潘淑娟 毛安亮 胡文娟

【摘要】? 目的? ? 對(duì)比分析抗生素相關(guān)性腹瀉患兒應(yīng)用傳統(tǒng)糞便菌群培養(yǎng)法檢測(cè)與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)的臨床價(jià)值。方法? ? 將2021年2月—2022年2月上饒市立醫(yī)院收治的50例1～3歲抗生素相關(guān)性腹瀉患兒作為觀察對(duì)象，分別采用傳統(tǒng)糞便菌群培養(yǎng)和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腸道菌群，觀察對(duì)比2種方法的糞便細(xì)菌含量檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果? ? 與糞便菌群培養(yǎng)檢測(cè)比較，熒光定量PCR檢測(cè)患兒糞便細(xì)菌含量水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? ? 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)抗生素相關(guān)性腹瀉患兒腸道菌群的效果更佳，可為臨床治療提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】? 抗生素相關(guān)性腹瀉；小兒；腸道菌群；熒光定量PCR技術(shù)；糞便菌群培養(yǎng)法

Comparison of two detection techniques for intestinal flora in children with antibiotic-associated diarrhea

Pan Shujuan1， Mao Anliang1， Hu Wenjuan2. 1 The Shangrao Municipal Hospital，Shangrao，Jiangxi? ?334000; 2 The Traditional Chinese Medicine Hospital of Shangrao city，Shangrao，Jiangxi? ?334000

【Abstract】? Objective? ? To compare and analyze the clinical value of traditional fecal flora culture and fluorescence quantitative PCR detection in children with antibiotic-associated diarrhea. Methods? ? From February 2021 to February 2022，50 children with antibiotic related diarrhea aged 1-3 years received in our hospital were observed. The intestinal flora was detected by traditional fecal flora culture and fluorescent quantitative PCR，and the fecal bacterial content detection results of the two methods were observed and compared. Results? ? Compared with fecal flora culture，the level of fecal bacteria detected by fluorescence quantitative PCR was higher，and the difference was statistically significant（P<0.05）.? Conclusion? ? Fluorescence quantitative PCR is more effective in detecting intestinal flora in children with antibiotic associated diarrhea，which can provide a more accurate basis for clinical treatment.

【Key Words】? Antibiotic related diarrhea； Children； Intestinal flora； Fluorescence quantitative PCR； Fecal bacterial culture method

中圖分類號(hào)：R372? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1672-1721（2023）22-0094-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.22.031

抗生素相關(guān)性腹瀉是現(xiàn)代臨床應(yīng)用抗生素治療過程中最常見的一種并發(fā)癥，是無法用其他原因解釋且伴隨抗生素使用而發(fā)生的一類腹瀉[1]。腹瀉的發(fā)生與腸道菌群變化有關(guān)[2]，而人體腸道內(nèi)有數(shù)百種不同類型的細(xì)菌，厭氧菌位居首位，還有乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益細(xì)菌以及大腸埃希菌、梭狀芽孢桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌等有害細(xì)菌[3]。按照是否有致病菌參與，抗生素相關(guān)性腹瀉有感染性、非感染性之分，其中感染性抗生素相關(guān)性腹瀉相對(duì)少見，與抗生素大量濫用有關(guān)，以致于人體腸道內(nèi)菌群失調(diào)，條件致病菌大量增殖，破壞正常菌群，最終引起腹瀉；感染性抗生素相關(guān)性腹瀉臨床癥狀相對(duì)嚴(yán)重，主要病原菌多為艱難梭菌，如果不及時(shí)干預(yù)，有可能會(huì)引起偽膜性腸炎[4]。臨床更常見的非感染性抗生素相關(guān)性腹瀉，又被稱之為功能性抗生素相關(guān)性腹瀉。相對(duì)于感染性抗生素相關(guān)性腹瀉而言，非感染性抗生素相關(guān)性腹瀉癥狀較輕[5]。為了在臨床進(jìn)行針對(duì)性治療，有必要進(jìn)行腸道菌群檢測(cè)，以提高抗生素相關(guān)性腹瀉患兒糞便細(xì)菌檢出率，確保治療的高效性、可靠性。常規(guī)糞便檢測(cè)特異性不足，臨床應(yīng)用受限。熒光定量PCR技術(shù)較為新穎，常被用于腹瀉患兒的腸胃菌群檢測(cè)中，能夠輔助臨床早診斷、早治療[6]。本研究納入50例抗生素相關(guān)性腹瀉患兒作為觀察對(duì)象，對(duì)比分析了傳統(tǒng)糞便菌群培養(yǎng)法檢測(cè)與熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)的臨床價(jià)值。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 將2021年2月—2022年2月上饒市立醫(yī)院收治的50例抗生素相關(guān)性腹瀉患兒作為觀察對(duì)象，男性28例、女性22例；年齡1～3歲，平均年齡（2.2±0.8）歲；體質(zhì)量7～21 kg，平均（13.7±2.2）kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：滿足小兒抗生素相關(guān)性腹瀉的診斷，入院時(shí)無腹瀉；入院前1周未使用任何微生態(tài)制劑；無肝腎功能不全；無先天性心臟病、胃腸道畸形、免疫缺陷病等。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性智力障礙或有精神病史者；合并其他重要器官疾病者；主要觀察資料缺失者。分別采用傳統(tǒng)糞便菌群培養(yǎng)法和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)患兒腸道菌群。

1.2? ? 方法? ? 糞便菌群培養(yǎng)法檢測(cè)。采集患兒新鮮糞便約0.5 g作為檢測(cè)標(biāo)本，置于無菌杯內(nèi)立即送檢，以0.9％氯化鈉注射液作為稀釋液，對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，然后使用革蘭球菌、革蘭桿菌接種、培養(yǎng)，進(jìn)一步涂片操作，詳細(xì)觀察、記錄細(xì)菌數(shù)量；剩余標(biāo)本用無菌干燥管儲(chǔ)存，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)。（1）提取腸道細(xì)菌DNA。將保存于-20 ℃環(huán)境下的糞便樣本取出復(fù)融之后，每1 g樣本中加入pH值為7.4、0.05 mL/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）1 mL，持續(xù)顛倒搖晃10 min左右，充分混合均勻，然后離心處理10 min，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，提取上清液，以上操作反復(fù)進(jìn)行3次。接著再離心處理3 min，轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，獲得沉渣。使用PBS溶液對(duì)沉淀物進(jìn)行4次清洗、1次水洗，結(jié)束后加入蒸餾水50 mL，懸浮沉淀物。取1％破碎菌體（TritonX-100）50 mL，在100 ℃高溫下煮沸5 min，之后置于冷凍環(huán)境中進(jìn)行冷卻。（2）選擇PCR引物。主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌4種細(xì)菌，引物序列選擇時(shí)，在BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中，需與上述不同類別的細(xì)菌16SrDNA全序列進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比，進(jìn)一步確定不同細(xì)菌上下游引物。（3）熒光定量PCR反應(yīng)體系。以4×dNTP（0.25 mmol/L）2 mL、10×Buffer 2.5 mL、MgCL2（25 mmol/L）2.5 mL等25 mL反應(yīng)體系為主，細(xì)菌上游引物0.2～0.3 mL，細(xì)菌下游引物0.2～0.3 mL，DNA模板2 ～3 mL，TAQ酶0.7～0.8 mL，sybrgreen熒光染料2～3 mL，雙蒸水10～12 mL。運(yùn)用熒光定量PCR儀（SLAN-96P型）進(jìn)行分析、擴(kuò)增。（4）PCR反應(yīng)條件。在95℃環(huán)境下持續(xù)5 min變性反應(yīng)；在95 ℃環(huán)境下持續(xù)反應(yīng)15 s，在60 ℃環(huán)境下持續(xù)反應(yīng)60 s，在72 ℃環(huán)境下持續(xù)反應(yīng)45 s，在87 ℃環(huán)境下持續(xù)反應(yīng)5 s，總共40個(gè)循環(huán)。在72 ℃環(huán)境下延續(xù)10 min，然后結(jié)束操作。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? 對(duì)比2種檢測(cè)方法對(duì)患兒糞便細(xì)菌含量的檢測(cè)結(jié)果，主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌等。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

與糞便菌群培養(yǎng)法檢測(cè)比較，熒光定量PCR檢測(cè)患兒糞便細(xì)菌含量水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3? ? 討論

近年來，我國(guó)小兒抗生素相關(guān)性腹瀉的發(fā)生率顯著增加，不同類別的抗生素應(yīng)用及多種抗生素的聯(lián)合應(yīng)用都會(huì)在一定程度上引起抗生素相關(guān)性腹瀉，尤其是β-內(nèi)酰胺類抗生素，需引起臨床醫(yī)務(wù)人員高度重視 [7]。小兒抗生素相關(guān)性腹瀉多發(fā)生于應(yīng)用抗生素初期、停止使用抗生素后2～6周，感染性抗生素相關(guān)性腹瀉癥狀表現(xiàn)通常比較嚴(yán)重，尤其是真菌感染引起的腹瀉，有可能會(huì)導(dǎo)致患兒伴發(fā)偽膜性結(jié)腸炎，引起全身嚴(yán)重感染，主要癥狀包括腹瀉、腹脹、腹部疼痛不適、高熱不退、嘔吐等，甚至引發(fā)休克、多器官功能障礙綜合征、低鉀血癥、結(jié)腸穿孔、腎功能衰竭，危及患兒生命安全[8]。既往臨床通常采用血生化檢查，有助于臨床醫(yī)師準(zhǔn)確判斷患兒有無嚴(yán)重感染；糞便涂片檢測(cè)有助于臨床醫(yī)師了解患兒腸道菌群變化，為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素、細(xì)菌的培養(yǎng)鑒定以及盡早提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果至關(guān)重要。

隨著現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展以及相關(guān)研究深入，越來越多的研究者認(rèn)為抗生素相關(guān)性腹瀉的發(fā)生與腸道菌群變化有關(guān)。長(zhǎng)時(shí)間大量應(yīng)用廣譜抗生素或者是聯(lián)合應(yīng)用抗生素，雖然具有一定的殺滅細(xì)菌作用，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)菌產(chǎn)生不良影響，以致于人體腸道之中的正常菌群被殺滅、破壞[9]。傳統(tǒng)的常規(guī)糞便菌群培養(yǎng)檢測(cè)是臨床常用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法之一，在特定的環(huán)境中，用培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)7 d左右，便可以在顯微鏡下觀察菌群數(shù)量、菌群類型，分離出腸道中引起腹瀉的細(xì)菌，有助于臨床醫(yī)師判斷患兒體內(nèi)腸道菌群數(shù)量的變化，還可以直接觀察到有無真菌，為桿菌與球菌比例、革蘭陰性與陽(yáng)性桿菌之間的比例評(píng)價(jià)提供依據(jù)，從而進(jìn)一步明確患兒腸道菌群破壞的嚴(yán)重程度，為臨床完善相關(guān)治療方案提供參考。雖然此種方法的定性程度較高，但是對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉患兒而言，特異性不足，如果培養(yǎng)基上微生物分布不均，會(huì)導(dǎo)致低估細(xì)菌量的情況，尤其是輕微腹瀉的患兒，常規(guī)糞便檢查并不會(huì)發(fā)現(xiàn)任何異常；對(duì)于腹瀉癥狀較嚴(yán)重的患兒

來說，常規(guī)糞便檢測(cè)也只能檢出紅細(xì)胞、白細(xì)胞；定量有待于提高且操作耗時(shí)較長(zhǎng)[10]；受限于操作方法及腸道菌群中各類細(xì)菌生長(zhǎng)條件及速率差異，傳統(tǒng)的常規(guī)糞便菌群培養(yǎng)鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性不佳。此外，臨床還有多種方法用于糞便菌群檢測(cè)，如腸道細(xì)菌定量培養(yǎng)主要通過不同的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法計(jì)算腸道菌群數(shù)量，以此來評(píng)價(jià)腸道菌群比例失調(diào)情況，雖然此種方法具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但是實(shí)際操作過程中比較煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，加之菌群培養(yǎng)受限，難以在抗生素相關(guān)性腹瀉患兒腸道菌群檢測(cè)過程中得到廣泛應(yīng)用；細(xì)胞毒性中和試驗(yàn)（CCTA）特異性強(qiáng)，敏感度高（最低可檢測(cè)出10 pg毒素），但需要細(xì)胞培養(yǎng)及顯微鏡觀察的相應(yīng)設(shè)備和技術(shù)，操作煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)（48～72 h），判定結(jié)果需要一定經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，不適宜臨床常規(guī)檢測(cè)；核苷酸擴(kuò)增檢測(cè)（NAAT）是一種以RNA為模板擴(kuò)增出RNA產(chǎn)物，用RNA探針實(shí)時(shí)檢測(cè)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、產(chǎn)物不易發(fā)生污染等優(yōu)點(diǎn)，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。臨床實(shí)踐中迫切需要一種兼顧效率和準(zhǔn)確性的檢測(cè)方法。

本次研究發(fā)現(xiàn)，與糞便菌群培養(yǎng)檢測(cè)比較，熒光定量PCR檢測(cè)患兒糞便細(xì)菌含量水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明熒光定量PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值更高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系，使整個(gè)進(jìn)程始終處于熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)中，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，避免了常規(guī)PCR（瓊脂糖凝膠電泳、熒光素標(biāo)記PCR產(chǎn)物、三明治探針雜交、毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光）分析時(shí)間長(zhǎng)、可能會(huì)導(dǎo)致污染、對(duì)樣本通量的限制較大、易受擴(kuò)增效率及樣品基質(zhì)和反應(yīng)物變化的影響以致準(zhǔn)確性較低等弊端，以全封閉反應(yīng)、速度快、重復(fù)性好、靈敏度及特異度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11]。隨著臨床檢測(cè)的技術(shù)不斷發(fā)展，16S rDNA熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的提出，為現(xiàn)代臨床有效檢測(cè)小兒腸道菌群提供了新方法。16S rDNA為與細(xì)菌染色體編碼核糖體RNA（rRNA）相對(duì)應(yīng)的DNA序列，于所有細(xì)菌中存在而非原核生物體（病毒、真菌等）不具備，基因編碼由通用的保守區(qū)和具有種屬特異性的可變區(qū)組成，多拷貝使得其具備較高的分子生物學(xué)檢測(cè)靈敏度，基因編碼長(zhǎng)度適中（1 500 bp，含約50個(gè)左右的功能域），利于測(cè)序，目前幾乎所有細(xì)菌的16S rDNA基因測(cè)序都已完成，成為臨床最常用的PCR目標(biāo)擴(kuò)增序列[12]。16S rDNA基因檢測(cè)原理為從細(xì)菌樣本中的16S rDNA基因片段中獲取其序列信息，再于數(shù)據(jù)庫(kù)中確定在進(jìn)化樹中的具體位置，從而鑒別細(xì)菌種類。針對(duì)16S rDNA基因兼具保守性和特異性的特點(diǎn)，可通過不同的引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)本中的靶細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。賀銳等[13]采用16S rDNA熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)新生兒出生后第1天、第

3天、第7天糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌4種細(xì)菌的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上百個(gè)細(xì)菌的曲線生長(zhǎng)特征明顯，說明引物16S rDNA熒光定量PCR檢測(cè)不同類型的細(xì)菌的敏感性較高。

綜上所訴，相對(duì)于傳統(tǒng)糞便菌群培養(yǎng)法檢測(cè)技術(shù)而言，熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)抗生素相關(guān)性腹瀉患兒腸道菌群含量效果更佳，可為臨床治療提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

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（收稿日期：2023-05-11）