張卓睿，孫冰瑤，夏明鈺，高慧華，程興月，楊海龍，姜貴全*

（北華大學(xué) 林學(xué)院，吉林 吉林 132013）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）是薔薇科薔薇屬野薔薇種山刺玫的果實，主要分布在我國的東北、華北及內(nèi)蒙古等地區(qū)[1]。刺玫果中含有多糖、黃酮、維生素、三萜、皂苷等多種活性成分[2]，具有抗衰老[3]、抗疲勞[3]、降血脂[4]、消炎[5]等生理功效。目前已報道的關(guān)于刺玫果開發(fā)利用方面的研究主要包括果汁、果醋、果酒、果茶等刺玫果飲品，以及具有一定藥用功效的保健品，如刺玫果萃取物膠囊、刺玫果復(fù)合營養(yǎng)品、刺玫果注射液等[6]。山荊子（Malus baccata（L.）Borkh）是薔薇科蘋果屬落葉禾木，主要分布于我國內(nèi)蒙古、東北以及山西等地區(qū)[7]。山荊子果實營養(yǎng)價值較高，富含微量元素、萜類、酯類、烯烴類、多酚類等成分[8]，具有降血脂[9]、保肝[10]、抗氧化[11]、抗癌[11]等作用。成熟的山荊子果實可直接食用，但口感偏酸，加上質(zhì)地軟、不利于貯運等特點，因此更適宜將其加工成果脯、蜜餞、果醬、清涼飲料、野荊子果酒[12]、山荊子復(fù)合飲料[13]、山荊子果啤[14]等食品。榿葉唐棣（Amelanchier alnifoliaNutt）是薔薇科唐棣屬落葉灌木植物，每100 g榿葉唐棣鮮果中約含88 mg鈣，也被稱為高鈣唐棣[15]。榿葉唐棣果實中富含多糖、花青素、酚酸、綠原酸等多種活性成分[16]，具有降血糖[17]、抗炎[18]、抗氧化[19]等功效。目前榿葉唐棣果實深加工的研究主要包括高鈣果醬[20]、米酒[21]、果酒[22]、果醋[23]等。雖然現(xiàn)在已有刺玫果、山荊子和榿葉唐棣為單一原料釀造果酒的相關(guān)報道[6，12，22]，但還鮮見將三者復(fù)合開發(fā)果酒的研究，而將三者復(fù)配，不僅可以增加果酒中鈣、花青素等營養(yǎng)成分的含量，還可以豐富果酒的感官品質(zhì)，使其兼具榿葉唐棣鮮艷的色澤、刺玫果清甜的香氣和山荊子清爽的口感。因此，本研究以刺玫果、山荊子和榿葉唐棣為原料，混合發(fā)酵制備刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒，并通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化刺玫果-山荊子-榿葉唐棣復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件，研發(fā)一種鈣含量高、營養(yǎng)豐富的新型復(fù)合果酒，不僅可以滿足人們對健康飲食的需求，還能為三種水果的開發(fā)利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

榿葉唐棣、山荊子：采于吉林市北華大學(xué)二道試驗基地；刺玫果：市售。榿葉唐棣、山荊子、刺玫果均在-20 ℃條件下貯藏。

1.1.2 試劑

RW果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（食品級）：市售；鈣標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度100 μg/mL）：北京有色金屬研究總院；乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-2500S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；精密酒精計（精度0.1）：河間市振巖儀器儀表廠；311WCN破壁料理機：博西家用電器（中國）有限公司；AA-7000原子吸收分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；JH722S型可見分光光度計：上海菁華儀器有限公司；JC523A分析天平：北京金科利達電子科技有限公司；pHS-3C型pH計：北京京海佳業(yè)科貿(mào)有限公司；WYT-G型手持糖度計：成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒加工工藝流程及操

作要點

操作要點：

刺玫果的預(yù)處理：挑選無病蟲害、無霉?fàn)€的刺玫果，沖洗干凈、瀝去水分后，去除刺玫果內(nèi)部的毛刺和果核。

山荊子和榿葉唐棣的預(yù)處理：除去有蟲蛀和腐爛的壞果，將山荊子、榿葉唐棣果實沖洗干凈，瀝去水分，去核。

混合、破碎：將預(yù)處理后的刺玫果、山荊子和榿葉唐棣按質(zhì)量比1∶1∶1混合，在破壁料理機中充分破碎并攪拌均勻，混合果漿的糖度為8.6°Bx，總酸為5.71 g/L，pH為3.65。

成分調(diào)整、滅菌：按照果漿總量20%添加蔗糖至混合果漿中，攪勻；同時，為了在發(fā)酵初始階段能較好的抑制雜菌生長，按果漿總量0.03%加入焦亞硫酸鉀，并在65 ℃殺菌30 min[22，24]。

發(fā)酵：將活化好的果酒酵母按0.07%接種量接種到殺菌后的刺玫果、山荊子和榿葉唐棣混合果漿中，充分?jǐn)嚢?，?5 ℃條件下發(fā)酵13 d，每隔24 h檢測發(fā)酵液糖度，當(dāng)糖度降至6%以下時，停止發(fā)酵。

酒渣分離、澄清：將發(fā)酵液用200目濾布過濾，濾出的酒液按0.5 g/L的質(zhì)量濃度添加殼聚糖，在4 ℃條件下冷藏72 h后，1 000 r/min離心10 min[24]，即得刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒成品。

1.3.2 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

分別考察刺玫果、山荊子、榿葉唐棣質(zhì)量比（1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2），蔗糖添加量（13%、15%、17%、19%、21%），酵母接種量（0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%）[22，24-25]，發(fā)酵溫度（16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃）和發(fā)酵時間（8 d、10 d、12 d、14 d、16 d）對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響。

1.3.3 復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，以蔗糖添加量（A），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，進行3因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization

1.3.4 分析檢測

酒精度、總酸測定：分別采用國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法和電位滴定法[26]；鈣含量測定：采用國標(biāo)GB/T 5009.92—2016《食品中鈣的測定》中的原子吸收分光光度法[27]；花青素含量測定：依據(jù)pH示差法[28]；糖度測定：采用手持糖度儀；pH值測定：采用pH計。

依據(jù)刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒的特點，設(shè)定感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官檢驗要求，請10位專業(yè)人員根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)從外觀、香氣、口感幾個方面對復(fù)合果酒進行打分，滿分100分。

表2 復(fù)合果酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of compound fruit wine

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗結(jié)果平行測定3次，使用Excel 2010進行處理，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；響應(yīng)面試驗結(jié)果利用Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比的確定

固定蔗糖添加量17%，酵母接種量0.07%，發(fā)酵溫度22℃，發(fā)酵時間為10 d，考察刺玫果、山荊子和榿葉唐棣不同質(zhì)量比對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。

表3 刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 3 Effect of mass ratio of Rosa davurica, Malus baccata and Amelanchier alnifolia on the quality of compound fruit wine

由表3可知，刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比為2∶1∶1時，復(fù)合果酒酒精度最高，為（9.80±0.27）%vol，有明顯的清甜香氣，酸甜適中，感官評分最高，為（73.90±1.08）分，但酒體顏色偏淡，鈣離子含量和花青素含量偏低；刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比為1∶2∶1時，復(fù)合果酒酸味重，有苦澀感，顏色淡，感官評分及酒精度最低，分別為（62.30±0.22）分、（8.70±0.14）%vol，鈣離子含量和花青素含量均較低；刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比為1∶1∶2時，復(fù)合果酒中鈣離子含量和花青素含量高，分別為（55.08±0.25）mg/100 mL和（71.54±0.79）mg/100 mL，但香氣及口感均稍遜色于刺玫果添加量較高時的復(fù)合果酒；整體而言，刺玫果、山荊子和榿葉唐棣的質(zhì)量比為1∶1∶1時，復(fù)合果酒的各項指標(biāo)均處于較佳狀態(tài)，酒精度為（9.5±0.23）%vol，感官評分為（72.5±0.51）分，鈣離子含量為（47.86±0.21）mg/100 mL，花青素含量為（60.79±0.36）mg/100 mL，殘?zhí)橇繛椋?.97±0.09）°Bx，總酸含量為（6.19±0.23）g/L。因此，確定刺玫果、山荊子和榿葉唐棣的最適質(zhì)量比為1∶1∶1。

2.1.2 蔗糖添加量的確定

固定刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比1∶1∶1，酵母接種量0.07%，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時間為10 d，考察不同蔗糖添加量對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。

表4 蔗糖添加量對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 4 Effect of sugar addition on the quality of compound fruit wine

蔗糖是果酒酵母的發(fā)酵底物，理論上提高其含量可以增加果酒的酒精度，但蔗糖含量過高，又會導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓增大，抑制酵母的活性，不利于發(fā)酵。由表4可知，蔗糖添加量為19%時，復(fù)合果酒的酒精度最高，為（10.10±0.21）%vol，此時果酒中的感官評分及花青素含量都達到最大值，分別為（74.20±0.64）分和（63.29±0.31）mg/100 mL；另外，在蔗糖添加量的考察水平范圍內(nèi)，復(fù)合果酒中鈣離子質(zhì)量濃度變化量≤2.8 mg/100 mL，且無明顯規(guī)律，可以認(rèn)為蔗糖添加量對刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒中的鈣離子含量無相關(guān)性影響。因此，確定蔗糖最適添加量為19%，此條件下復(fù)合果酒的殘?zhí)橇繛椋?.27±0.17）°Bx，總酸含量為（6.29±0.18）g/L。

2.1.3 酵母接種量的確定

固定刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比1∶1∶1，蔗糖添加量19%，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時間為10 d，考察不同酵母接種量對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表5。

表5 酵母接種量對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 5 Effect of yeast inoculum on the quality of compound fruit wine

隨著果酒酵母添加量的增加，底物中的糖分逐漸被充分發(fā)酵分解，果酒酒精度不斷提高。由表5可知，酵母添加量從0.03%增加到0.07%，酒精度由（7.30±0.34）%vol提升到（10.20±0.21）%vol，之后繼續(xù)提高酵母添加量，酒精度、花青素含量和鈣離子含量皆呈下降趨勢，分析其原因可能是發(fā)酵過程中，過多的菌種使糖分等營養(yǎng)物質(zhì)都用于微生物的生長繁殖，反而不利于酒精的生成和營養(yǎng)成分的浸出。酵母添加量為0.09%時，復(fù)合果酒因后味略帶澀味而口感更豐富，感官評分最高，為（74.10±1.08）分，但花青素含量和鈣離子含量比酵母添加量0.07%時稍偏低。因此，確定果酒酵母最適添加量為0.07%，此條件下復(fù)合果酒的殘?zhí)橇繛椋?.10±0.16）°Bx，總酸含量為（6.31±0.15）g/L。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

固定刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比1∶1∶1，蔗糖添加量19%，酵母接種量0.07%，發(fā)酵時間為10 d，考察不同發(fā)酵溫度對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵溫度對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 6 Effect of fermentation temperature on the quality of compound fruit wine

由表6可知，隨著發(fā)酵溫度由16 ℃升高到28 ℃，復(fù)合果酒的酒精度逐漸增大，發(fā)酵溫度為25 ℃時，酒精度為（10.90±0.32）%vol，但發(fā)酵溫度＞25 ℃以后，酒精度增加幅度趨于平緩；發(fā)酵溫度在16～28 ℃范圍內(nèi)，低溫發(fā)酵所得果酒口感偏甜，更類似于酒精飲料，而高溫發(fā)酵的果酒有明顯的苦澀味，且果香較淡，整體而言，發(fā)酵溫度為25 ℃時的復(fù)合果酒果味和酒香協(xié)調(diào)，口感清爽，后味甘甜，感官評分最高，為（77.40±0.35）分，而此時酒液中的鈣離子含量和花青素含量也較高，分別為（52.46±0.88）mg/100 mL、（65.25±0.45）mg/100 mL。因此，確定最適發(fā)酵溫度為25 ℃，此條件下復(fù)合果酒的殘?zhí)橇繛椋?.90±0.28）°Bx，總酸含量為（6.76±0.23）g/L。

2.1.5 發(fā)酵時間的確定

固定刺玫果、山荊子和榿葉唐棣質(zhì)量比1∶1∶1，蔗糖添加量19%，酵母接種量0.07%，發(fā)酵溫度為25 ℃，考察不同發(fā)酵時間對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響，結(jié)果見表7。

表7 發(fā)酵時間對復(fù)合果酒品質(zhì)的影響Table 7 Effect of fermentation time on the quality of compound fruit wine

由表7可知，在刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒發(fā)酵過程中，前12 d是生成酒精的旺盛時期，酒精度急劇增加，發(fā)酵時間為12 d時，感官評分、花青素含量、鈣離子含量最高，分別為（82.10±0.37）分、（65.77±0.33）mg/100 mL、（52.97±0.45）mg/100 mL，復(fù)合果酒酒精度達到（11.8±0.82）%vol。發(fā)酵時間＞12 d之后，酒精度增加幅度變緩，感官評分、花青素含量和鈣離子含量均呈下降趨勢。因此，確定適宜發(fā)酵時間為12 d，此條件下復(fù)合果酒殘?zhí)橇繛椋?.00±0.24）°Bx，總酸含量為（6.91±0.22）g/L。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

單因素試驗基礎(chǔ)上，以蔗糖添加量（A），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）為自變量，酒精度（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表8 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表8結(jié)果進行回歸擬合，得到刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒的酒精度（Y）對蔗糖添加量（A），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）的二次多項回歸方程為：

由表9可知，所得回歸模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.232 1＞0.05），說明試驗結(jié)果受到的干擾極小，用回歸方程替代真實點對結(jié)果進行分析在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的；決定系數(shù)R2=0.990 9，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.979 1，預(yù)測決定系數(shù)R2pre=0.903 8，說明方程的可信度和擬合度均較高[29]，可利用該模型分析和預(yù)測刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝條件。由P值可知，一次項A、B，交互項AB、BC，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項C，交互項AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3個因素對復(fù)合果酒酒精度影響順序為蔗糖添加量（A）＞發(fā)酵溫度（B）＞發(fā)酵時間（C）。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

蔗糖添加量（A），發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）交互作用對酒精度影響的響應(yīng)面及等高線見圖1。

圖1 各因素間交互作用對復(fù)合果酒酒精度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the alcohol content of compound fruit wine

由圖1可知，各因素交互作用的響應(yīng)值Y都出現(xiàn)了極大值，說明各因素設(shè)計的水平范圍合理，能反映各因素間交互作用對復(fù)合果酒酒精度的影響趨勢。其中蔗糖添加量（A）和發(fā)酵溫度（B）交互作用的響應(yīng)曲面、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時間（C）交互作用的響應(yīng)曲面很陡峭，等高線呈橢圓形，說明AB、BC交互作用對復(fù)合果酒酒精度有極顯著影響（P＜0.01）；蔗糖添加量（A）與發(fā)酵時間（C）交互作用的響應(yīng)面曲線比較陡峭，說明AC交互作用對酒精度的影響顯著（P＜0.05）。這與回歸模型方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 響應(yīng)面模型驗證試驗

Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒最佳發(fā)酵工藝條件為蔗糖添加量20.36%，發(fā)酵溫度24.62 ℃，發(fā)酵時間12.53 d，在此條件下酒精度預(yù)測值為12.3%vol。為方便實際操作，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為蔗糖添加量20%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間13 d，在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下進行3次平行驗證試驗，得到復(fù)合果酒酒精度實際值為（12.2±0.23）%vol，實際值與預(yù)測值相差不大，表明建立的數(shù)學(xué)模型可行。

2.3.4 刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒品質(zhì)指標(biāo)測定

在最佳發(fā)酵工藝條件下，刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒澄清透明，顏色為石榴紅色，富有光澤，無懸浮物及沉淀，感官評分為（81.70±0.46）分，酒精度為（12.2±0.23）%vol，花青素含量為（65.39±0.14）mg/100mL，鈣離子含量為（54.15±0.23）mg/100 mL，殘?zhí)橇繛椋?.62±0.33）°Bx，總酸含量為（5.90±0.56）g/L，致病菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）未檢出，菌落總數(shù)≤30CFU/mL，大腸菌群數(shù)≤2 MPN/100 mL，符合GB 2758—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵酒及其配制酒》中相關(guān)要求[30]。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗確定刺玫果山荊子榿葉唐棣復(fù)合果酒的最佳發(fā)酵工藝條件為刺玫果、山荊子和榿葉唐棣的質(zhì)量比為1∶1∶1，果酒酵母添加量為0.07%，蔗糖添加量20%，發(fā)酵溫度25 ℃，發(fā)酵時間13 d。在此條件下，復(fù)合果酒酒精度為（12.2±0.23）%vol，花青素含量為（65.39±0.14）mg/100 mL，鈣離子含量為（54.15±0.23）mg/100 mL，感官評分為（81.70±0.46）分，酒體呈石榴紅色，澄清透明，氣味清晰，口味醇厚，理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。