸組織IL-6 在BY 組降低水平最為顯著。Am 組肺組織IL-6 較各中藥組明顯降低(P<0.05,P<0.01)。BY 組肺組織IL-6 較BJ 組明顯降低(P<0.05)。各治療組間結(jié)腸組織IL-6 的變化無顯著性統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.5 肺與結(jié)腸中IL-33 的變化

肺組織IL-33 在氣管、支氣管上皮細胞、血管內(nèi)皮、炎癥細胞(以吞噬細胞為主)、環(huán)形平滑肌中均有表達,并主要以氣道上皮及其周圍浸潤的炎癥細胞為主,結(jié)腸組織IL-33 主要表達于結(jié)腸吸收上皮細胞的細胞質(zhì)、固有層炎癥細胞和部分黏膜肌層中,其中以吸收上皮細胞為主要表達部位。與Control 組比較,Model 組肺組織與結(jié)腸組織IL-33 陽性染色增強,各藥物干預組肺與結(jié)腸組織的IL-33陽性表達均較Model 組有減少趨勢。見圖3A,3B。

圖3 各組大鼠肺組織與結(jié)腸組織IL-33 的表達變化(, n=6)Note.A,C.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IL-33 in lung tissue (light microscope).B,D.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IL-33 in colon tissue (light microscope).Figure 3 Changes of IL-33 expression in lung and colon tissues of rats in each group (, n=6)

Model 組肺組織IL-33(圖3C)和結(jié)腸組織IL-33(圖3D)均較Control 組顯著升高(P<0.01)。與Model 組比,各治療組肺和結(jié)腸組織IL-33 均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。各治療組間肺組織IL-33和結(jié)腸組織IL-33 的變化無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 肺與結(jié)腸中IFN-γ 的變化

肺組織IFN-γ 主要表達于氣管、支氣管上皮細胞、氣管周圍炎癥細胞的細胞質(zhì)中,結(jié)腸組織IFN-γ主要表達于結(jié)腸吸收上皮細胞的細胞質(zhì)中。與Control 組比,Model 組肺組織與結(jié)腸組織IFN-γ 陽性染色明顯增強,各治療組肺組織與結(jié)腸組織IFN-γ陽性表達均較Model 組有減少趨勢。見圖4A,4B。

圖4 各組大鼠肺組織與結(jié)腸組織IFN-γ 的表達變化(, n=6)Note.A,C.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IFN-γ in lung tissue (light microscope).B,D.Immunohistochemical photos and semiquantitative analysis of IFN-γ in colon tissue (light microscope).Figure 4 Changes of IFN-γ expression in lung and colon tissues of rats in each group(, n=6)

Model 組肺組織IFN-γ(圖4C)和結(jié)腸組織IFN-γ(圖4D)與Control 組比較均明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與Model 組比較,各治療組上述指標均明顯降低(P<0.05,P<0.01),且肺組織IFN-γ 在Am 組降低水平最顯著,且結(jié)腸組織IFN-γ 在BJ 組降低水平最顯著。各治療組間肺組織IFN-γ 與結(jié)腸組織IFN-γ 的變化無顯著性統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.7 肺和結(jié)腸IL-6、IL-33 和IFN-γ 的相關性分析

大鼠肺IL-6 與結(jié)腸IL-6 水平呈正相關(P<0.01),肺IL-33 與結(jié)腸IL-33 水平呈正相關(P<0.05),肺IFN-γ 與結(jié)腸IFN-γ 水平呈正相關(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠肺和結(jié)腸IL-6、IL-33 和IFN-γ 的相關性()Table 1 Correlation between IL-6,IL-33 and IFN-γ in rat lung and colon ()

表1 大鼠肺和結(jié)腸IL-6、IL-33 和IFN-γ 的相關性()Table 1 Correlation between IL-6,IL-33 and IFN-γ in rat lung and colon ()

注:?說明相關性在P <0.05 水平;??說明相關性在P <0.01水平。Note.?Correlation is significant at the 0.05 level.??Correlation is significant at the 0.01 level.

3 討論

中醫(yī)學認為“肺與大腸相表里”,兩者在經(jīng)絡上相互絡屬,構(gòu)成表里關系。肺主一身之氣,肺氣肅降則氣機調(diào)暢,布散津液,有利于大腸的傳導;大腸為傳導之官,傳化物而不藏,傳導正常,有利于肺氣的肅降。反之,若肺病及腸,大腸傳導功能失常,濁氣壅阻,則出現(xiàn)腹脹、納差、便溏和便秘等癥狀,引起腸道的功能障礙。

課題組前期臨床證候研究表明,COPD 穩(wěn)定期有肺腎氣虛、肺脾氣虛及肺腎氣陰兩虛等常見證候[15-16],調(diào)補肺腎三方不僅能減輕COPD 肺與全身炎癥反應,還能明顯改善疾病引起的胃腸道癥狀。現(xiàn)代研究表明,COPD 與腸道功能障礙在炎癥、免疫、缺氧、微生物失衡等方面相關,尤其在炎癥方面。因此,本研究通過探討調(diào)補肺腎三法對COPD大鼠肺與腸道炎癥介質(zhì)的調(diào)控,從炎癥方面闡釋“肺與大腸相表里”的科學內(nèi)涵。

COPD 是慢性炎癥性疾病,患者肺部炎癥細胞釋放大量炎癥介質(zhì),溢出肺外引發(fā)全身炎癥[17]。腸道作為全身炎癥反應的靶器官,在各種感染、炎癥或者應激反應中,其結(jié)構(gòu)和功能極易受到影響。有研究表明,香煙煙霧暴露所致COPD 小鼠模型中,腸道的完整性受損,結(jié)腸促炎細胞因子表達增加,并可能誘發(fā)腸道炎癥性疾病[18]。本研究結(jié)果表明,COPD 大鼠支氣管黏膜皺襞增多明顯,管腔變窄,腔內(nèi)可見粘液栓及炎性滲出,管壁周圍可見大量炎性細胞浸潤。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡腔及肺泡間隔有較多炎性細胞浸潤。研究還發(fā)現(xiàn)大鼠同時出現(xiàn)了結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞,上皮細胞壞死脫落,黏膜大量炎癥細胞浸潤。調(diào)補肺腎三方治療后上述情況均明顯改善,支氣管、肺泡和結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)恢復,肺與腸道炎癥細胞浸潤減少。提示COPD 不僅存在肺部病變,其腸道也出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞和炎癥反應。調(diào)補肺腎三法不僅可以改善COPD 大鼠肺部炎癥,也能恢復其腸道結(jié)構(gòu),減輕其腸道炎癥反應。

炎癥介質(zhì)作為COPD 與腸道功能障礙在炎癥反應中聯(lián)系的關鍵點,在病情的發(fā)展及患者的預后中發(fā)揮重要作用。IFN、IL 作為較常見的細胞因子,具有介導炎癥反應的作用,尤其IL-6、IFN-γ、IL-33[19]。IL-6 是一種多效性細胞因子,主要由T 細胞和巨噬細胞在人體內(nèi)分泌,是COPD 炎癥小鼠模型中升高程度最高的細胞因子[20-21]。IFN-γ 主要由活化的淋巴細胞產(chǎn)生,作為Th1 型促炎癥細胞因子,IFN-γ 是先天性和適應性免疫的關鍵細胞因子,可調(diào)節(jié)上皮和內(nèi)皮屏障功能,在病毒和細菌病原體清除中起到中心作用[22-23]。IL-33 是IL-1 細胞因子家族新發(fā)現(xiàn)的成員,屬于Th2 型細胞因子,三者在肺部與腸道組織損傷和慢性炎癥中起關鍵作用[24-26]。

本實驗結(jié)果顯示,COPD 大鼠不僅肺組織IL-6、IL-33 和IFN-γ 顯著升高,結(jié)腸組織IL-6、IL-33 和IFN-γ 也明顯升高,提示COPD 對腸道功能的影響可能與炎癥因子有關。藥物干預后三者均有不同程度降低,其中BY、ZS 和Am 組肺組織IL-6 顯著降低,各治療組肺組織IL-33 和IFN-γ 均顯著降低,不僅如此,各干預組治療后結(jié)腸組織IL-6、IL-33 和IFN-γ 也明顯降低。提示調(diào)補肺腎三法不僅對肺部IL-6、IL-33 和IFN-γ 的表達有調(diào)節(jié)作用,還可以降低腸道中三者的釋放,進而改善腸道功能障礙。通過相關性分析,發(fā)現(xiàn)肺IL-6 與結(jié)腸IL-6 水平呈正相關,肺IL-33 與結(jié)腸IL-33 水平呈正相關,肺IFN-γ和結(jié)腸IFN-γ 水平呈正相關,說明肺部炎癥介質(zhì)水平越高,腸道炎癥介質(zhì)表達越多,肺部炎癥水平可影響腸道炎癥。炎癥介質(zhì)IL-6、IL-33 和IFN-γ 在COPD 與腸道功能障礙的病理與治療中的變化具有相關性,驗證了炎癥因子也可能是“肺與大腸相表里”的科學內(nèi)涵之一。

綜上所述,調(diào)補肺腎三法均可以改善慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期大鼠腸道功能障礙,其機制可能與抑制肺與結(jié)腸中IL-6、IL-33 和IFN-γ 的釋放,降低肺與腸道炎癥反應有關,這也進一步豐富了“肺與大腸相表里”理論的內(nèi)涵。但調(diào)補肺腎三法在炎癥反應中的作用差異并不明顯,有待進一步研究。