吳亮

【摘要】? 目的? ? 探討上饒衛(wèi)校附屬醫(yī)院肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，KPN）的臨床分布及其耐藥性。方法? ? 選擇上饒衛(wèi)校附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2018年3月—2020年7月各類臨床樣本中分離培養(yǎng)獲得的782株KPN，分析KPN樣本來源、科室分布情況及其耐藥性。結(jié)果? ? KPN樣本來源主要為尿液，占比55.37%，其次為血液、痰液，分別占比32.61%、9.72%；KPN樣本來源科室主要為重癥醫(yī)學(xué)科，占比50.51%，其次為呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科，分別占比20.97%、13.94%；KPN樣本中耐藥率最高的為氨芐西林，耐藥率為100.00%，其次為復(fù)方新諾明、頭孢唑林，耐藥率為52.05%、46.55%，敏感度最高的為阿米卡星，敏感度為93.22%，其次為亞胺培南、美羅培南，敏感度為89.26%、89.51%。結(jié)論? ? KPN主要來源于重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科，主要源自血液、尿液和痰液樣本，對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、頭孢唑林耐藥率較高。

【關(guān)鍵詞】? 肺炎克雷伯菌； 臨床分布； 耐藥性； 藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R446.5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）25-0098-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.25.032

目前，全球范圍內(nèi)細(xì)菌耐藥情況已日趨嚴(yán)重，既會(huì)威脅人類健康，還會(huì)影響生態(tài)環(huán)境。因抗生素種類繁多或長期大劑量使用廣譜抗生素，使得部分人體內(nèi)菌群失調(diào)，正常菌群數(shù)量減少，增加條件致病菌侵襲風(fēng)險(xiǎn)，增加了耐藥發(fā)生率[1-2]。肺炎克雷伯菌

（KPN）屬于革蘭陰性菌，是院內(nèi)感染常見的條件致病菌之一，具有易形成耐藥、廣泛的環(huán)境適應(yīng)性、較強(qiáng)的致病性等特征，常存在于人體的呼吸道、腸道內(nèi)，可誘發(fā)泌尿系感染、肺部感染、敗血癥、肝膿腫和膽囊炎等疾病[3-4]。一般KPN感染早期無典型性特征，易被臨床低估其嚴(yán)重程度。本研究選擇上饒衛(wèi)校附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2018年3月—2020年7月各類臨床樣本中分離培養(yǎng)獲得的782株KPN，分析KPN的臨床分布及其耐藥性，為盡早控制KPN在院內(nèi)傳播提供參考依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 菌株來源? ? 選擇上饒衛(wèi)校附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科2018年3月—2020年7月各類臨床樣本中分離培養(yǎng)獲得的782株KPN，排除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株。

1.2? ? 主要儀器和試劑? ? 主要儀器和試劑包括：珠海迪爾生物有限公司的藥敏檢測試劑卡和腸桿菌科細(xì)菌鑒定卡、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及藥敏分析系統(tǒng)；江蘇常州朗越公司的CHA-SA型恒溫振蕩器；湖南湘儀公司生產(chǎn)的臺(tái)式高速離心機(jī)（CTG16-WS型）；上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的恒溫培養(yǎng)箱；賽多利科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)的電子天平；美國Millipore公司的超純水系統(tǒng)；廣東環(huán)凱微生物科技有限公司的胰蛋白胨、酵母粉；廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司提供的0.9%氯化鈉注射液；天津市福晨化學(xué)試劑廠提供的氯化鈉；南京茂捷生物科技有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂粉；艾拓思公司的鼓風(fēng)干燥箱；江蘇常州朗越公司恒溫振蕩器（CHA-SA型）；質(zhì)控菌株由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，即肺炎克雷伯菌ATCC 70063、大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 25923。

1.3? ? 方法? ? 研究方法具體如下。

1.3.1? ? 培養(yǎng)基及主要溶液配制? ? （1）LB固體培養(yǎng)基。稱取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g和瓊脂粉16 g，置于燒杯內(nèi)，加入超純水900 mL，攪拌至完全溶解，用濃度為1 mmol/L的NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0，隨后用超純水定容至1 L，放入溫度為

121 ℃的高壓滅菌鍋（1.034×105 Pa）內(nèi)滅菌20 min。取出，冷卻至50～60 ℃，倒入無菌平板，凝固后放置在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩＃?）LB液體培養(yǎng)基。稱取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，置于燒杯內(nèi)，加入超純水900 mL，攪拌至完全溶解，用濃度為1 mmol/L的NaOH將溶液pH值調(diào)節(jié)至7.0，隨后用超純水定容至1 L，分裝至試管中，每支試管分裝3 mL，放入溫度為121℃的高壓滅菌鍋（1.034×105 Pa）內(nèi)滅菌20 min。取出，冷卻后放置在4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?）濃度為1 mmol/L的NaOH溶液配制。在燒杯中加入NaOH固體40 g，加入超純水，使其完全溶解，并定容成1 L的NaOH溶液。

1.3.2? ? 菌株活化? ? 取出放置在冰箱中的菌株，置于超凈工作臺(tái)，先接種到3 mL的無菌LB液體培養(yǎng)基中，放置在恒溫振蕩器內(nèi)振搖24 h，180 r/min，37 ℃，用接種環(huán)蘸取過夜培養(yǎng)的菌液在LB固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)16～24 h（37 ℃）。隔夜，挑取培養(yǎng)基上的單菌落，隨后接種于LB液體培養(yǎng)基（3 mL）中，振搖24 h，180 r/min，37 ℃，完成后取出備用。

1.3.3? ? 藥敏試驗(yàn)? ? 從LB固體培養(yǎng)基上用無菌棉簽挑取單菌落，放置在無菌0.9%氯化鈉溶液的試管內(nèi)，傾斜試管，浸濕棉簽頭，將菌落在液面上輕輕研磨成菌懸液，將棉簽頭旋轉(zhuǎn)，反復(fù)擠壓、研磨，隨后均勻混勻，與比濁儀對(duì)比，待濁度為0.5～0.6 MCF為止。在上述混勻的60 μL菌懸液中加入AST Broth藥敏培養(yǎng)液12 mL，反復(fù)抽吸使液體混勻，分別在藥敏板的小孔內(nèi)加入100 μL的混合液。設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，前者是將AST Broth 100 μL藥敏培養(yǎng)液加入不含抗生素的孔內(nèi)，后者是將含有菌懸液的藥敏培養(yǎng)液100 μL加入不含抗生素的孔內(nèi)。做好標(biāo)記，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（clinical and laboratory standards institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀[5]。

1.4? ? 觀察指標(biāo)? ? （1）分析KPN樣本來源、科室分布情況。（2）分析KPN耐藥性。

2? ? 結(jié)果

2.1? ? KPN樣本來源? ? KPN樣本來源主要為尿液，其次為血液、痰液，見表1。

2.2? ? KPN樣本來源科室分布? ? KPN樣本來源科室主要為重癥醫(yī)學(xué)科，其次為呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科，見表2。

2.3? ? KPN耐藥性分析? ? 782份KPN樣本中耐藥率最高的為氨芐西林，其次為復(fù)方新諾明、頭孢唑林，敏感度最高的為阿米卡星，其次為亞胺培南、美羅培南，見表3。

3? ? 討論

KPN為短粗桿菌，屬于腸桿菌科，可生存于人類和動(dòng)物的腸道內(nèi)，對(duì)外界抵抗力較強(qiáng)，當(dāng)宿主存在誘發(fā)因素或免疫功能低下時(shí)，易引起KPN感染[6]。KPN屬于條件致病菌，對(duì)人體的影響程度僅次于大腸桿菌。KPN致病的毒力因子主要有脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）、莢膜多糖（capsularpolysaccharide，CPS）、菌毛（fimbriae）、外膜蛋白A（outer membrane protein A，Omp A）、鐵載體及外排泵等。其中莢膜多糖可抑制與逃避宿主巨噬細(xì)胞的吞噬，促使樹狀細(xì)胞成熟，對(duì)宿主防御的抗菌活性起中和作用；脂多糖的最外層成分是由寡糖重復(fù)單元聚合體組成的O抗原，可抵抗補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的殺傷作用，兩者是激活天然免疫系統(tǒng)的2種重要毒力因子[7-8]。Omp A是腸桿菌科許多成員外膜中的主要蛋白質(zhì)之一，屬于多功能的Omp，能夠參與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞黏附以及宿主的免疫反應(yīng)，使KPN的致病能力進(jìn)一步增強(qiáng)，還能介導(dǎo)真核細(xì)胞的侵襲或黏附以及血清抗性，也能保護(hù)細(xì)菌免受肺集合蛋白的侵害；Omp A能在有細(xì)菌情況下對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生形成抑制，亦可使細(xì)菌對(duì)抗菌肽的活性增加；Omp A能夠被血清淀粉樣蛋白A和天然免疫系統(tǒng)內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶所靶向，增加細(xì)菌吞噬作用，促使細(xì)胞死亡。KPN也是人獸共患致病菌，豬、雞、羊、馬等牲畜和野生動(dòng)物均可感染，能夠經(jīng)食物鏈傳播給人類，同時(shí)是社區(qū)感染和院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一，可引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等多系統(tǒng)感染，誘發(fā)肝膿腫、肺炎、尿路感染等疾病，威脅患者生命安全[9-10]。充分了解KPN的臨床分布特征和耐藥情況，對(duì)于臨床合理使用抗生素具有積極意義。

本研究結(jié)果顯示，KPN樣本來源主要為尿液，其次為血液、痰液，提示KPN易引起泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病，需警惕菌血癥的出現(xiàn)。本研究中，KPN樣本來源科室主要為重癥醫(yī)學(xué)科，其次為呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科，提示重癥醫(yī)學(xué)科易出現(xiàn)KPN感染，可能與重癥醫(yī)學(xué)科患者病情嚴(yán)重且復(fù)雜，免疫力下降明顯，且常接受有創(chuàng)機(jī)械通氣等侵入性治療，呼吸道局部黏膜屏障受損，明顯增加下呼吸道和全身感染等感染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)抗生素使用頻率相對(duì)較高且使用時(shí)間相應(yīng)較長有關(guān)。臨床需重視重癥醫(yī)學(xué)科病房管理，及時(shí)清潔消毒科室環(huán)境、醫(yī)療設(shè)備，最大程度減少侵入性操作，盡可能減少誘發(fā)院內(nèi)感染因素。合理、正確地使用抗生素是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的防治病原菌傳播的有效手段，病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生的耐藥性是病原菌在抗生素選擇性壓力下的變異求生能力，而同時(shí)使用多種抗生素或長期大劑量使用廣譜抗生素，會(huì)減少正常菌群數(shù)量，增加條件致病菌侵襲性，易引起病原菌耐藥性[11-12]。抗生素的不合理與廣泛使用，造成KPN對(duì)常見抗生素的多重耐藥問題日趨嚴(yán)重，成為醫(yī)院抗生素使用和院內(nèi)感染控制所面臨的嚴(yán)峻問題之一，受到臨床各界重視。藥敏試驗(yàn)是指在體外測定病原菌對(duì)抗生素的敏感度，以便準(zhǔn)確有效地指導(dǎo)臨床合理用藥的微生物學(xué)試驗(yàn)。本研究中，KPN耐藥率最高的為氨芐西林，其次為復(fù)方新諾明、頭孢唑林，敏感度最高的為阿米卡星，其次為亞胺培南、美羅培南，提示KPN的耐藥機(jī)制復(fù)雜，包括生物被膜的形成、產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶、9yr At par C基因突變、外膜孔蛋白的缺失、抗生素的主動(dòng)外排等。KPN是耐藥質(zhì)粒的“收藏家”，既會(huì)使自身的生存能力提升，還會(huì)將耐藥質(zhì)粒傳播給其他菌種，進(jìn)而引起耐藥基因的播散，對(duì)多種抗生素易產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果。臨床在使用抗生素治療前，需實(shí)施病原菌檢測和藥敏試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗生素，避免因經(jīng)驗(yàn)性用藥所致的耐藥，提高臨床抗感染治療的有效性。

綜上所述，尿液是KPN的主要來源，多來源于重癥醫(yī)學(xué)科，KPN對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、頭孢唑林耐藥率較高，臨床治療時(shí)需合理使用。

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（收稿日期：2023-06-10）