羅 軍, 陳麗琦, 李拓鍵, 區(qū) 智, 屈 燕

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院 國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心 云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心, 云南 昆明 650224)

綠絨蒿屬(MeconopsisVig.)植物隸屬于罌粟科(Papaveraceae),一年生或多年生草本,主要分布在青藏高原,是傳統(tǒng)藏藥植物[1]。綠絨蒿屬植物株型姿態(tài)優(yōu)美,花朵碩大秀麗,花色豐富,有黃色、白色、藍(lán)色、藍(lán)紫色、紫紅色和酒紅色等[2]?；ㄉ蔷G絨蒿屬植物關(guān)鍵分類特征之一,其中全緣葉綠絨蒿〔M.integrifolia(Maxim.) Franch.〕花黃色[3],紅花綠絨蒿(M.puniceaMaxim.)花紅色[4],川滇綠絨蒿(M.wilsoniiGrey-Wilson)花藍(lán)紫色[5],是綠絨蒿屬植物的典型花色,為綠絨蒿屬植物花色形成機(jī)制研究的理想材料。

花色作為植物的重要生物性狀,是多因子綜合作用的結(jié)果,除環(huán)境因子外,還受細(xì)胞介質(zhì)pH值[6]、花色素種類和含量[7]以及金屬離子等影響。已有研究結(jié)果表明:金屬離子在越橘(Vacciniumvitis-idaeaLinn.)[8]、金花茶組(Sect.ChrysanthaChang)植物[9]和郁金香(TulipagesnerianaLinn.)[10]等植物花瓣呈色中具有重要作用。高宇等[11]認(rèn)為,Na+、K+和Ca2+對(duì)軟棗獼猴桃〔Actinidiaarguta(Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.〕花青素穩(wěn)定性無(wú)顯著影響,但Mg2+和Cu2+卻促使花青素發(fā)生氧化反應(yīng),降低花青素穩(wěn)定性。Miller等[12]認(rèn)為,自然狀態(tài)下法國(guó)萬(wàn)壽菊(TagetespatulaLinn.)的花瓣呈淡黃色,Cu2+使花色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?Cr3+使花瓣呈暗橘色。在大花綠絨蒿(M.grandisPrain)中,Fe3+、Mg2+、黃酮醇和矢車菊素衍生物相結(jié)合能形成一種區(qū)分于常見(jiàn)花色素的新型金屬?gòu)?fù)合體色素,進(jìn)而形成花瓣中的藍(lán)色色素[13]。Shoji等[14]認(rèn)為,自然條件下部分郁金香品種的花萼呈現(xiàn)紫紅色,在花瓣底部噴施外源Fe3+,花萼顏色會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色。由此表明金屬離子的種類和含量與花瓣顏色的形成有密切聯(lián)系,研究不同顏色綠絨蒿屬植物花瓣中的金屬離子對(duì)探究綠絨蒿屬植物花瓣的呈色有重要意義。

鑒于此,本研究對(duì)不同花色的綠絨蒿屬植物(包括全緣葉綠絨蒿、紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿)盛開(kāi)期花瓣中金屬離子含量進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析并篩選出這3種植物花瓣中金屬離子相關(guān)的差異表達(dá)unigene,探究不同金屬離子對(duì)綠絨蒿屬3種植物花瓣呈色的影響,以期為綠絨蒿屬植物的引種栽培、花色調(diào)控和園林應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試全緣葉綠絨蒿、紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿采集于2021年6月,根據(jù)開(kāi)花時(shí)期的形態(tài)及顏色等特征分為花蕾期(花蕾里的花瓣完全著色)、開(kāi)裂期(花蕾裂開(kāi),花瓣從花蕾露出)和盛開(kāi)期(花瓣完全展開(kāi))(圖1)。在花開(kāi)放過(guò)程中,全緣葉綠絨蒿花瓣黃色程度逐漸加深,紅花綠絨蒿花瓣紅色程度逐漸變淺,而川滇綠絨蒿花瓣藍(lán)紫色程度先加深后變淺。每種植物選擇長(zhǎng)勢(shì)相近的5株,各時(shí)期每株選擇1朵生長(zhǎng)狀態(tài)及大小相似的花朵。自然光照下,使用英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)比色卡(Royal Horticultural Society colour chart,RHSCC)確定各時(shí)期花瓣顏色。綠絨蒿屬3種植物的采集信息見(jiàn)表1。

表1 綠絨蒿屬3種植物花部的采集信息

Mi: 全緣葉綠絨蒿M. integrifolia (Maxim.) Franch.; Mp: 紅花綠絨蒿M. punicea Maxim.; Mw: 川滇綠絨蒿M. wilsonii Grey-Wilson. 從左到右依次為花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期From left to right are the bud stage, cracking stage, and blooming stage.

花蕾期和開(kāi)裂期從3株植株分別取2 g花瓣樣品,盛開(kāi)期從3株植株分別取5 g花瓣樣品,即為3次重復(fù)。采集前用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇對(duì)采樣工具進(jìn)行消毒,采集后迅速用錫箔紙包裹花瓣,裝入密封袋后立即置于干冰桶中,帶回實(shí)驗(yàn)室后移入-80 ℃超低溫冰箱保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 花瓣中金屬離子含量測(cè)定 參考黃奇等[15]的方法,取盛花期綠絨蒿屬3種植物花瓣于60 ℃烘干24 h,每種植物準(zhǔn)確稱取3份,每份0.5 g,然后于700 ℃碳化0.5 h,500 ℃灰化3.5 h,冷卻后以體積分?jǐn)?shù)5%硝酸定容至50 mL,待測(cè)。分別取質(zhì)量濃度1 000 μg·mL-1Fe3+、Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+和Zn2+標(biāo)準(zhǔn)液,用超純水配制不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,其中,Fe3+、Mg2+、Ca2+和Zn2+工作液的質(zhì)量濃度范圍為1.0～10.0 μg·mL-1,K+工作液的質(zhì)量濃度范圍為10.0～100.0 μg·mL-1,Mn2+和Cu2+工作液的質(zhì)量濃度范圍為0.1～1.0 μg·mL-1。使用AA-7000型原子火焰吸收光譜儀(日本島津公司)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo)(y)、各金屬離子含量為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Fe3+的線性回歸方程為y=0.007 5x-0.008 7(r=0.999 7),Mg2+的線性回歸方程為y=0.077 4x+0.771 6(r=0.999 9),Ca2+的線性回歸方程為y=0.051 9x+0.028 9(r=0.999 6),K+的線性回歸方程為y=0.009 2x+1.180 5(r=0.999 5),Mn2+的線性回歸方程為y=0.018 0x-0.001 4(r=0.999 7),Cu2+的線性回歸方程為y=0.153 2x-0.004 9(r=0.999 5),Zn2+的線性回歸方程為y=0.049 7x+0.005 6(r=1.000 0)。加標(biāo)回收率良好,均在95%以上。測(cè)定盛開(kāi)期花瓣樣品待測(cè)液的吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液金屬離子含量,進(jìn)一步計(jì)算花瓣樣品中Fe3+、Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+和Zn2+7種金屬離子含量。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

1.2.2.1 總RNA提取及檢測(cè) 使用TIANGEN植物總RNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取各時(shí)期花瓣樣品的總RNA,經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)ThermoFisher公司)檢測(cè)其質(zhì)量、濃度和純度。

1.2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及拼接 委托深圳華大基因科技有限公司建立cDNA文庫(kù),將質(zhì)量檢測(cè)合格的cDNA使用HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)測(cè)序,利用SOAPnuke軟件將測(cè)序所得raw read過(guò)濾,去除冗余與質(zhì)量低的序列,得到clean read,利用Trinity(v2.0.6)軟件組裝,再利用TGICL軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余,獲得最終的unigene。

1.2.2.3 Unigene功能注釋 通過(guò)BLAST軟件將所得unigene與GO、KOG、KEGG、SwissProt、NT和NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),預(yù)測(cè)unigene的氨基酸序列之后,利用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),獲得unigene的注釋信息。

1.2.2.4 差異unigene分析 利用RSEM(v1.2.8)軟件計(jì)算各樣品中unigene的表達(dá)水平。用FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值表示unigene的相對(duì)表達(dá)量,基于27個(gè)花瓣樣品轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)表達(dá)量,以|log2FC|大于等于1、FDR小于等于0.05為基準(zhǔn)〔FC為差異倍數(shù)(fold change),FDR為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)〕,利用DESeq2軟件檢測(cè)任意2個(gè)階段間的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本,篩出差異unigene,將差異unigene進(jìn)行GO功能分類,同時(shí)利用R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析,計(jì)算p值,然后對(duì)p值進(jìn)行FDR校正,通常Q值(p值的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)小于等于0.05的功能視為顯著富集,對(duì)其進(jìn)行GO富集分析。

1.2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證 參照“1.2.2.1”提取和檢測(cè)花瓣樣品的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄參照GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū),qRT-PCR以actin(CL3969.Contig4_All)為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見(jiàn)表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系參照2×T5 Fast qPCR Mix (SYBR Green Ⅰ)(北京擎科生物科技有限公司),使用LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海土森視覺(jué)科技有限公司)擴(kuò)增,qRT-PCR程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法[16]計(jì)算unigene的相對(duì)表達(dá)量。

表2 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

利用EXCEL 2019軟件整理和分析數(shù)據(jù),利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用Origin 2020和TBtools軟件作圖,其中,利用TBtools軟件中的HeatMap程序繪制unigene表達(dá)熱圖,均一化后的相對(duì)表達(dá)量大于0.5表示差異unigene明顯表達(dá)。

2 結(jié)果和分析

2.1 盛開(kāi)期綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子含量的比較

盛開(kāi)期綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子含量見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn):盛開(kāi)期綠絨蒿屬3種植物花瓣的7種金屬離子中均為K+含量最高,Cu2+含量最低。全緣葉綠絨蒿花瓣中7種金屬離子含量均顯著(P<0.05)高于紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿;紅花綠絨蒿花瓣中Fe3+、Mg2+、K+、Mn2+和Zn2+含量顯著低于川滇綠絨蒿,Ca2+和Cu2+含量顯著高于川滇綠絨蒿。從綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子含量的差異倍數(shù)來(lái)看,全緣葉綠絨蒿與紅花綠絨蒿之間以及紅花綠絨蒿與川滇綠絨蒿之間金屬離子含量差異倍數(shù)較大的均為Fe3+、Mn2+和Zn2+,全緣葉綠絨蒿與川滇綠絨蒿之間金屬離子含量差異倍數(shù)最大的為Fe3+,其次是Ca2+和Mg2+,說(shuō)明Fe3+含量在綠絨蒿屬不同種類間的差異均較大。

表3 盛開(kāi)期綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子含量

2.2 綠絨蒿屬3種植物花瓣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量 對(duì)不同花期綠絨蒿屬3種植物27個(gè)花瓣樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,獲得了1 297.10 Mb的raw read,過(guò)濾并篩選后得到1 175.19 Mb的clean read,平均每個(gè)花瓣樣品獲得43.53 Mb的clean read,各花瓣樣品的Q20和Q30的平均值分別為97.51%和90.22%。共獲得411 557個(gè)unigene,平均長(zhǎng)度為1 949 bp,N50值為2 754 bp,GC含量為38.49%。

2.2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋 將獲得的411 557個(gè)unigene進(jìn)行注釋,被GO、Pfam、KOG、KEGG、SwissProt、NT和NR 7大數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的unigene共318 657個(gè),占unigene總數(shù)的77.4%。其中注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)的unigene共171 730個(gè),占unigene總數(shù)的41.7%。被注釋的unigene分為3大類,包括生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能,分別有98 560、116 067和194 385個(gè),分別占unigene總數(shù)的23.9%、28.2%和47.2%,其中,分子功能中注釋unigene數(shù)超過(guò)10 000的二級(jí)分類有結(jié)合(87 710)、催化活性(84 496)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(10 010)。

2.3 綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子相關(guān)差異unigene的GO富集分析

綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子相關(guān)差異unigene的GO富集結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn):Fe3+和Fe2+以及Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+、Zn2+相關(guān)差異unigene分別富集于5、3、3、3、1、2和2條GO條目中,其中,Fe3+和Fe2+相關(guān)差異unigene富集的GO條目數(shù)量最多,包括三價(jià)鐵結(jié)合、亞鐵結(jié)合、鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)、鐵離子的細(xì)胞內(nèi)螯合和亞鐵螯合酶活性;鋅離子結(jié)合條目中的差異unigene數(shù)量最多(18)。

表4 綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子相關(guān)差異unigene的GO富集結(jié)果

2.3.1 Fe3+和Fe2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Fe3+和Fe2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn):全緣葉綠絨蒿花瓣中各條目明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量均較多。三價(jià)鐵結(jié)合條目中,除Unigene41916_All外,紅花綠絨蒿花瓣中差異unigene的相對(duì)表達(dá)量較低;川滇綠絨蒿花瓣中僅Unigene21411_All和Unigene41916_All明顯表達(dá)。亞鐵結(jié)合條目中,紅花綠絨蒿花瓣中僅Unigene23941_All在不同花期的相對(duì)表達(dá)量較低,川滇綠絨蒿花瓣中僅Unigene38400_All在開(kāi)裂期明顯表達(dá)。鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目中,除Unigene41916_All外,全緣葉綠絨蒿花瓣中差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中總體呈先升高后降低的趨勢(shì);紅花綠絨蒿花瓣中僅Unigene41916_All和Unigene30354_All有表達(dá),川滇綠絨蒿花瓣中僅Unigene41916_All和Unigene37626_All明顯表達(dá)。鐵離子的細(xì)胞內(nèi)螯合條目中,紅花綠絨蒿花瓣中Unigene30354_All在花蕾期明顯表達(dá),川滇綠絨蒿花瓣中Unigene164988_All在花蕾期和盛開(kāi)期明顯表達(dá)。亞鐵螯合酶活性條目中,紅花綠絨蒿花瓣中Unigene268239_All、Unigene161123_All和Unigene268237_All有明顯表達(dá),且其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈先升高后降低的趨勢(shì);川滇綠絨蒿花瓣中除Unigene94643_All、Unigene105961_All和Unigene156789_All外,其他差異unigene表達(dá)不明顯。

A: 三價(jià)鐵結(jié)合Ferric iron binding; B: 亞鐵結(jié)合Ferrous iron binding; C: 鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)Iron ion transport; D: 鐵離子的細(xì)胞內(nèi)螯合Intracellular sequestering of iron ion; E: 亞鐵螯合酶活性Ferrochelatase activity. 圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.3.2 Mg2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Mg2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn):鎂離子結(jié)合條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene中,Unigene104503_All、Unigene18125_All和CL3868.Contig1_All的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈升高趨勢(shì);紅花綠絨蒿花瓣中差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中總體表現(xiàn)為先升高后降低;川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene主要是CL9348.Contig7_All、Unigene302777_All和Unigene332283_All,其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中也呈先升高后降低的趨勢(shì)。鎂螯合酶活性條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量較多;而紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量較少,其中,紅花綠絨蒿花瓣 中Unigene64395_All、Unigene96662_All和Unigene104686_All明顯表達(dá),川滇綠絨蒿花瓣中Unigene64395_All、Unigene81539_All和Unigene2709_All明顯表達(dá)。鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中CL458.Contig43_All、Unigene41826_All和Unigene28725_All明顯表達(dá),紅花綠絨蒿花瓣中Unigene212513_All、Unigene131644_All和Unigene167437_All明顯表達(dá),川滇綠絨蒿花瓣中Unigene212513_All、CL8483.Contig8_All和Unigene28725_All明顯表達(dá)。

A: 鎂離子結(jié)合Magnesium ion binding; B: 鎂螯合酶活性Magnesium chelatase activity; C: 鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)Magnesium ion transport. 圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.3.3 Ca2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Ca2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn):鈣離子結(jié)合條目中,紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多,其次為全緣葉綠絨蒿,而川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最少。螯合鈣離子釋放到細(xì)胞溶質(zhì)條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中Unigene107949_All、Unigene107945_All和Unigene76013_All在開(kāi)花過(guò)程中明顯表達(dá),紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿花瓣中這3個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量均較低。細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)條目中,綠絨蒿屬3種植物花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene差異較大,全緣葉綠絨蒿花瓣中CL7794.Contig6_All、Unigene40892_All和CL7794.Contig2_All明顯表達(dá),紅花綠絨蒿花瓣中CL7431.Contig21_All、CL8529.Contig5_All和Unigene73196_All明顯表達(dá),川滇綠絨蒿花瓣中Unigene307276_All、Unigene63608_All、Unigene307271_All、Unigene307273_All和Unigene307272_All明顯表達(dá)。

2.3.4 K+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中K+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn):鉀離子結(jié)合條目中,紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多;其次為全緣葉綠絨蒿;川滇綠絨蒿僅4個(gè)差異unigene明顯表達(dá),其 中Unigene173262_All、CL9381.Contig32_All和Unigene339291_All的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈逐漸降低的趨勢(shì)。鉀離子穩(wěn)態(tài)條目中,綠絨蒿屬3種植物花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene差異較大,全緣葉綠絨蒿花瓣中Unigene58784_All、CL6642.Contig12_All、CL6642.Contig38_All、CL6642.Contig31_All、CL6642.Contig9_All和CL6642.Contig39_All在開(kāi)裂期和盛開(kāi)期明顯表達(dá),且除Unigene58784_All和CL6642.Contig9_All外,其他4個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈逐漸升高的趨勢(shì);紅花綠絨蒿花瓣中CL6642.Contig1_All、CL6642.Contig27_All、CL6642.Contig32_All、CL6642.Contig26_All、CL6642.Contig13_All和CL6642.Contig24_All明顯表達(dá),且除CL6642.Contig27_All外,其他5個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中均呈先降低后升高的趨勢(shì);川滇綠絨蒿花瓣中無(wú)明顯表達(dá)的差異unigene。鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中差異unigene總體無(wú)明顯表達(dá)(除Unigene31522_All外);紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多,但其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中的變化趨勢(shì)存在差異;在開(kāi)花過(guò)程中,川滇綠絨蒿花瓣中Unigene69123_All和Unigene173429_All的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì),Unigene331561_All的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)。

A: 鉀離子結(jié)合Potassium ion binding; B: 鉀離子穩(wěn)態(tài)Potassium ion homeostasis; C: 鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)Potassium ion transport. 圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.3.5 Mn2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Mn2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn):錳離子結(jié)合條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中Unigene336679_All、Unigene75693_All、Unigene66376_All和Unigene31339_All明顯表達(dá),但其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中的變化趨勢(shì)不一致;紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量較多,且相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中總體呈降低趨勢(shì),如Unigene257235_All和Unigene66186_All;川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多,且在開(kāi)花過(guò)程中,大部分差異unigene的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)(如Unigene66186_All和Unigene255534_All),少數(shù)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)(如Unigene48515_All)。

圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.3.6 Cu2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Cu2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn):銅離子結(jié)合條目中,綠絨蒿屬3種植物花瓣均存在大量明顯表達(dá)的差異unigene,以全緣葉綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多,且其中大部分差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈逐漸升高的趨勢(shì),如CL1723.Contig2_All、Unigene3029_All和Unigene54639_All;紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中的變化趨勢(shì)存在差異,部分差異unigene的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)(如Unigene332749_All、Unigene59760_All和Unigene453_All),部分差異unigene的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)(如Unigene150192_All和Unigene230440_All);川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中總體呈先升高后降低的趨勢(shì),如Unigene332749_All、Unigene44886_All和Unigene24329_All。銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多(4),除Unigene111170_All外,其他3個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中均呈先升高后降低的趨勢(shì);紅花綠絨蒿花瓣中僅CL8182.Contig4_All和CL8182.Contig5_All明顯表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈逐漸降低的趨勢(shì);川滇綠絨蒿僅CL8182.Contig5_All明顯表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中呈先降低后升高的趨勢(shì)。

A: 銅離子結(jié)合Copper ion binding; B: 銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)Copper ion transport. 圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.3.7 Zn2+相關(guān)GO富集條目 綠絨蒿屬3種植物花瓣中Zn2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)熱圖見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn):鋅離子結(jié)合條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最少,其相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中的變化趨勢(shì)差異較大;紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量最多,在開(kāi)花過(guò)程中,Unigene39244_All、Unigene55928_All、Unigene253766_All和Unigene42220_All的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì),Unigene332253_All、Unigene45551_All和Unigene256195_All的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì),而CL9410.Contig10_All和Unigene111383_All的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì);在開(kāi)花過(guò)程中,川滇綠絨蒿花瓣中Unigene88077_All、Unigene335024_All、Unigene307637_All和Unigene332253_All的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì),Unigene74051_All、Unigene313940_All、Unigene45551_All和Unigene256195_All的相對(duì)表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)。對(duì)鋅離子的反應(yīng)條目中,全緣葉綠絨蒿花瓣中Unigene91043_All、Unigene60679_All和Unigene81741_All明顯表達(dá);紅花綠絨蒿花瓣中Unigene42528_All和Unigene335547_All明顯表達(dá);川滇綠絨蒿花瓣中僅Unigene335547_All明顯表達(dá)。

A: 鋅離子結(jié)合Zinc ion binding; B: 對(duì)鋅離子的反應(yīng)Response to zinc ion. 圖中標(biāo)尺表示均一化后的相對(duì)表達(dá)量The scale in the figure represents the relative expression after normalization. Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

2.4 綠絨蒿屬3種植物花瓣中差異unigene的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

從上述與綠絨蒿屬3種植物花瓣中金屬離子相關(guān)的差異unigene中,隨機(jī)挑選6個(gè)明顯表達(dá)的差異unigene進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可見(jiàn):綠絨蒿屬3種植物花瓣中6個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花過(guò)程中的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及篩選出的與金屬離子相關(guān)的差異unigene的表達(dá)具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性。

Mi1,Mi2,Mi3: 分別為全緣葉綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. integrifolia (Maxim.) Franch., respectively; Mp1,Mp2,Mp3: 分別為紅花綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. punicea Maxim., respectively; Mw1,Mw2,Mw3: 分別為川滇綠絨蒿花蕾期、開(kāi)裂期和盛開(kāi)期Bud stage, cracking stage, and blooming stage of M. wilsonii Grey-Wilson, respectively.

3 討論和結(jié)論

花瓣中的金屬離子含量對(duì)開(kāi)花過(guò)程花瓣呈色有十分重要的影響,是影響花色的主要因子之一。盛開(kāi)期,全緣葉綠絨蒿花瓣中Fe3+、Mg2+、Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+和Zn2+7種金屬離子含量均顯著(P<0.05)高于紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿;紅花綠絨蒿花瓣中Fe3+、Zn2+、Mn2+、Mg2+和K+含量顯著低于川滇綠絨蒿,Cu2+和Ca2+含量顯著高于川滇綠絨蒿。菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)花色形成的表型研究結(jié)果表明:Fe3+、Mg2+、Al3+和Ca2+與菊花紅色品種花瓣中的花青素共同作用對(duì)花瓣起到增色作用;而菊花白色品種花瓣中以黃酮類化合物為主,這4種金屬離子對(duì)其花瓣顏色無(wú)明顯影響[17]。本研究中,盛開(kāi)期全緣葉綠絨蒿花瓣Fe3+和Mg2+含量顯著高于紅花綠絨蒿和川滇綠絨蒿,且其花瓣富含黃酮類化合物[18],并在Fe3+與Fe2+相關(guān)GO富集條目存在明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最多,在Mg2+相關(guān)GO富集條目中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量也較多,推測(cè)其花瓣中富含的Fe3+和Mg2+與黃酮類化合物未共同作用,進(jìn)而沒(méi)有對(duì)花瓣起增色作用,說(shuō)明Fe3+和Mg2+并非黃色花形成的主要原因。紅花綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在亞鐵結(jié)合和鎂離子結(jié)合條目中較多,推測(cè)其花瓣中Fe2+和Mg2+與花青素共同作用對(duì)花瓣有增色作用,使其花瓣在開(kāi)花過(guò)程中呈紅色,并且紅花綠絨蒿富集于亞鐵螯合酶活性和鎂螯合酶活性條目的差異unigene存在明顯表達(dá),可能Fe2+和Mg2+在花瓣中的螯合作用也影響其花色形成。對(duì)川滇綠絨蒿在Fe3+、Fe2+和Mg2+相關(guān)GO富集條目所富集的差異unigene整體分析,發(fā)現(xiàn)除三價(jià)鐵結(jié)合條目外,川滇綠絨蒿花瓣中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最少,鎂離子結(jié)合條目上明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量相對(duì)較多,如CL9348.Contig7_All、Unigene302777_All和Unigene332283_All,且這3個(gè)差異unigene的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),與該種花瓣藍(lán)紫色程度在開(kāi)花過(guò)程先加深后變淺相吻合。已有研究結(jié)果表明:川滇綠絨蒿花瓣中矢車菊素可與Fe3+形成藍(lán)色復(fù)合物[19],而在大花綠絨蒿的藍(lán)色花瓣中影響花色形成的新型金屬?gòu)?fù)合體色素是由Fe3+、Mg2+與黃酮醇、矢車菊素衍生物結(jié)合形成[13],由此分析川滇綠絨蒿花瓣呈藍(lán)紫色可能與Fe3+、Mg2+形成了金屬?gòu)?fù)合物有一定的聯(lián)系。

花色研究結(jié)果顯示:白及〔Bletillastriata(Thunb. ex Murray) Rchb. f.〕花瓣中總花青素含量與Zn2+含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,而與Mn2+含量則呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系[20]。雖然全緣葉綠絨蒿花瓣中Mn2+和Zn2+含量最高,但Mn2+和Zn2+相關(guān)GO富集條目(對(duì)鋅離子的反應(yīng)條目除外)存在明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最少,分析該植物花瓣中Zn2+和Mn2+相關(guān)unigene的不明顯表達(dá)可能影響了Zn2+和Mn2+對(duì)花色的作用,這2種金屬離子可能與全緣葉綠絨蒿花色無(wú)關(guān);雖然紅花綠絨蒿花瓣中Zn2+和Mn2+相關(guān)GO富集條目中明顯表達(dá)的差異unigene較多,但其花瓣中Zn2+和Mn2+含量最低,推測(cè)紅花綠絨蒿花瓣中花青素的形成與Mn2+有一定聯(lián)系;川滇綠絨蒿花瓣中鋅離子結(jié)合條目中存在明顯表達(dá)的差異unigene,但是對(duì)鋅離子的反應(yīng)條目?jī)HUnigene335547_All明顯表達(dá),而Mn2+相關(guān)GO富集條目中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最多,推測(cè)與Zn2+相比較其花瓣顏色更受Mn2+影響。

有關(guān)‘芙蓉李’(Prunussalicina‘Furong’)花色苷穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明:高含量K+有助于花色苷構(gòu)型穩(wěn)固[21]。高賽等[22]研究了長(zhǎng)春花〔Catharanthusroseus(Linn.) G. Don〕的花色,認(rèn)為隨著Ca2+含量的升高,花瓣的亮度逐漸升高,而紅度降低,花色呈現(xiàn)變淺的趨勢(shì)。趙雨朦等[23]通過(guò)水培試驗(yàn)測(cè)定不同Zn2+和Cu2+含量下翅堿蓬〔Suaedasalsa(Linn.) Pall.〕的花青素和葉綠素含量,認(rèn)為低含量Zn2+和Cu2+能夠促進(jìn)翅堿蓬花青素和葉綠素的合成及植株生長(zhǎng)。李慧波[24]認(rèn)為,大量Ca2+和Mg2+與花色素(矢車菊素與飛燕草素的含量比為10∶1)形成的螯合物可能是紫露草(TradescantiaohiensisRaf.)花瓣呈藍(lán)紫色的主要原因。全緣葉綠絨蒿花瓣中Ca2+含量最高,Ca2+相關(guān)GO富集條目中鈣離子結(jié)合和細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)條目存在的明顯表達(dá)差異unigene數(shù)量?jī)H次于紅花綠絨蒿,螯合鈣離子釋放到細(xì)胞溶質(zhì)條目中僅全緣葉綠絨蒿花瓣中的差異unigene明顯表達(dá);該種類花瓣在Cu2+相關(guān)GO富集條目存在明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最多,其中銅離子結(jié)合條目中明顯表達(dá)的差異unigene主要呈逐漸升高的趨勢(shì),與開(kāi)花過(guò)程中黃色花瓣顏色的加深相對(duì)應(yīng)。結(jié)合高賽等[22]的研究結(jié)果,全緣葉綠絨蒿花瓣中Ca2+含量最高,其花瓣呈亮度較高的黃色,推測(cè)其花色形成與花瓣中Ca2+含量相關(guān),全緣葉綠絨蒿花瓣顏色可能受Cu2+和Ca2+及相關(guān)GO富集條目中差異unigene明顯表達(dá)的影響。紅花綠絨蒿花瓣在鈣離子結(jié)合條目中明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中最多,但螯合鈣離子釋放到細(xì)胞溶質(zhì)條目中無(wú)明顯表達(dá)的差異unigene;其花瓣中Ca2+含量?jī)H次于全緣葉綠絨蒿,但其花瓣呈鮮艷的紅色,推測(cè)花瓣中Ca2+與其花色形成無(wú)關(guān);K+相關(guān)GO富集條目中,紅花綠絨蒿花瓣明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量除鉀離子穩(wěn)態(tài)條目?jī)H次于全緣葉綠絨蒿外,其余條目均為最高;而該花瓣在銅離子結(jié)合條目有較多數(shù)量明顯表達(dá)的差異unigene,銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)條目中2個(gè)差異unigene也存在表達(dá),這些unigene相對(duì)表達(dá)量總體在開(kāi)花過(guò)程中隨花期表現(xiàn)為持續(xù)降低,與花瓣的紅色程度在開(kāi)花過(guò)程中變淺相吻合,由此推測(cè)紅花綠絨蒿的花色形成與K+和Cu2+相關(guān)差異unigene的表達(dá)有密切聯(lián)系。川滇綠絨蒿花瓣中Ca2+含量最低,且其螯合鈣離子釋放到細(xì)胞溶質(zhì)條目中無(wú)明顯表達(dá)的差異unigene,結(jié)合李慧波[24]的研究結(jié)果,分析該花瓣呈藍(lán)紫色未受到Ca2+影響;川滇綠絨蒿花瓣在K+相關(guān)GO富集條目上明顯表達(dá)的差異unigene數(shù)量在供試綠絨蒿屬3種植物中均最少,故推測(cè)K+不是影響藍(lán)紫色花形成的關(guān)鍵金屬離子;該植物花瓣在銅離子結(jié)合條目中存在較多明顯表達(dá)的差異unigene,且其相對(duì)表達(dá)量總體在開(kāi)花過(guò)程中呈先升高后降低的趨勢(shì),與川滇綠絨蒿藍(lán)紫色花瓣在開(kāi)花過(guò)程中呈先加深后變淺的變化相對(duì)應(yīng),而在供試綠絨蒿屬3種植物中川滇綠絨蒿花瓣中Cu2+含量最低,低含量Cu2+又會(huì)促進(jìn)花青素的合成,由此推測(cè)藍(lán)紫色花的形成與低含量的Cu2+及其相關(guān)差異unigene的表達(dá)有關(guān)。

綠絨蒿屬不同種類開(kāi)花過(guò)程中的花色存在明顯差異,本研究從生理和分子2個(gè)方面聯(lián)合探究了7種金屬離子與花瓣呈色的關(guān)系,認(rèn)為各金屬離子及其相關(guān)的差異unigene對(duì)花色的形成具有不同程度的調(diào)控,尤其是Fe3+和Mg2+。目前對(duì)花色在分子層面的研究已經(jīng)越來(lái)越受到重視,但更多的還是停留于KEGG通路及相關(guān)花色素合成的基因,金屬離子方面還存在大量空白,需要進(jìn)一步探究,進(jìn)而為花色調(diào)控機(jī)制提供更全面的理論依據(jù),推進(jìn)植物花色調(diào)控的研究進(jìn)程。