楊斯琪，鮑雅靜，葉佳琦，2，吳帥，張萌，徐夢冉，趙鈺，呂曉濤，韓興國

（1. 大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116600；2. 內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；3. 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所額爾古納森林草原過渡帶生態(tài)系統(tǒng)研究站，遼寧 沈陽 110016；4. 中國科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國家重點實驗室，北京 100093；5. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

光合作用的強弱是決定植物干物質(zhì)積累程度的基礎(chǔ)[1］。CO2是光合作用的重要底物，是影響植物光合作用的主要限制因子，CO2濃度升高將有助于提高植物光合能力和生長發(fā)育[2-4］。CO2響應(yīng)曲線能反映植物凈光合速率隨CO2濃度的變化趨勢。通過測定CO2響應(yīng)曲線，能得到CO2飽和點（CO2saturation point，Cisat）、最大凈光合速率（maximum net photosynthetic rate，Pnmax）、CO2補 償 點（CO2compensation point，Γ）、光 呼 吸 速 率（light respiration rate，Rp）和初始羧化效率（initial carboxylation efficiency，α）等重要光合參數(shù)[5-6］。目前已創(chuàng)建多種CO2響應(yīng)曲線的擬合模型，其中最常用的有直角雙曲線模型[7］、非直角雙曲線模型[8］、直角雙曲線修正模型[9］和Michaelis-Menten 模型等[10］。大量研究表明對同一植物進行擬合時，不同模型的效果存在差異[7，11-12］。因此在對植物進行曲線擬合及參數(shù)求解時，應(yīng)進行比對分析以選取最佳模型。

氮（N）是植株生長所必需的三大營養(yǎng)元素之一，施氮水平是影響植物光合作用的重要因素[13-14］。適量施用氮肥可提高植物葉綠素相對含量、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率，提高植物抗旱性，但過高或過低的施氮水平均會影響植物的光合特征[15］。研究表明，適量施氮能顯著增加羊草的葉面積和葉綠素含量，提高葉片氮濃度和凈光合速率并降低熒光特性，促進羊草生長[16-17］。但關(guān)于不同施氮濃度下，羊草的光合-CO2響應(yīng)特性及模型適用性篩選仍然缺乏試驗依據(jù)。

刈割是天然草地的重要管理措施[18］。刈割將地上的營養(yǎng)物質(zhì)從生態(tài)系統(tǒng)中移出，改變草原生態(tài)系統(tǒng)的生物量分配模式和養(yǎng)分利用效率，影響植物的生長發(fā)育[19-20］。同時，已有研究表明適度的刈割次數(shù)和留茬高度能促進氮添加下植物的凈光合速率、葉綠素含量和養(yǎng)分含量[21］。目前，關(guān)于刈割對羊草影響的研究相對較少，且大多集中在化學(xué)計量特征、養(yǎng)分分配策略和補償生長等方面[22-24］，但關(guān)于氮添加和刈割下羊草光合特性隨CO2濃度變化的響應(yīng)規(guī)律仍未見報道。

中國的草原面積占國土面積的40%以上，在全球碳循環(huán)中扮演著重要角色[25］。內(nèi)蒙古草原是中國北方典型的溫帶半干旱草原，也是歐亞草原的主要組成部分[26］。羊草（Leymus chinensis）是該區(qū)域的優(yōu)勢種之一。本研究在不同氮添加水平和刈割處理下，分別測定羊草光合作用的CO2響應(yīng)曲線，采用直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型、直角雙曲線修正模型和Michaelis-Menten 模型進行擬合分析，篩選出氮添加和刈割下羊草的最適CO2響應(yīng)擬合模型，并探討羊草響應(yīng)特性與氮添加和刈割的關(guān)系。研究結(jié)果將為確定最適的羊草CO2響應(yīng)擬合模型提供理論依據(jù)，為科學(xué)指導(dǎo)內(nèi)蒙古草原的管理措施制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本研究在中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所額爾古納森林草原過渡帶生態(tài)系統(tǒng)定位研究站（50°10′ N， 119°22′ E）進行，海拔523 m。該地區(qū)年平均降水量為363 mm，年平均氣溫為-2.45 ℃。刈割是該地區(qū)傳統(tǒng)的草地利用方式。加氮（NH4NO3）試驗始于2014 年5 月底，采用隨機完全區(qū)組設(shè)計。設(shè)置6 種氮添加水平（0、2、5、10、20和50 g N·m-2·a-1）與刈割（mowing， M）和非刈割（unmowing， A）兩種草原管理方式交互處理，共12 個處理，每個處理重復(fù)8 次（共96 個處理區(qū)）。每個樣方的面積為10 m×10 m，每年5 月下旬施用一次氮肥。將肥料與沙子混合，用手均勻撒播。為了避免潛在的混雜效應(yīng)，所有樣地都播撒相同數(shù)量的沙子（每塊0.5 kg）。每年8 月下旬在離土壤表面10 cm 的高度進行刈割，以模擬收割干草。收獲的生物量從樣方中移除。

1.2 光合-CO2響應(yīng)曲線測定

2021 年8 月中旬采用Li-6400 光合作用測定系統(tǒng)（Li-Cor Inc. ， Lincoln， NE， 美國），在晴朗無風(fēng)天氣的9：00-11：30，對每個處理隨機選取長勢良好的相同葉位的羊草葉片進行光合-CO2響應(yīng)曲線測定。測定時氣體流速設(shè)置為500 μmol·s-1，空氣相對濕度控制在60%左右，溫度設(shè)置為25 ℃。設(shè)定CO2的濃度梯度為50、100、200、300、400、600、800、1000、1200 和1500 μmol·mol-1，設(shè)置不同CO2濃度數(shù)據(jù)采集時間為120~300 s。自動測量系 統(tǒng) 記 錄 凈 光 合 速 率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸 騰 速 率（transpiration rate，Tr）、氣 孔 導(dǎo) 度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）等氣體交換參數(shù)，計算水分利用效率（water use efficiency， WUE），公式為WUE=Pn/Tr。

1.3 模型擬合

1.3.1 直角雙曲線模型 直角雙曲線模型[7］的表達(dá)式為：

式中：Pn為凈光合速率；Ci為胞間CO2濃度；α為初始羧化效率；Rp為光呼吸速率；Pnmax為最大凈光合速率。

1.3.2 非直角雙曲線模型 非直角雙曲線模型[27］的表達(dá)式為：

式中：θ為曲角。

1.3.3 直角雙曲線修正模型 直角雙曲線修正模型[28］的表達(dá)式為：

式中：β，γ 為修正系數(shù)。

1.3.4 Michaelis-Menten 模型 Michaelis-Menten 模型[10］的表達(dá)式為：

式中：K 為常數(shù)。

1.4 模型評價

采用均方根誤差（root mean square error， RMSE）、平均絕對誤差（mean absolute error， MAE）和決定系數(shù)（coefficient of determination，R2）評價4 種模型的擬合優(yōu)度。計算公式如下[29］：

式中：yo，i和ym，i分別為凈光合速率的實測值和擬合值；n為樣本數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

光合-CO2響應(yīng)曲線的擬合在葉子飄[30］開發(fā)的光合計算軟件（4.1.1 版本）中完成。其中直角雙曲線修正模型的Cisat和Г由軟件直接得出。通過求解直線方程：Pnmax=α×Cisat-Rp求出直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型和Michaelis-Menten 模型的Cisat，其中α為初始羧化效率，表示CO2濃度≤200 μmol·m-2·s-1時的直線方程的斜率。采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2021 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同模型對CO2響應(yīng)曲線的擬合效果及擬合優(yōu)度

由表1 可以看出，非直角雙曲線模型的α和Rp擬合值與實測值更接近，另外3 種模型的參數(shù)擬合值均大于實測值。Cisat、Г和Pnmax擬合值中，最接近實測值的模型均為直角雙曲線修正模型。以AN5為例，直角雙曲線模型和Michaelis-Menten 模型的Cisat擬合值均低于實測值66.88%，非直角雙曲線模型的Cisat擬合值低于實測值36.07%，這3 種模型的Г擬合值均低于實測值5.00%左右，直角雙曲線模型和Michaelis-Menten 模型的Pnmax擬合值均高于實測值70.14%，非直角雙曲線模型的Pnmax擬合值高于實測值15.66%。綜上，非直角雙曲線模型對α和Rp的擬合效果最好，直角雙曲線修正模型擬合的Cisat、Г和Pnmax的結(jié)果最理想。

表1 羊草光合-CO2響應(yīng)曲線參數(shù)實測值與擬合值Table 1 The measured values of photosynthetic-CO2 response curve parameters of L. chinensis and the fitted values by models

在不同氮濃度和刈割處理下，羊草CO2響應(yīng)曲線均能由直角雙曲線修正模型較好的擬合，非直角雙曲線模型的擬合效果次之，而直角雙曲線模型和Michaelis-Menten 模型的擬合點普遍偏離實測點，尤其不能很好地擬合CO2飽和時的抑制現(xiàn)象（圖1）。因此從宏觀擬合情況來看，直角雙曲線修正模型的擬合效果優(yōu)于其他3 種模型。通過RMSE、MAE 和R2進一步評估4 種CO2響應(yīng)模型的擬合優(yōu)度（表2），從RMSE 和MAE 的評價結(jié)果來看，直角雙曲線修正模型的值最小，因此其擬合優(yōu)度好于其他3 種模型。從R2評價的模型擬合效果來看，直角雙曲線修正模型的R2均在0.985 以上，且不同處理下直角雙曲線修正模型的R2均高于其他模型或差值較小。綜上所述，直角雙曲線修正模型的擬合優(yōu)度最高。

圖1 氮添加和刈割處理下不同CO2響應(yīng)模型對羊草光合作用-CO2響應(yīng)曲線的模擬Fig. 1 Simulation of photosynthetic-CO2 response curves of L. chinensis by different CO2 response models under nitrogen and mowing treatments

表2 4 種CO2響應(yīng)模型擬合優(yōu)度對比Table 2 Comparison of goodness-of-fit on four CO2 response models

2.2 氮添加和刈割處理下羊草的CO2響應(yīng)變化趨勢及特征參數(shù)比較

根據(jù)上述不同CO2響應(yīng)模型的擬合優(yōu)度分析結(jié)果，在比較氮添加和刈割處理下羊草光合作用-CO2響應(yīng)變化趨勢時采用直角雙曲線修正模型的擬合值（圖2A）。結(jié)果顯示不同處理的羊草CO2響應(yīng)曲線具有明顯差異，且波動范圍較大。在CO2濃度≤400 μmol·mol-1時，所有處理的Pn均表現(xiàn)為隨CO2濃度的增加而迅速上升的趨勢。在非刈割處理中，當(dāng)CO2濃度>400 μmol·mol-1時，AN20處理下的Pn上升幅度最大，而氮濃度低于或高于20 g N·m-2·a-1處理的Pn均低于AN20處理。刈割增大了所有處理的曲線上升幅度，使刈割處理的Pn表現(xiàn)為整體高于非刈割處理，且20 g N·m-2·a-1處理的羊草Pn較高。除MN20處理外，其他處理的羊草CO2響應(yīng)曲線均表現(xiàn)出高CO2濃度的抑制現(xiàn)象。綜合來看，MN20處理下的羊草表現(xiàn)出最強的光合能力，N20是羊草CO2利用率最高的氮素臨界值。

圖2 不同氮添加和刈割處理下羊草光合-CO2響應(yīng)曲線Fig.2 Photosynthetic-CO2 response curves of L. chinensis under different nitrogen and mowing treatments

隨CO2濃度升高，羊草Gs和Tr的CO2響應(yīng)曲線整體呈下降趨勢（圖2B、D）。不同處理間，羊草Gs和Tr的響應(yīng)規(guī)律與Pn并不一致，如AN20處理的Pn并不是漲幅最高的處理，而其Gs卻處于最高水平，這說明羊草光合能力的高低并不由氣孔的閉合程度所決定，而是由非氣孔因素主導(dǎo)[31］。與不施氮相比，施氮處理的羊草Tr明顯增加。隨CO2濃度增加，所有處理的羊草Ci均呈基本的線性上升趨勢（圖2C）。氮添加增大了羊草Ci響應(yīng)曲線的增長幅度。與非刈割相比，刈割處理后羊草Ci明顯增加，且不同氮處理間差異較小。圖2E 為氮添加和刈割處理下羊草WUE 的CO2響應(yīng)過程。在低CO2濃度時（0~400 μmol·mol-1），WUE 迅速上升，而后隨CO2濃度的增加，MN20處理的羊草WUE 處于較高水平，當(dāng)CO2濃度達(dá)到最大時（1500 μmol·mol-1），MN20處理的羊草WUE 最高。

通過比較4 種模型的參數(shù)擬合效果，本研究采用非直角雙曲線模型的α和Rp擬合結(jié)果，以及直角雙曲線修正模型的Cisat、Г和Pnmax擬合結(jié)果進行光合參數(shù)分析（表1）。最大凈光合速率（Pnmax）反映了葉片的光合電子傳遞和磷酸化活性[32］。在所有處理中，MN10和MN20的Pnmax相差不大且遠(yuǎn)高于其他處理，分別比光合能力最低的AN0處理高135.62%和127.23%。初始羧化效率（α）反映了核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（rubisco）的活性大小及含量多少，α的大小與rubisco 活性成正比[33-34］。隨氮濃度升高，羊草α逐漸增大，但過度氮添加并不能進一步提高羧化效率，反而使α有所降低。非直角雙曲線模型中，非刈割和刈割處理下α的浮動范圍分別為：0.03~0.10 mol·m-2·s-1和0.04~0.06 mol·m-2·s-1。其中，MN10處理的α處于較高水平（0.06 mol·m-2·s-1），這可能是MN10光合速率較高的原因之一。

CO2飽和點（Cisat）是衡量植物利用高濃度CO2能力的一個指標(biāo)。直角雙曲線修正模型中，AN0處理的羊草光合能力雖然是最低的，但其具有最高Cisat，這可能是植物在養(yǎng)分貧瘠下維持正常生長發(fā)育的一種策略。CO2補償點（Γ）反映葉片光合同化作用與呼吸消耗相當(dāng)時的CO2濃度[30］。在相同氮濃度下，刈割處理的羊草對低CO2濃度的利用能力更強，與非刈割時的AN20處理相比，MN20處理的Γ降低了16.36%，說明MN20處理的羊草能在較低的CO2濃度下進行有機物質(zhì)的積累。AN20處理的羊草具有最高的光呼吸速率（Rp），表明此時羊草在光合作用過程中通過消耗過剩光能以保護光合機構(gòu)免受高溫或強光損害，維持較高的光合速率，增加有機物生產(chǎn)與積累[11］。

3 討論

在本研究中，4 種模型對不同參數(shù)的擬合效果存在差異：在對α和Rp的擬合中，非直角雙曲線模型的擬合效果最好，其他3 種模型的擬合值普遍偏高，誤差較大。在對Cisat、Г和Pnmax的擬合中，直角雙曲線修正模型擬合值最接近實測值，這主要是由于其他3 種模型無法直接模擬出Cisat和Pnmax，而必須通過非線性最小二乘法估算Pnmax和假定0.9Pnmax對應(yīng)的CO2濃度來求解Cisat，這就容易與測定值產(chǎn)生偏差[35］。而之所以非直角雙曲線模型的擬合效果優(yōu)于直角雙曲線模型，是因為其在直角雙曲線模型的基礎(chǔ)上加入了曲線凸度這個參數(shù)，使結(jié)果更接近實測值[36］。此外，利用RMSE、MAE 和R2對4 種模型進行擬合優(yōu)度比較后發(fā)現(xiàn)，直角雙曲線修正模型對氮添加和刈割處理下的羊草光合-CO2響應(yīng)曲線模擬效果最好。這是由于直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型和Michaelis-Menten 模型都是一條沒有極值的漸進線，無法很好地模擬CO2飽和的現(xiàn)象，估算的參數(shù)將遠(yuǎn)大于實測值[37］。而直角雙曲線修正模型能很好地模擬Pn在CO2飽和時的下降趨勢，因此Cisat和Pnmax的擬合值也更準(zhǔn)確。目前，直角雙曲線修正模 型 同 樣 在 刺 槐（Robinia pseudoacacia）[38］、蘋 果（Malus domestica）[39］、煙 草（Nicotiana benthamiana）[40］、黃 柳（Salix gordejevii）[11］、黃菇娘（Physalis pubescens）[41］等植物的CO2響應(yīng)曲線擬合上表現(xiàn)出較好的擬合度。綜上所述，在對羊草進行CO2響應(yīng)曲線擬合時，可以結(jié)合非直角雙曲線模型和直角雙曲線修正模型的優(yōu)勢：利用非直角雙曲線模型擬合的α和Rp與直角雙曲線修正模型擬合的Cisat、Г和Pnmax進行參數(shù)分析，采用直角雙曲線修正模型進行響應(yīng)曲線趨勢的擬合分析。

光合作用控制著植物生長及其生物量分配等關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13］。本研究表明，在CO2濃度為0~400 μmol·mol-1時，Pn隨著CO2濃度的增加而增加，基本呈直線上升趨勢，此時曲線的斜率可表征rubisco 的效率。適量施氮增加了羊草α，在AN20處理下達(dá)到最大值，表明適宜的施氮量增加了CO2對rubisco 酶結(jié)合位點的競爭，從而提高了羧化效率，增強羊草對CO2的利用，產(chǎn)生較多的干物質(zhì)[42］。同時AN20處理的Rp幾乎是其他處理的2~3 倍，這也說明了植物在應(yīng)對環(huán)境變化時，進化出了應(yīng)對策略。AN50處理的α有所下降，可見過度氮添加并不能進一步提高羧化效率。刈割在一定施氮量時對羧化效率有進一步的促進作用（0~10 g N·m-2·a-1），MN10處理的羊草羧化效率相比AN10提高74.71%。并且此時WUE 與Pn的響應(yīng)一致，表明隨著CO2濃度的增加，羊草葉片在增加碳固定量的同時，也減少了水分的散失。Tr的響應(yīng)趨勢與Pn相反，說明羊草凈光合速率的增加主要受非氣孔因素的影響[43］。當(dāng)CO2濃度>400 μmol·mol-1時，羊草凈光合速率增幅變緩，有些處理的光合速率在達(dá)到最大值后呈下降趨勢，因為此時葉綠體內(nèi)由于光合作用合成了大量淀粉及1，5-二磷酸核酮糖（ribulose 1， 5-bisphosphate，RuBP）再生過程受限，因此抑制了光合作用的進行[13，44］。在相同CO2濃度條件下，施氮處理的羊草凈光合速率大于不施氮處理，AN0處理的凈光合速率隨CO2濃度上升的幅度明顯小于其他加氮處理，且AN20處理的羊草具有較高的光合潛能和對低CO2濃度的利用能力，說明氮添加增強了羊草葉片RuBP 羧化酶活性與碳同化能力[45］。CO2是植物光合作用的關(guān)鍵底物，本研究發(fā)現(xiàn)適度氮添加能提高羊草的凈光合速率、水分利用效率、最大光合潛力、rubisco 活性及對更高和更低CO2濃度的利用效率，這有利于提高羊草碳固定，促進草原生態(tài)系統(tǒng)碳固存和碳循環(huán)。刈割是一種常見的草地管理方式，對氮添加條件下的羊草光合作用產(chǎn)生重要影響。結(jié)果表明，刈割提高了羊草凈光合速率隨CO2濃度升高的增長幅度，低氮添加處理（MN0、MN2、MN5）的增幅相近，差別不大，但中等濃度氮添加處理（MN10、MN20）的羊草凈光合速率增幅較大，特別是MN20處理的羊草具有較高的光合潛力、更高的CO2的利用效率、水分利用效率以及光呼吸速率。這說明刈割通過帶走地上生物量，促進了植株再生和對養(yǎng)分的吸收，減少了水分耗散并減少碳損耗[46］。但這種效果只能在中等氮濃度下發(fā)揮作用，因為MN50處理的羊草凈光合速率已降低到低氮添加水平。因此，對草原生態(tài)系統(tǒng)來說，適量氮添加并刈割最有利于提高植物光合作用，這可能會增大草原生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力或碳固持能力。本研究對今后草原管理措施的制定提供了試驗依據(jù)。

4 結(jié)論

非直角雙曲線模型的α和Rp與直角雙曲線修正模型的Cisat、Г和Pnmax參數(shù)擬合效果較好，直角雙曲線修正模型的模型擬合優(yōu)度最高。通過對羊草的CO2響應(yīng)曲線和擬合參數(shù)分析可知，外界CO2的變化可能會對羊草光合作用產(chǎn)生較大的影響，氮添加和刈割會改變羊草對CO2濃度變化的響應(yīng)策略。合理的施氮濃度（20 g N·m-2·a-1）結(jié)合刈割能使羊草葉片的光合能力得到提升，且提高CO2利用效率。研究結(jié)果將為理解氮添加和刈割作用下羊草光合特性的響應(yīng)規(guī)律提供理論依據(jù)，也為提高內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)碳固定制定合理的草原管理措施提供參考。