李嘉佳，王磊，曹玉早，王世平*

（1. 上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240；2. 東海縣石梁河鎮(zhèn)金朵種植家庭農場，江蘇連云港 222000）

溫度是影響植物新陳代謝等生理功能的主要因素之一，在適宜的溫度下，植物組織中的不同蛋白質會堆疊成特定的形狀，行使不同功能[1]。極端的溫度變化會導致具有功能的蛋白質變性失活，最終造成植物新陳代謝速率下降，果實產量及品質降低[2]。據(jù)報道，每年全球農作物產量損失有超過半數(shù)都是由極端溫度造成的， 隨著全球氣候的日益變暖，溫室效應逐漸加劇，高溫對農作物的危害更加嚴重[3]。因此，如何減輕極端氣候對植物的傷害，實現(xiàn)高產優(yōu)質栽培一直是學者們追求的目標。

‘美樂’葡萄是世界范圍內種植最廣泛的品種之一，具有早熟、多產、口感細膩等優(yōu)良性狀，可用來釀制美味而柔滑的葡萄酒，也可平衡其他葡萄酒的酸澀，極大提高葡萄酒的品質，獲得更高的市場效應[4-5]。但是‘美樂’耐熱性較差，夏季的高溫也成為制約其生長發(fā)育最主要的環(huán)境因子，若長期處于高溫環(huán)境下，會抑制樹體光合作用，延緩果皮著色，釀制的酒口感變劣，品質變差，影響了該品種的的應用[6]。噴施外源植物激素是快速提高植株抗逆性，緩解熱脅迫對細胞膜傷害的有效措施[7-8]。脫落酸（ABA）是促進果皮著色和果實糖分積累的最重要的內源植物激素。已有研究表明，向轉色前葡萄果實噴施一定濃度的ABA和乙烯類物質（乙烯利）可以顯著緩解高溫脅迫下葡萄果實的上色困難，固酸比下降等問題[9-11]。油菜素內酯（BR）具有在極低濃度下促進植株營養(yǎng)生長的功效，并且對果實膨大、糖分積累、果皮著色方面也有顯著的促進作用[12]。但遺憾的是，對外源BR及24-表油菜素內酯（EBR）能否通過調控內源BR的合成來緩解熱脅迫下‘美樂’葡萄上色困難，從而提高果實品質方面還未有系統(tǒng)的研究，分子機制也仍待進一步揭示。

本研究以盆栽兩年生的‘美樂’葡萄為試材，探究EBR對熱脅迫下果實次生代謝物合成及抗氧化能力的影響，著重聚焦EBR是否會通過影響內源BR的合成來緩解熱脅迫下葡萄果皮上色困難的問題，以期在未來葡萄栽培過程中通過轉色前果實浸泡EBR的方式來提高葡萄抗熱脅迫的能力，恢復受熱脅迫傷害的表型，進而整體提高釀酒葡萄的品質。

1 材料與方法

1.1 材料準備及處理

2022年3月5日將兩年生‘美樂’植株移栽于10 L栽培容器中，挑選長勢相近且無病蟲害的植株，置于上海交通大學農業(yè)與生物學院玻璃溫室中，栽培土壤由園土和蛭石按1∶1比例混合而成，土壤肥水和病蟲害管理一致。待果實轉色前2周左右，挑選長勢健壯的9株進行試驗，調整果穗數(shù)和葉片數(shù)，使總果粒數(shù)與總葉片數(shù)比介于1.2～1.5，供后續(xù)處理。在果實轉色前1周，參考預備試驗篩選的處理溫度，設置對照（Control，25 ℃/12 h，25 ℃/12 h），熱脅迫（HT，50 ℃/12 h，25 ℃/12 h）及熱脅迫 + EBR（HT+EBR，50 ℃/12 h，25 ℃/12 h）3組處理，不間斷處理14 d。每個處理使用3株冬季修剪完畢的盆栽葡萄，每株保留3～4穗果，每穗保留60粒，并定期澆灌霍格蘭營養(yǎng)液。此外，EBR處理在首次高溫脅迫后6 h進行，將未轉色的葡萄整穗果浸泡在2 L的0.5 mg·L-1EBR溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），每穗浸泡時間持續(xù)3 min，待果穗完全沒有EBR溶液滴落后，再重復該步驟一次。

1.2 樣品采集及指標測定

本試驗共設置5個采樣時間點，分別為DAT0（處理后0 d，HT及EBR處理后6 h進行采樣）、DAT3（處理后3 d，轉色前期）、DAT7（處理后7 d，轉色中期）、DAT11（處理后11 d，轉色完成）、DAT15（處理后15 d，成熟期）。在每個采樣時間點，隨機在每穗葡萄上中下部各采集3粒，每個處理采果數(shù)量不低于20粒。在測定完果實基本品質指標后（粒質量、果實縱徑、果實橫徑、可溶性固形物、可滴定酸），所有果實經液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)果實花色苷、酚類等次生代謝產物、抗氧化酶活性的測定及RNA的提取。

1.2.1 酚類物質的測定

隨機選擇5粒完整果實，用液氮研磨成粉末后，稱取0.10 g，加入1 mL pH 7.8的PBS緩沖液，4 ℃、12000 r·min-1下離心10 min，取上清液進行果實類黃酮、總酚、抗壞血酸、白藜蘆醇的測定，使用由北京索萊寶生物科技有限公司生產的Elisa試劑盒進行檢測。每處理重復3次。

1.2.2 抗氧化酶活性的測定

取0.10 g凍干葡萄粉末于1 mL pH 7.8的PBS緩沖液中進行冰浴勻漿處理，4 ℃、12000 r·min-1下離心10 min，取上清液進行果實內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定，使用北京索萊寶生物科技有限公司生產的Elisa試劑盒進行檢測。每處理重復3次。

1.2.3 總花色苷的測定

先將葡萄果實研磨成粉末，準確稱取0.10 g，加入6 mL含1%HCl的甲醇溶液，渦旋振蕩混勻2 min，4 ℃避光浸提過夜。在加入4 mL ddH2O后，將溶液在3800 r·min-1下離心10 min。收集上清液并加入1 mL氯仿，混勻，然后將混合物在13000 r·min-1下離心5 min。最后，使用分光光度計在530 nm和657 nm下分別測量水相中的花色苷含量，并使用等式 (A530－A657)·g-1得到總花色苷含量。每個處理重復3次。

1.2.4 內源BR含量的測定

取0.50 g果肉組織粉末于5 mL pH 7.8的PBS緩沖液以及5 mL的1 mol Tris-HCl中進行冰浴勻漿處理，經過4 ℃、6000 r·min-1離心15 min 后，取上清液進行果實內BR含量的測定，使用上海研啟生物科技有限公司生產的Elisa試劑盒進行檢測。每個處理重復3次。

1.2.5 qRT-PCR

RNA提取試劑盒（TaKaRa，大連，中國）用于提取在不同處理的不同采樣期的葡萄果實中的總RNA。BIO-RADXR凝膠成像分析系統(tǒng)（美國，加利福尼亞州，BIO-Rad）用于檢測提取的RNA的純度和完整性。使用CFX connect實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，CA，USA）進行qRT-PCR，并遵循以下既定程序：95 ℃（20 s），然后95 ℃（39個循環(huán)，15 s），55 ℃（15 s），最后60 ℃（15 s）。基因的相對表達由2-△△Ct表示。所有基因和轉錄因子序列均從EnsemblPlants（http://plants.ensembl.org/info/about/index.html）獲得。 在Primer Premier 5.0和qPrimerDB qPCR引物數(shù)據(jù)庫中設計用于qRT-PCR的引物（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包（IBM，Armonk，NY，USA）對本研究中獲得的結果進行差異顯著性分析。方差齊性分析采用均數(shù)±標準差（SE）形式，選擇單變量方差分析（one-way ANOVA，P＜0.05），每個處理至少選擇3組數(shù)據(jù)。所有圖形均使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software Inc.，圣地亞哥，美國），TBtools（CAN，CHN）和Visio 2020（Microsoft，SEA，美國）繪制。

2 結果與分析

2.1 EBR處理對熱脅迫下果實大小及著色的影響

圖1為熱脅迫及EBR處理對果粒表型及果粒大小的影響。結果表明，熱脅迫顯著抑制了果粒的膨大和著色，EBR處理后果粒大小和上色程度顯著改善，且果實縱橫徑、粒質量均在轉色完成期和果實成熟期高于對照組（圖1A、B、C）。以上表型以及果粒大小指標說明，熱脅迫可以抑制‘美樂’葡萄的著色及膨大，EBR對恢復果實表型，促進果實膨大有著積極效應。

2.2 EBR處理對熱脅迫下果實品質的影響

圖2為熱脅迫及EBR處理對果實糖積累、酸代謝和多種次生代謝產物合成的影響。具體來說，熱脅迫顯著抑制了果實DAT3、DAT7、DAT11、DAT15時期的可溶性固形物的積累。在DAT3和DAT15時期，EBR浸泡果實后則顯著抑制了可溶性固形物在熱脅迫下的減少，但其值仍顯著低于對照組（圖2A）。此外，熱脅迫也可以顯著的降低葡萄果實內可滴定酸的含量，EBR浸泡可恢復熱脅迫下其值的降低，但其含量仍顯著低于對照組（圖2B）。對于類黃酮含量以及總酚含量（圖2C、2D），熱脅迫處理同樣顯著抑制了這兩種物質的積累。在EBR處理組中，總酚含量和類黃酮的含量較熱脅迫處理組顯著提升。此外，EBR對于緩解熱脅迫處理下抗壞血酸和白藜蘆醇這兩種次生代謝產物含量降低效果顯著，尤其在轉色期和成熟期（圖2E、2F）。

圖2 EBR對‘美樂’葡萄果實多種次生代謝物含量的影響Figure 2 Effect of EBR on the content of multiple secondary metabolites in 'Merlot' grape

2.3 EBR處理對熱脅迫下果實抗氧化能力的影響

如圖3所示，SOD、POD、CAT、PAL活性變化一致，呈現(xiàn)出總體先上升后下降的趨勢，熱脅迫顯著促進了果實DAT0和DAT15時期SOD活性的提高，顯著促進幾乎所有采樣時期POD和CAT的活性，而抑制了果實轉色期PAL的活性。此外，EBR在促進熱脅迫下DAT3、DAT7和DAT11時期的SOD、POD以及所有采樣時期PAL的活性提高方面發(fā)揮著重要作用。此外，EBR較熱脅迫處理組顯著降低了熱脅迫下CAT活性。

圖3 EBR對‘美樂’葡萄果實抗氧化物質積累的影響Figure 3 Effect of EBR on the accumulation of antioxidant substances in 'Merlot' grape fruit

進一步在轉錄水平上探究EBR對促進熱脅迫下抗氧化相關基因表達的作用，如圖4所示。SOD，POD、CAT和PAL1的表達總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，以及熱休克基因HSFA1、HSP70呈現(xiàn)出總體不斷下降的趨勢。在DAT7、DAT11和DAT15時期，熱脅迫顯著促進了SOD、POD、CAT的表達，抑制了PAL1的表達。HSFA1和HSP70在DAT0和DAT15時期明顯上調，其余時間未見顯著差異，且EBR處理并不能促進這些基因在熱脅迫下表達的顯著提高。

圖4 EBR對‘美樂’葡萄果實抗氧化物質相關基因表達量的影響Figure 4 Effect of EBR on the expression of related genes of antioxidant substances in 'Merlot' grape fruit

2.4 EBR處理對熱脅迫下果實花色苷含量及其合成代謝及信號轉導的影響

如圖5A所示，隨著果實的不斷成熟，總花色苷含量不斷提高，熱脅迫處理在轉色期和成熟期時期均顯著抑制了總花色苷的積累，EBR有效地逆轉熱脅迫對花色苷積累的抑制作用。

圖5 EBR對‘美樂’葡萄果皮花色苷含量及花色苷合成代謝、信號轉導的影響Figure 5 Effect of EBR on anthocyanin content, anthocyanin biosynthesis and metabolism, and signal transduction of 'Merlot' grape

進一步在轉錄水平上研究熱脅迫及EBR處理對‘美樂’葡萄花色苷合成代謝及信號轉導的影響，如圖5B所示。結果發(fā)現(xiàn)，花色苷合成的上游基因PAL、C4H、CHS、CHI變化趨勢較為一致，即隨著果實成熟，它們的表達量先增加后減少。隨著葡萄果實的不斷成熟，負責調控花色苷合成的下游基因的F3H不斷上調，下游基因LDOX和DFR先上調后下調。此外，在轉色期DAT15時期，熱脅迫較對照組降低了上述大部分基因的表達。而在DAT0后及DAT3時期，EBR對熱脅迫下這些基因表達量的上調起促進作用。在大部分的采樣時間點，熱脅迫促進了5GT的表達，而抑制了3GT的表達，EBR在顯著上調它們的表達方面做出貢獻。同時發(fā)現(xiàn)，負責調控原花青素（兒茶素）合成的基因LAR呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，以及負責調控原花青素（表兒茶素）的基因ANR隨著果實的成熟呈現(xiàn)上調的趨勢，且在大多數(shù)采樣時間，熱脅迫處理均可以促進它們的表達。經過EBR浸泡果實后，DAT3時期的LAR、DAT7時期的ANR上調趨勢更顯著。此外，誘導二氫黃酮醇生成黃酮醇的基因FLS的表達量先上升后下降；在大部分采樣時間，熱脅迫處理顯著下調了它的表達量；在EBR浸泡果實后，表達量雖上調，但整體水平仍低于對照組。

對與花色苷信號轉導密切相關的4個轉錄因子的表達進行測定（圖5C）。結果表明，MYB5A、MYB5B、mybA1、MYB14有一致的變化趨勢，呈現(xiàn)先上升后下降。在大多數(shù)的采樣時間點，熱脅迫下調了這些基因的表達，EBR則有效地逆轉了熱脅迫對它們表達的抑制作用，尤其是在DAT3和DAT7。

2.5 EBR處理對熱脅迫下果實內源BR含量及其合成代謝的影響

如圖6所示，葡萄果實內源BR含量隨著果實成熟而不斷增加，在DAT7和DAT15時期，熱脅迫顯著提高了內源BR的含量。而在大部分的采樣點，EBR處理組相較于熱脅迫處理組，內源BR含量無明顯提高，但其含量仍顯著高于對照組。

圖6 EBR對‘美樂’葡萄果實內源BR含量的影響Figure 6 Effect of EBR on endogenous BR content of 'Merlot' grape

進一步在轉錄水平上分析熱脅迫和EBR對BR合成代謝關鍵基因表達的影響。如圖7所示，上游基因DWF4和CPD表現(xiàn)出較為一致的變化趨勢，在大多數(shù)采樣時間點，熱脅迫都顯著提高了它們的表達量，且在果實DAT11和DAT15時期，EBR對于上調這兩個基因表達量的作用效果也是顯著的。而BR合成上游基因DET2則表現(xiàn)出先略微下降，后逐步提升的趨勢。在大多數(shù)采樣點，熱脅迫下它的表達都顯著高于對照組，在果實DAT0和DAT11時期，EBR顯著上調它的表達。下游基因ROT3，BR6OX1，BR6OX2的表達量在熱脅迫處理組和EBR處理組的轉色期較對照組上調。調控BR代謝的BAS1會隨著果實不斷成熟先上調后下調，在大多數(shù)的采樣時間點，熱脅迫顯著上調了其表達，而EBR處理在絕大多數(shù)的采樣時期較對照組上調了它們的表達。

圖7 EBR對‘美樂’葡萄果實內源BR合成代謝的影響Figure 7 Effect of EBR on endogenous BR biosynthesis of 'Merlot' grape fruit

2.6 內源BR的合成與緩解熱脅迫下果實品質降低的關聯(lián)程度

通過相關性試驗進一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著‘美樂’葡萄果實的不斷發(fā)育成熟，內源BR的積累與果實的膨大，糖分的積累和花色苷的富集關系最為密切（圖8）。令人意外的是，內源BR的積累與多種抗氧化物質的積累呈負相關，遂推測EBR緩解了熱脅迫對葡萄果實的傷害，提高其抗氧化能力并不是通過促進內源BR合成這條途徑完成的，具體的驗證仍待進一步開展。

圖8 內源BR與品質相關指標的關聯(lián)程度Figure 8 Correlation between endogenous BR and quality-related parameters

3 討論與結論

熱脅迫亦稱高溫脅迫，是指環(huán)境溫度升高到植物適宜溫度以上，對植物的能量代謝、生長發(fā)育產生的脅迫現(xiàn)象[13]。隨著溫室效應的日趨嚴重，熱脅迫是葡萄植株生長發(fā)育面臨的最大問題之一，輕則會導致植株的氧化受傷，代謝失調，嚴重時會影響植株的生長發(fā)育及果實品質[3]。綜合本試驗結果可知，熱脅迫確實會顯著抑制釀酒葡萄‘美樂’的果實膨大、果皮著色、糖分積累、抗氧化酶活性提高。EBR的應用可以通過促進與花色苷合成密切相關的結構基因以及轉錄因子的表達，減輕熱脅迫造成的果皮著色困難的程度，通過上調部分抗氧化基因的表達量，緩解熱脅迫對細胞膜造成的傷害，提高抗氧化能力。此外，EBR促進果實內源BR的積累，上調負責內源BR合成的大部分下游基因的表達，以應對葡萄果實代謝失衡、品質下降的現(xiàn)象。最后，相關性分析進一步佐證了我們的推測：BR與葡萄果實多種次生代謝產物的合成密切相關，尤其體現(xiàn)在果實膨大、果皮著色與糖分積累方面。

首先，高溫主要引起生物膜的物理化學狀態(tài)和蛋白質分子構型的可逆變化，由于類囊體膜對熱特別敏感，光合作用失調是熱脅迫的最初指標[14]。高溫造成植物光合作用受到抑制，最后導致細胞和個體的死亡[15]。前人研究證實，EBR處理葡萄葉片后，受熱脅迫（42 ℃）損害嚴重的葉片表型慢慢恢復，光合速率提高，并伴隨著抗氧化相關的SOD、POD、CAT等物質含量的增加，植株對抗熱脅迫的能力顯著增強[16]。本試驗結果表明，熱脅迫處理下果實內的多種次生代謝產物（類黃酮、總酚、白藜蘆醇）含量顯著降低，果實內與抗逆能力相關的SOD、POD及CAT含量在一定時期內顯著增加，果實清除自由基的能力相應提高。EBR對于減輕果實品質下降及抗氧化能力提高方面發(fā)揮著重要作用，在果實轉色期和成熟期，EBR顯著促進了熱脅迫下可溶性固性物的積累。在轉色完成和成熟期，EBR減輕了熱脅迫果實內抗壞血酸和白藜蘆醇減少的表型。在大部分采樣時期，EBR進一步促進了葡萄果實內SOD和POD的積累。此外，我們發(fā)現(xiàn)EBR對促進總酚以及類黃酮的積累在轉色期和成熟期較明顯?；诖耍茰y熱脅迫處理加速了轉色期和成熟期‘美樂’葡萄膜脂過氧化，且與清除自由基相關的抗氧化酶活性也相應提高。EBR不僅促進了多種反映果實品質的次生代謝產物的合成，而且更進一步的加速了多種抗氧化物質的富集，雖然與抗氧化能力提高有關基因的表達量較熱脅迫處理組沒有明顯的上調，但熱脅迫對果實表型及品質的損害還是在EBR處理下有所減輕。

其次，高溫必然會引起植物內源激素含量的變化[17]，諸如脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）這兩種已被廣泛報道與抗逆性提高相關的植物激素，它們的含量在經過熱脅迫后會顯著提高[18-20]。而與植株生長發(fā)育相關的生長素（IAA）和細胞分裂素（CTK）在經過熱脅迫后會顯著降低[21-22]。雖然BR也被證實與提高植株抗逆性密切相關，但由于BR在果實內含量極低，很少有研究系統(tǒng)地討論EBR對熱脅迫處理后葡萄內源BR含量變化的影響。本試驗結果證實了熱脅迫處理的確可以顯著提高大部分采樣時期果實內源BR的含量。EBR處理過后，在轉色前期和成熟期，內源BR含量較熱脅迫處理組提高，但兩個處理組并沒有顯著的差異。進一步在轉錄水平上研究熱脅迫和EBR處理對內源BR合成代謝關鍵基因表達量的影響發(fā)現(xiàn)，熱脅迫促進了BR合成最關鍵的兩個下游基因（BR6OX1與BR6XO2）在轉色完成和成熟期的表達，且促進了BR代謝相關基因（BAS1）表達量在大部分采樣時期的上調，推測雖然BR合成和分解的速率在經過熱脅迫后都有了提高，但是整體上BR合成的速率還是要快于BR分解的速率，最終導致熱脅迫促進葡萄成熟期果實內源BR積累的表型。

眾所周知，葡萄果皮著色困難是熱脅迫后最明顯的表型之一，持續(xù)高溫會嚴重阻礙多種有機營養(yǎng)物質的積累，從而造成果皮花色苷含量的減少[23-25]。本研究結果不僅從表型上提供了熱脅迫嚴重阻礙‘美樂’葡萄果皮著色的理論依據(jù)，而且也得出了經過熱脅迫后，果皮花色苷在轉色期和成熟期顯著降低的結論，并且在轉錄水平上進一步解釋了這個現(xiàn)象，即在果實轉色期和成熟期，熱脅迫顯著抑制了花青素合成下游基因3GT的表達，而促進了原花青素合成關鍵基因ANR和LAR的表達，EBR的應用則可以有效緩解大部分時期熱脅迫對葡萄著色的抑制作用。根據(jù)上述結果推測，熱脅迫會更傾向促進原花青素的合成，而抑制與果皮著色有關的花青素的合成，最終產生相較對照組著色不良的表型，而EBR則可以通過上調大部分與花青素合成相關的基因來緩解熱脅迫處理造成果皮著色困難的現(xiàn)象。

綜上所述，本試驗在轉色前對釀酒葡萄‘美樂’實施熱脅迫處理（最高54 ℃，最低46 ℃，平均50 ℃）基礎上，并于當天用EBR浸泡葡萄果穗，發(fā)現(xiàn)熱脅迫顯著抑制葡萄膨大、糖分積累、果皮著色及多種抗氧化酶活性增強。EBR處理整體上通過促進多種次生代謝產物的積累緩解了熱脅迫對葡萄著色的抑制，通過提高幾種抗氧化酶的活性減輕熱脅迫對葡萄果實細胞膜的傷害。此外，我們推測EBR可通過調控內源BR的合成促進果皮糖及花色苷的積累，改善熱脅迫下果皮著色困難的情況，但具體的分子機制仍待進一步探索。