徐惠玉 嚴(yán)梓 楊奕清 劉興元

先天性心臟病是人類(lèi)最常見(jiàn)的發(fā)育畸形，在新生兒中的發(fā)病率約為1%，臨床上可分為20 種以上的不同類(lèi)型，其中以室間隔缺損（VSD）最為常見(jiàn)，VSD 可導(dǎo)致腦損傷、腦發(fā)育遲緩、腦卒中、肺動(dòng)脈高壓、充血性心力衰竭、室上性及室性心律失常甚至死亡[1-2]。既往研究表明，先天性心臟病主要是由遺傳缺陷所致，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100 多個(gè)基因與人類(lèi)先天性心臟病有關(guān)，其中包括SOX7和SOX17基因[3-5]。SOX 族F 組轉(zhuǎn)錄因子基因總有3 個(gè)成員，包括SOX7、SOX17和SOX18，其表達(dá)與功能特點(diǎn)相似，有一定的相互代償功能[6]，由此推測(cè)SOX18基因突變也很有可能導(dǎo)致先天性心臟病。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2017 年4 月—2021 年9 月，自同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院和上海市第一人民醫(yī)院嘉定醫(yī)院的就診者中入選156 例患兒（病例組），均根據(jù)心臟超聲檢查結(jié)果或心臟手術(shù)記錄明確診斷為先天性心臟病。來(lái)自同期體檢者其中男性82 例，女性74 例，年齡為1～11 歲，平均年齡為（6±4）歲。對(duì)照組為216 名漢族無(wú)先天性心臟病兒童，來(lái)自同期體檢者，其中男性114 名，女性102 名，年齡為1～12 歲，平均年齡為（6±3）歲。病例組8 例（5.1%）有家族史，對(duì)照組均無(wú)先天性心臟病家族史。2 組均無(wú)可誘發(fā)先天性心臟病的環(huán)境因素。本研究遵循人類(lèi)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范，并經(jīng)過(guò)2 所醫(yī)院的倫理委員會(huì)的審核、批準(zhǔn)。經(jīng)研究對(duì)象的法定監(jiān)護(hù)人知情同意后，收集其臨床數(shù)據(jù)和血液標(biāo)本，常規(guī)提取其基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1SOX18基因的擴(kuò)增 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)特異性擴(kuò)增SOX18基因整個(gè)編碼區(qū)。所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增SOX18基因編碼區(qū)即編碼外顯子1 和2 的引物序列見(jiàn)表1（由于編碼外顯子較大，分別分成2 段和3 段進(jìn)行擴(kuò)增）。

表1 擴(kuò)增SOX18基因編碼外顯子的引物序列

以每位入選對(duì)象的基因組DNA 為模板，應(yīng)用化學(xué)合成的上述SOX18基因擴(kuò)增引物及熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶試劑盒（美國(guó)NEB 公司），對(duì)SOX18基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 混合物的總體積定為25 μL，包括10×標(biāo)準(zhǔn)Taq 酶反應(yīng)緩沖液2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.125 μL、基因組DNA（30 ng/μL）2 μL、雙蒸水18.875 μL。PCR 的熱循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，隨即進(jìn)入35 個(gè)熱循環(huán)，即95 ℃變性30 s、62 ℃ 退火45 s 和68 ℃ 延伸1 min，最后68 ℃延伸6 min。PCR 終產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收并用凝膠DNA 純化試劑盒（中國(guó)Sangon Biotech 公司）純化PCR 終產(chǎn)物。

1.2.2SOX18基因的測(cè)序與序列比對(duì)分析 以純化的PCR 終產(chǎn)物為模板，用1 條SOX18基因擴(kuò)增引物和DNA 測(cè)序試劑盒在PCR 儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)混合物的體積定為20 μL，其中預(yù)混合液8 μL、正向引物（2 μmol/L）2 μL、SOX18基因片段DNA（20 ng/μL）2 μL、雙蒸水8 μL。測(cè)序反應(yīng)的條件如前所述[7]：總計(jì)30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性20 s、50 ℃退火15 s 和60 ℃延伸l min。測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化回收后在DNA 測(cè)序儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）上進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)比分析所測(cè)的SOX18基因序列與核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide）中公布的SOX18基因序列（登陸號(hào)：NM_018419.3）以發(fā)現(xiàn)SOX18基因變異。一旦發(fā)現(xiàn)SOX18基因變異，就測(cè)序分析216 名對(duì)照者的SOX18基因，同時(shí)檢索 SNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)（https://c.wanfangdata.com.cn/periodical），以明確所發(fā)現(xiàn)的SOX18基因變異是否為新突變。

1.2.3SOX18基因變異的致病性預(yù)測(cè) 借助2021版 在線(xiàn)軟 件MutationTaster2021（https://www.mutationtaster.org/）預(yù)測(cè)SOX18基因變異是否為致病性突變。

1.2.4 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 以人類(lèi)心臟cDNAs 為模板，設(shè)計(jì)合成1 對(duì)特異性擴(kuò)增SOX18基因全長(zhǎng)cDNA 的引物（正向引物為5'-GACGAATTCCGC GCTCCCGCGCTCCGTTC-3'，反向引物為5'-GTC CTCGAGGAGGAAGCGCTGCAGGGACC-3'），使用高保真Phusion?DNA 聚合酶試劑盒(美國(guó)NEB公司)在PCR儀（德國(guó)Eppendorf MasterCycler公司）上通過(guò)PCR 生成SOX18基因全長(zhǎng)cDNAs。PCR混合物的總體積定為50 μL，包括5×Phusion HF 緩沖液10 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL、正反向引物（10 μmol/L）各2.5 μL、Phusion DNA 聚 合酶（2 U/μL）0.5 μL、cDNAs（10 ng/μL）2 μL、雙蒸水31.5 μL。PCR 的熱循環(huán)條件為：98 ℃預(yù)變性30 s 后，進(jìn)入30 個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)熱循環(huán)包括98 ℃變性10 s、62 ℃ 退火30 s 和72 ℃ 延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min。

使用核酸內(nèi)切酶EcoRI 和XhoI 分別雙酶切純化后的SOX18基因全長(zhǎng)cDNAs 和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1，純化后用T4 DNA 連接酶 將SOX18基因全長(zhǎng)cDNAs 與pcDNA3.1 連接即可構(gòu)建野生型SOX18的真核表達(dá)質(zhì)粒SOX18-pcDNA3.1，然后通過(guò)測(cè)序證實(shí)。以野生型SOX18-pcDNA3.1 為模板，應(yīng)用1 對(duì)以突變點(diǎn)為中心、長(zhǎng)各為31 個(gè)堿基的互補(bǔ)引物和定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校绹?guó)Agilent 公司），通過(guò)PCR 獲得突變型SOX18-pcDNA3.1。用DNA 酶Dpn I（美國(guó)NEB 公司）切除模板即野生型SOX18-pcDNA3.1 并經(jīng)測(cè)序證實(shí)獲得突變型SOX18-pcDNA3.1。

類(lèi)似地，設(shè)計(jì)、合成1 對(duì)特異性擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 545 bp 的NR2F2基因（登錄號(hào)NC_000015.10）啟動(dòng)子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 544 bp～轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)即-1 544 bp～+1 bp）的引物（正向引物 為5'-GTGGCTAGCTGGTTGGTTTACCGGCA TG-3'，反向引物為5'-CACCTCGAGCCGCGATCA GCTCACTGAGC-3'），以人基因組DNA 為模板，使用高保真Phusion?DNA 聚合酶試劑盒(美國(guó)NEB公 司) 在PCR 儀（德 國(guó)Eppendorf MasterCycler公司）上通過(guò)PCR 生成NR2F2基因啟動(dòng)子片段，通過(guò)NheI 和XhoI 雙酶切NR2F2基因啟動(dòng)子片段和無(wú)啟動(dòng)子的螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒 pGL3-Basic（美國(guó)Promega 公司），然后通過(guò)連接反應(yīng)構(gòu)建NR2F2基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)的質(zhì)粒NR2F2-luc 并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。

1.2.5SOX18基因突變體的功能分析 常規(guī)培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞，多種表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法如文獻(xiàn)所述[5]。每次細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000（美國(guó)Invitrogen 公司）轉(zhuǎn)染0.6 μg pcDNA3.1 空質(zhì)粒 或0.6 μg 野生型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)?；?.6 μg Gln144*-突變型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)?；?.3 μg pcDNA3.1 空質(zhì)粒+0.3 μg 野生型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)?；?0.3 μg 野生型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)粒+0.3 μg Gln144*-突變型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)粒，同時(shí)共轉(zhuǎn)染1.5 μgNR2F2-luc 質(zhì)粒和20 ng pGL4.75 質(zhì)粒（美國(guó)Promega 公司）。共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL4.75 作為內(nèi)對(duì)照以平衡轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48 h收集、裂解HeLa 細(xì)胞。采用熒光分析儀（美國(guó)Promega 公司），應(yīng)用雙熒光素酶分析試劑盒（美國(guó)Promega 公司）定量分析細(xì)胞裂解液中2 種熒光素酶的活性，以螢火蟲(chóng)與海腎熒光素酶活性之比表示靶基因NR2F2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

連續(xù)數(shù)據(jù)如入選者年齡、靶基因NR2F2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性等用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；分類(lèi)數(shù)據(jù)如入選者的性別、種族等用數(shù)字（百分比）表示。2 組連續(xù)數(shù)據(jù)的比較用非配對(duì)Student’st檢驗(yàn)；2 組分類(lèi)數(shù)據(jù)的比較用Fisher’s 精確概率檢驗(yàn)或Pearson’sχ2檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)SOX18基因新突變

本研究2 組入選者均為中國(guó)漢族人，組間的性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)Pearson’sχ2檢驗(yàn)P＞0.05），年齡差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)Student’st檢驗(yàn)P＞0.05）。通過(guò)對(duì)156 例先天性心臟病患兒的SOX18基因的編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，在其中1 例4 歲男性散發(fā)性先天性VSD 患兒發(fā)現(xiàn)了1 種SOX18基因雜合突變，即NM_018419.3:c.430C＞T;p.(Gln144*) 突變。該SOX18基因無(wú)義突變不存在于216 例對(duì)照組，在SNP、PubMed 和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)也未見(jiàn)報(bào)道，表明該SOX18基因突變是新發(fā)現(xiàn)的突變。該例先天性VSD 患兒的SOX18基因c.430C＞T雜合突變DNA 序列見(jiàn)圖1。

圖1 SOX18基因c.430C＞T雜合突變

該例先天性VSD 患兒的SOX18基因c.430C＞T雜合突變的純合野生型C/C 對(duì)照DNA 序列見(jiàn)圖2。

圖2 SOX18基因c.430C＞T雜合突變的純合野生型C/C對(duì)照DNA序列

2.2 SOX18基因突變c.430C＞T是致病突變

SOX18基因突變c.430C＞T 被在線(xiàn)軟件MutationTaster2021 預(yù)測(cè)為致病性突變，該預(yù)測(cè)的正確率＞99.99%。

2.3 Gln144*-突變型SOX18對(duì)靶基因NR2F2 的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)喪失

在轉(zhuǎn)染了基因表達(dá)質(zhì)粒的HeLa 細(xì)胞中，0.6 μg野生型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)粒和等量（0.6 μg）的Gln144*-突變型SOX18-pcDNA3.1 質(zhì)粒對(duì)靶基因NR2F2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用分別約為16 倍（16.36±1.92）和1 倍（1.12±0.57），2 組間的轉(zhuǎn)錄激活作用有顯著性差異（t＝13.15，P＝0.000 2）；而在同時(shí)轉(zhuǎn)染0.3 μg 野生型SOX18-pcDNA3.1 和等量（0.3 μg）Gln144*-突變型SOX18-pcDNA3.1 時(shí)，所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用約為8 倍（8.36±0.73），顯著低于0.6 μg 野生型SOX18-pcDNA3.1 對(duì)靶基因NR2F2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用，2 組間有顯著性差異（t＝6.73，P＝0.002 5）。

3 討論

本研究在1 例男性散發(fā)性VSD 患兒中檢測(cè)出1 種新的SOX18基因雜合突變，即NM_018419.3:c.430C＞T;p.(Gln144*) 突變。該SOX18基因無(wú)義突變不存在于216 名無(wú)先天性心臟病兒童中。計(jì)算機(jī)軟件MutationTaster2021 模擬分析表明該突變是致病突變。雙報(bào)告基因定量分析顯示Gln144*-突變型SOX18對(duì)靶基因NR2F2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)完全喪失，而NR2F2基因功能障礙已經(jīng)被證實(shí)可導(dǎo)致多種類(lèi)型的先天性心臟病，包括VSD[8-10]。因此，SOX18基因新突變c.430C＞T即 p.(Gln144*) 很可能是該例VSD 患兒的分子病因。

人類(lèi)SOX18基因定位于20 號(hào)染色體20q13.33區(qū)域，編碼由384 個(gè)氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄因子，屬于SOX 家族F 組[11]。SOX18在胚胎發(fā)育期間大量表達(dá)于心臟、血管和淋巴管系統(tǒng)，主要通過(guò)單獨(dú)或與其轉(zhuǎn)錄合作伙伴如NKX2.5 或MEF2C 協(xié)同調(diào)控心血管發(fā)育相關(guān)靶基因如NR2F2或GATA4的表達(dá)，對(duì)心血管的正常發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵影響[4-6,11-13]。不僅如此，NR2F2、GATA4、NKX2.5和MEF2C基因功能喪失性突變均被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致先天性心臟病[8-10,14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)SOX18基因功能喪失性突變可導(dǎo)致VSD，顯示人類(lèi)SOX18基因單倍型不足是VSD 發(fā)生的分子機(jī)制之一。

在脊椎動(dòng)物中，目前已經(jīng)克隆了至少20 個(gè)SOX族基因，這些SOX族基因被分為10 個(gè)組（從A 組到I 組），其中F 組的SOX7、SOX17和SOX18均在胚胎發(fā)育時(shí)期共表達(dá)于心血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞特化和組織分化，從而在心血管形態(tài)發(fā)生方面發(fā)揮重要作用[6,16]。在蟾蜍中，敲減Sox18或Sox7可部分抑制心臟發(fā)育，而同時(shí)敲減Sox18和Sox7則可顯著增強(qiáng)對(duì)心臟發(fā)育的抑制；Sox18mRNA 可以拯救Sox7敲減的效應(yīng)，反之亦然，表明Sox18和Sox7在功能上的冗余作用[17]。在斑馬魚(yú)中，敲減Sox18或Sox7可導(dǎo)致輕微的血管發(fā)育畸形，而同時(shí)敲減Sox18和Sox7則可導(dǎo)致嚴(yán)重的動(dòng)靜脈血管發(fā)育畸形；單獨(dú)敲減Sox18或Sox7時(shí)，只有一部分斑馬魚(yú)表現(xiàn)出血管畸形（部分外顯），而在Sox18和Sox7雙基因同時(shí)敲減時(shí)，所有斑馬魚(yú)均表現(xiàn)出血管畸形（完全外顯），顯示這2 個(gè)基因功能上的互補(bǔ)作用[6]。在小鼠中，Sox17基因敲除可導(dǎo)致胎心環(huán)化異常和動(dòng)靜脈畸形，而Sox17和Sox18雙基因敲除則導(dǎo)致嚴(yán)重的胚胎心血管發(fā)育畸形[16]。在人類(lèi)中，Sox7和Sox17基因功能喪失性突變均已發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致先天性心臟病[4-5]。這些研究結(jié)果提示SOX18基因功能喪失性突變可導(dǎo)致人類(lèi)先天性心血管畸形。

值得一提的是，此前已有報(bào)道SOX18基因突變可導(dǎo)致毛發(fā)稀少-淋巴水腫-毛細(xì)血管擴(kuò)張綜合征以及主動(dòng)脈擴(kuò)張、肺動(dòng)脈高壓和腎功能衰竭[18]。本研究發(fā)現(xiàn)SOX18基因功能喪失性新突變可導(dǎo)致VSD，擴(kuò)大了SOX18基因突變的表型譜。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)1 個(gè)新的SOX18基因功能缺失性突變可導(dǎo)致VSD，為部分VSD 的早期精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)防治提供了新的分子靶標(biāo)，具有一定的臨床意義。