劉麗娟 ,何健龍 ,馬元慶 ,王瑋云 ,姜向陽 ,劉愛英 ,王軍,宋秀凱

(1.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006;2.中國海洋大學海洋生命學院 青島 266000)

0 引言

高效氟吡甲禾靈(HPME)的化學名稱為2-[4-(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶氧基)苯氧基]丙酸甲酯,分子式為C16H13Cl F3NO4[1],是禾本科植物選擇性芳氧苯氧丙酸酯類除草劑,具有殺草快、內(nèi)吸作用強及對作物高度安全等特點,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用于大豆、棉花、花生、油菜、苗圃、亞麻等闊葉作物田中防除多種禾本科雜草[2-3]?；セ撞?Spartinaalterniflora)是世界很多地區(qū)海岸帶生態(tài)系統(tǒng)的入侵者,為防止其快速蔓延,科學家們探索多種物理、化學防治方法[4-8],但至今仍缺少經(jīng)濟、環(huán)保、高效的辦法解決這一國際性難題[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn),HPME 對互花米草的滅除效果良好,不僅能殺死互花米草的地上部分,阻止其種子正常發(fā)育,切斷其有性繁殖擴散途徑,而且能損傷互花米草的根部,有效抑制其無性繁殖。因此,HPME有望在我國互花米草防治工作中發(fā)揮重要作用[10-11]。

作為廣泛使用的農(nóng)田除草劑,HPME 在環(huán)境中的殘留常被檢出[12]。HPME 能夠影響土壤呼吸強度及土壤酶活性,過量施用及殘留對土壤生態(tài)系統(tǒng)存在一定的風險[13]。土壤中的HPME 可隨降水、淋溶和徑流遷移進入水體,如松花江水中檢出HPME濃度達9.8μg/L[14],可能對水生態(tài)系統(tǒng)安全產(chǎn)生威脅。目前針對HPME 對陸生生物的毒性研究較全面[15-16],現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示其對哺乳動物、鳥類、昆蟲的毒性很低。然而HPME對不同水生生物的毒性差異較大,如HPME 能夠誘導斑馬魚(Barchydanioreriovar)胚胎發(fā)育缺陷[17],對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)和藍鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)的96 h 半數(shù)致死濃度(LC50)分別為0.460 mg/L[18]和0.227 mg/L[19],對浮萍(Lemna minor)的14 d半數(shù)效應濃度(EC50)為3.1 mg/L,對黑頭呆魚(Pimephalespromelas)的28 d LC50為3.6 mg/L[16]。由于互花米草主要入侵濱海灘涂濕地和河口區(qū)域,在噴灑HPME開展互花米草防治的過程中,部分未被吸收的藥物進入鄰近海域,可能對近岸海水養(yǎng)殖和海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良影響。

本研究選取3種我國重要的海洋經(jīng)濟生物即四角蛤蜊(Mactraveneriformis)、刺參(Apostichopus japonicus)和半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis),以及1種互花米草入侵灘涂的生物優(yōu)勢種即琵琶擬沼螺(Assiminea.lutea)為試驗對象,采用靜水生物試驗法分別開展研究,探討HPME對不同海洋生物的急性毒性效應,確定HPME對不同海洋生物的安全濃度(SC)和毒性等級,以期為評估HPME 在海岸帶互花米草防治中的應用前景、保障海水養(yǎng)殖及海洋環(huán)境生態(tài)安全提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用HPME由江蘇中旗科技股份有限公司生產(chǎn),依據(jù)相關標準[20]實測濃度為97.9 g/L。試驗選用海水取自煙臺套子灣近海,經(jīng)砂濾后使用,鹽度為30±1‰,pH 值為8.0±0.1,試驗水溫為18.0±1.0℃。

1.2 試驗生物

四角蛤蜊采自東營近海,殼長2.0～3.1 cm;刺參幼體取自煙臺安源水產(chǎn)有限公司,體長8.0～11.8 cm;半滑舌鰨魚苗取自煙臺天源水產(chǎn)有限公司,體長7.3～8.2 cm;琵琶擬沼螺采自煙臺萊州互花米草生長區(qū)灘涂,殼高3.7～6.5 mm。四角蛤蜊、刺參、半滑舌鰨于室內(nèi)暫養(yǎng)2周,期間分別投喂單胞藻、刺參配合飼料和魚用配合飼料,每天投喂2次、換水2次,持續(xù)充氣,及時挑出死亡和不健康個體,并于試驗前1天停止投喂;琵琶擬沼螺于室內(nèi)充氣暫養(yǎng)4 h,不投餌。在4種海洋生物樣品中選擇體表無損傷、在水中運動活躍、受刺激反應靈敏的健康個體,隨機分組用于急性毒性試驗。

1.3 試驗方法

在15 L的塑料養(yǎng)殖箱中進行試驗,試驗用水體積為10 L。參考《水生生物毒性試驗方法》[21],采用靜水生物試驗法。在各試驗組養(yǎng)殖箱的海水中加入HPME并調(diào)至預設濃度,每個箱內(nèi)放入10只待試生物,期間不投喂、不換水并微量充氣;在正式試驗開始前分別對每種生物進行預試驗,根據(jù)預試驗結(jié)果確定正式試驗藥品的濃度范圍;采用等對數(shù)間距法設置7～11個濃度梯度,每個梯度設3個平行,同時做空白對照;在試驗過程中隨時觀察和記錄生物的活動狀態(tài),及時撈出死亡的個體,并記錄24 h、48 h、72 h和96 h的生物死亡數(shù)。

關于死亡判定標準,四角蛤蜊為以鑷子輕夾雙殼后沒有閉合反應,刺參為以外力刺激后其體壁及觸手不發(fā)生收縮反應,半滑舌鰨為伏于水底以及受刺激無反應,琵琶擬沼螺為以眼科鑷子拉出厴和腹足刺激后沒有明顯回縮。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生物死亡率的校正公式[22]為:

式中:P為經(jīng)校正后的試驗組死亡率;C為對照組死亡率;P'為取平行組平均值的試驗組死亡率。

采用WPS表格進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計,建立質(zhì)量濃度-死亡率回歸方程。采用SPSS 20.0軟件中的概率單位回歸(Probit)模塊,分別進行24 h、48 h、72 h 和96 h 的死亡率卡方檢驗,計算LC50及其95%置信區(qū)間。

根據(jù)急性毒性試驗數(shù)據(jù)計算安全濃度,計算公式[21]為:

式中:96 h LC50表示96 h半數(shù)致死濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPME對四角蛤蜊的急性毒性效應

HPME對四角蛤蜊的毒性試驗設置1個對照組和9個試驗組,HPME 質(zhì)量濃度分別為0、0.29 mg/L、0.44 mg/L、0.66 mg/L、0.99 mg/L、1.49 mg/L、2.23 mg/L、3.35 mg/L、5.02 mg/L 和7.53 mg/L。在試驗過程中,對照組中所有四角蛤蜊的水管和斧足很快從殼中伸出,形態(tài)舒展,受外界刺激后立即縮回殼內(nèi)且雙殼緊閉。各試驗組中四角蛤蜊的反應能力均有所下降,其中HPME 濃度0.29 mg/L組和0.44 mg/L 組中四角蛤蜊水管伸出殼的長度稍短,受刺激后縮回且雙殼緊閉;0.66 mg/L及以上組中多數(shù)四角蛤蜊閉殼肌松弛,貝殼呈微張狀態(tài),對刺激反應遲緩,斧足回縮和閉殼反應緩慢。在HPME脅迫24 h后,0.99 mg/L及以上組中的四角蛤蜊出現(xiàn)死亡個體,且死亡率隨HPME濃度升高而逐步上升,其中7.53 mg/L 組中的死亡率最高,達93.3%。隨著脅迫時間的延長,各試驗組中的四角蛤蜊死亡率均逐步上升。至HPME 脅迫96 h時,對照組和0.29 mg/L 組中的四角蛤蜊無死亡,而2.23 mg/L及以上組中的四角蛤蜊全部死亡(圖1)。

圖1 不同試驗時間的四角蛤蜊死亡率與HPME質(zhì)量濃度的關系Fig.1 Relationship between mortality rate of Mactra veneriformis and HPME mass concentration in different experiment time

2.2 HPME對刺參幼體的急性毒性效應

HPME對刺參幼體的毒性試驗設置1個對照組和11個試驗組,HPME 質(zhì)量濃度分別為0、1.17 mg/L、1.29 mg/L、1.42 mg/L、1.56 mg/L、1.72 mg/L、1.89 mg/L、2.08 mg/L、2.20 mg/L、3.30 mg/L、4.96 mg/L和7.43 mg/L。在試驗過程中,對照組中所有刺參的背部疣刺自然突出,以管足牢固附著于水箱壁或充氣石上,受外界刺激后參體立即收縮,反應靈敏。試驗組中刺參的體壁松弛,體型延長,運動能力下降,具體表現(xiàn)為管足吸附力減弱、貼壁率顯著降低以及受刺激后反應遲緩。在HPME 脅迫24 h后,1.17 mg/L 組中的刺參貼壁率為10%,顯著低于對照組的貼壁率100%,其他試驗組中的刺參無貼壁現(xiàn)象;1.56 mg/L 及以上組中的刺參整體呈麻痹狀態(tài)橫臥于水中,個別刺參出現(xiàn)排臟現(xiàn)象,疣刺開始泛白和腫脹,甚至表皮破裂和潰爛;3.30 mg/L及以上組中的刺參出現(xiàn)死亡個體,且死亡率隨HPME濃度升高而上升,7.43 mg/L組中的刺參全部死亡。在HPME 脅迫48 h后,各試驗組中的刺參死亡率急劇上升,其中1.56 mg/L 組中的刺參出現(xiàn)死亡個體,2.20 mg/L 組中的刺參全部死亡。至HPME 脅迫96 h時,1.17 mg/L 組中的刺參出現(xiàn)死亡個體,1.89 mg/L組中的刺參全部死亡。由此可見,刺參在24 h內(nèi)對HPME的耐受性較高,但其耐受性隨脅迫時間的延長而快速下降(圖2)。

圖2 不同試驗時間的刺參幼體死亡率與HPME質(zhì)量濃度的關系Fig.2 Relationship between mortality rate of Apostichopus japonicas larvae and HPME mass concen-tration in different experiment time

2.3 HPME對半滑舌鰨魚苗的急性毒性效應

HPME對半滑舌鰨魚苗的毒性試驗設置1個對照組和7 個試驗組,HPME 質(zhì)量濃度分別為0、0.29 mg/L、0.35 mg/L、0.42 mg/L、0.51 mg/L、0.61 mg/L、0.73 mg/L和0.88 mg/L。在試驗過程中,對照組中所有半滑舌鰨游動活躍,而各試驗組中半滑舌鰨運動能力下降,其中0.73 mg/L 及以上組中的半滑舌鰨出現(xiàn)魚體腹面朝上現(xiàn)象。在HPME脅迫24 h時,0.73 mg/L組中的半滑舌鰨出現(xiàn)死亡個體,0.88 mg/L組中的半滑舌鰨全部死亡。在HPME脅迫72 h時,0.61 mg/L 組中的半滑舌鰨出現(xiàn)死亡個體。在 HPME 脅迫96 h 時,0.73 mg/L組中的半滑舌鰨全部死亡。由此可見,在達到某個臨界值后,半滑舌鰨魚苗的死亡率隨HPME濃度升高而快速上升(圖3)。

圖3 不同試驗時間的半滑舌鰨魚苗死亡率與HPME質(zhì)量濃度的關系Fig.3 Relationship between mortality rate of Cynoglossus semilaevis fry and HPME mass concentration in different experiment time

2.4 HPME對琵琶擬沼螺的急性毒性效應

HPME對琵琶擬沼螺的毒性試驗設置1個對照組和7個試驗組,HPME質(zhì)量濃度分別為0、1.47 mg/L、2.20 mg/L、3.30 mg/L、4.96 mg/L、7.43 mg/L、11.15 mg/L和16.73 mg/L。由于琵琶擬沼螺體型小,判斷其死亡的方法對其個體傷害很大,僅統(tǒng)計其在HPME 脅迫96 h 時的死亡率。在試驗過程中,對照組中所有琵琶擬沼螺很快伸出腹足吸附于養(yǎng)殖箱壁并向上攀爬,受刺激后立即從箱壁脫落,腹足迅速收回殼內(nèi)且厴緊閉。試驗組中琵琶擬沼螺運動能力下降,無以腹足貼箱壁攀爬現(xiàn)象,多數(shù)螺的厴閉口不緊,腹足松弛且稍伸出殼外,受刺激后反應遲緩,個別螺厴緊閉。隨著HPME脅迫時間的延長,試驗組中所有琵琶擬沼螺均分泌黏液將厴及螺口包圍,且黏液量隨HPME 濃度升高而增加。在HPME脅迫96 h時,2.20 mg/L 組中的琵琶擬沼螺出現(xiàn)死亡個體,16.73 mg/L組中的琵琶擬沼螺死亡率為86.7%(圖4)。

圖4 96 h的琵琶擬沼螺死亡率與HPME質(zhì)量濃度的關系Fig.4 Relationship between mortality rate of Assiminea.lutea and HPME mass concentration in 96 h

2.5 HPME對4種海洋生物的急性毒性特征

試驗結(jié)果顯示,在不同HPME 脅迫時間下,4種海洋生物的死亡率與HPME 質(zhì)量濃度的對數(shù)均呈顯著的正相關關系(p<0.05)。其中,四角蛤蜊、刺參幼體和半滑舌鰨魚苗的LC50隨HPME 脅迫時間的延長而減小,具有明顯的累積毒性(表1)。

表1 HPME對4種海洋生物的急性毒性特征Table 1 The acute toxicity characteristics of Haloxyfop-R-methyl to 4 marine organisms

依據(jù)試驗所得安全濃度,HPME 急性毒性由大至小的海洋生物依次為半滑舌鰨魚苗、四角蛤蜊、刺參幼體、琵琶擬沼螺,其中魚類對HPME最敏感。以96 h LC50為依據(jù)進行毒性等級劃分[23],HPME對半滑舌鰨魚苗和四角蛤蜊的毒性為高毒(0.1 mg/L<96 h LC50≤1.0 mg/L),對刺參幼體和琵琶擬沼螺的毒性為中毒(1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L)。

3 討論

3.1 HPME的生物毒性效應

HPME 暴露能改變大鼠(Rattusnorvegicus)的肝腎功能,并誘導其氧化應激和睪丸的形態(tài)學變化[24];HPME 具有神經(jīng)毒性,會造成小鼠(Mus musculus)的捕食行為障礙[25];HPME 可抑制塔氏油白魚(Chalcalburnustarichii)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性,人類長期攝入可能致使肝臟腫瘤產(chǎn)生[26];HPME可通過氧化應激反應等造成斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷,降低其孵化率,還會使斑馬魚脊柱變形,抑制其運動能力,降低其心率和存活率[17]。本研究試驗發(fā)現(xiàn),四角蛤蜊、刺參幼體、半滑舌鰨魚苗和琵琶擬沼螺受HPME脅迫后均表現(xiàn)出肌肉松弛、運動能力下降和受外界刺激反應遲鈍現(xiàn)象,表明HPME對4種海洋生物均具有神經(jīng)毒性,與對小鼠的研究結(jié)果[25]相符。HPME對4種海洋生物的LC50均隨脅迫時間的延長而減小,表明存在較為明顯的蓄積急性致毒效果。在互花米草防治過程中,HPME 能在短期改變互花米草根際土壤中的微生物豐度和群落結(jié)構(gòu),并導致細菌多樣性的變化[27]。

3.2 HPME對水生生物的急性毒性

HPME 對淡水魚虹鱒和藍鰓太陽魚的96 h LC50分別為0.460 mg/L[18]和0.227 mg/L[19],與海水魚許氏平鲉(Sebastesschlegelii)的0.578 mg/L[28]和半滑舌鰨魚苗的0.656 mg/L 差距不大。HPME對淡水節(jié)肢動物大型溞(Daphnia magna)的48 h EC50不小于12.300 mg/L[18],而對海水節(jié)肢動物安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)的48 h LC50為0.107 mg/L[28]。HPME對海水雙殼貝類牡蠣(Crassostreagigas)的96 h LC50(47.100 mg/L)[28]為四角蛤蜊(0.888 mg/L)的53倍,分析認為這是由于牡蠣的閉殼肌發(fā)達且抗逆性強,受外界刺激后立即緊閉雙殼將其軟體部分與海水隔絕,從而能夠顯著降低HPME 的傷害。本研究中,HPME 對琵琶擬沼螺的96 h LC50(8.674 mg/L)為半滑舌鰨魚苗(0.656 mg/L)的13倍,在試驗過程中發(fā)現(xiàn)當琵琶擬沼螺受外界刺激后,所有螺口均分泌黏液將螺口及厴緊密包圍,且黏液量隨HPME濃度升高而增加,推測得益于厴和黏液的保護作用,使螺的軟體部分與海水中的污染物隔離,從而提高其對HPME的耐受性。結(jié)果顯示,HPME對不同海洋生物的急性毒性差異很大,其中對安氏偽鏢水蚤、許氏平鲉、半滑舌鰨魚苗和四角蛤蜊為高毒,對刺參和琵琶擬沼螺為中毒,對牡蠣為低毒。

結(jié)合其他研究結(jié)果[29-30],不同除草劑對同種海洋生物的急性毒性差異也很大。按有效成分計,6種除草劑對刺參幼體的毒性由大到小依次為百草枯(0.032 1 mg/L)、HPME (1.382 0 mg/L)、滅草松(3.115 6 mg/L)、乙草胺(3.445 5 mg/L)、撲草凈(7.440 0 mg/L)、特丁基三嗪(14.886 0 mg/L);對刺參幼體的毒性等級,百草枯為劇毒(96 h LC50≤0.1 mg/L),特丁基三嗪為低毒(96 h LC50>10.0 mg/L),其他4種除草劑均為中毒(1.0 mg/L<96 h LC50≤10.0 mg/L)[23]。

3.3 HPME在海岸帶生態(tài)修復中應用的可行性

HPME在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于農(nóng)田清除禾本科雜草[9,31],具有毒性低、分解代謝快的特點。近年來研究發(fā)現(xiàn),當HPME 用量為0.432 kg/hm2時,可對互花米草達到良好的防治效果[4,9],且HPME為苗后除草劑,施藥后其大部分吸附于互花米草葉片上并被迅速吸收,少量落在土壤中的藥物殘留量呈指數(shù)衰減,半衰期為2.6～4.9 d,在30 d后幾乎全部消失[13]。本研究項目組于2020年9月在萊州沙河灘涂開展互花米草防治實驗的結(jié)果顯示,HPME噴施0.194 kg/hm2能夠有效殺滅互花米草,對混生的本土植物鹽地堿蓬(Suaedasalsa)和鹽角草(Salicorniaeuropaea)無影響,且實驗區(qū)灘涂的生物種類和結(jié)構(gòu)未見明顯變化,優(yōu)勢種琵琶擬沼螺、古氏灘棲螺(Batillariacumingi)和紅樹擬蟹守螺(Cerithidearhizophorarum)均未發(fā)生死亡現(xiàn)象。可見,使用HPME防治互花米草具有用量少、見效快和效果好的優(yōu)勢。在黃河三角洲的實驗發(fā)現(xiàn),在施藥11 個月后,HPME 實驗區(qū)的日本刺沙蠶(Neanthesjaponica)數(shù)量遠高于對照組[10],與在澳大利亞鹽沼開展的精吡氟禾草靈防控大米草(Spartinaanglica)的長期生態(tài)影響的研究結(jié)果一致[32]。由于我國海岸帶生物資源豐富,海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達,近岸海域及濱海灘涂遍布養(yǎng)殖區(qū),海岸周邊分布大量海水養(yǎng)殖場和育苗場,在使用HPME開展互花米草防治時,必須開展HPME對海洋生物生態(tài)的安全性評估。

本研究試驗選取的四角蛤蜊、刺參、半滑舌鰨和琵琶擬沼螺分別為海洋雙殼貝類、棘皮類、魚類和腹足類動物,對于開展HPME在海岸帶生態(tài)修復中的應用風險評估具有一定的參考價值。然而一方面,海洋生物種類繁多且生活史復雜,有必要進一步開展HPME對海洋生物生長繁殖和胚胎發(fā)育的影響和毒性機理,以及HPME在不同海洋生物體內(nèi)富集代謝的規(guī)律等研究,以全面評價HPME的安全性;另一方面,應用HPME 防治互花米草具有用量低、效果好、成本低、可機械化操作的優(yōu)勢,應積極研究和篩選適用區(qū)域,優(yōu)化施藥量、施藥方法和施藥時間,并及時開展跟蹤監(jiān)測和評價,確保海水養(yǎng)殖及海洋生態(tài)環(huán)境安全。

4 結(jié)語

在除草劑HPME 的脅迫下,四角蛤蜊、刺參幼體、琵琶擬沼螺和半滑舌鰨魚苗均表現(xiàn)出肌肉松弛、運動能力下降和受外界刺激反應遲鈍現(xiàn)象,表明HPME對海洋生物具有神經(jīng)毒性;隨著HPME脅迫時間的延長,4種海洋生物的LC50均逐漸下降,表明HPME具有蓄積急性致毒效應。按HPME急性毒性由大到小排列,4種海洋生物依次為半滑舌鰨魚苗、四角蛤蜊、刺參幼體、琵琶擬沼螺,總體表現(xiàn)為HPME對魚類和雙殼貝類為高毒,對棘皮類和腹足類為中毒。因此,使用HPME開展互花米草防治應做好用藥前的生態(tài)風險評估,并嚴格控制HPME劑量。