張軍政,靳淑博,楊治廣,陳 碩,郝晴圓,楊靜也,王晨曦,賀曉曉,孫文浩,孔令展

(河南城建學(xué)院 河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 平頂山 467000)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,越來(lái)越多的新化合物被合成出來(lái),這些化合物的出現(xiàn)對(duì)于人類(lèi)有利有弊,對(duì)環(huán)境也如此。其對(duì)環(huán)境會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判斷。

水蚤(大型蚤)具有個(gè)體小、繁殖快、易獲取、便于操作、二次處理量小等優(yōu)點(diǎn),利用水蚤對(duì)水生生物安全的影響進(jìn)行評(píng)價(jià)是一種快速高效的途徑。張晶晶等[1]對(duì)比了吡丙醚、氟鈴脲、除蟲(chóng)脲、滅蠅胺、噻嗪酮、蟲(chóng)酰肼6種昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及吡蟲(chóng)啉、三唑磷、高效氯氰菊酯、氟蟲(chóng)腈、丁硫克百威原藥5種殺蟲(chóng)劑對(duì)大型蚤的急性毒性。Claudia等[2]研究并建立了農(nóng)藥對(duì)大型蚤的急性毒性模型。Tinkov等[3]研究了有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)對(duì)大型蚤急性毒性的影響。Xu等[4]研究了塑料顆粒對(duì)大型蚤的急性毒性。王倓倓[5]研究了多氯聯(lián)苯醚在巢湖中分布特征及其在大型蚤體內(nèi)的富集轉(zhuǎn)化和毒性效應(yīng)。高磊[6]研究了印染廢水的生物毒性測(cè)試方法。王娜[7]及胡奕[8]研究了納米銀對(duì)大型蚤毒性的影響。堵錫華等[9]研究了苯砜基乙酸酯類(lèi)化合物對(duì)大型蚤急性毒性的結(jié)構(gòu)信息指數(shù)。李渭印等[10]進(jìn)行了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的急性毒性研究。李建鳳等[11]對(duì)芳烴類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)與大型蚤急性毒性關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)的研究。廉潔等[12]探究了三氯生對(duì)蚤狀溞急性毒性。

十二烷基三甲基氯化銨是一種無(wú)色或淡黃色膠體,化學(xué)式C15H34NCl,可溶于水和乙醇。它的化學(xué)穩(wěn)定性良好,耐熱、耐光、耐壓、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿,具有優(yōu)良的滲透性、乳化性、柔軟性、抗靜電性和殺菌性能,因此在化工等領(lǐng)域使用較為廣泛。十二烷基三甲基氯化銨在使用過(guò)程中會(huì)通過(guò)各種途徑進(jìn)入自然水體,對(duì)水生態(tài)產(chǎn)生影響。利用水體中常用的指示生物水蚤探究十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水生生物的影響較為方便安全,同時(shí)與利用個(gè)體較大的魚(yú)等動(dòng)物相比還能節(jié)約資源,保護(hù)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蚤種

試驗(yàn)水蚤為河北省邢臺(tái)市魚(yú)藝傳統(tǒng)金魚(yú)漁場(chǎng)引種并在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)3年穩(wěn)定馴化培養(yǎng)后的水蚤。隨機(jī)選取20只健康母蚤,將母蚤置于水族箱中進(jìn)行繁殖培養(yǎng),培養(yǎng)水采用靜置3 d的自來(lái)水,水族箱置于陽(yáng)光散射光能夠照射到的地方,用小球藻喂養(yǎng)。種群密度為每升水約50只,溫度為室溫。經(jīng)過(guò)母蚤孤雌生殖純系培養(yǎng)3代以后,選用培養(yǎng)3代以上的健康幼蚤為試驗(yàn)蚤。

1.2 試驗(yàn)試劑

重鉻酸鉀為河北省保定化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?十二烷基三甲基氯化銨為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備

水族箱材質(zhì)為有機(jī)玻璃,規(guī)格為900 mm×600 mm×300 mm;分組試驗(yàn)采用100 mL常規(guī)玻璃燒杯;藥品和水蚤的稱(chēng)量使用萬(wàn)分之一電子分析天平。

1.4 試驗(yàn)方法

參考《GB/T 16125—2012大型溞急性毒性實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。試驗(yàn)期間不喂食,定時(shí)觀察記錄水蚤的死亡數(shù),以水蚤心臟停止跳動(dòng)為死亡標(biāo)準(zhǔn),得出半致死濃度24 h LC50。

1.5 試驗(yàn)蚤的敏感性測(cè)試

采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)《水質(zhì)——大型蚤運(yùn)動(dòng)抑制的測(cè)定》(ISO6341:1996)進(jìn)行敏感性測(cè)試。以重鉻酸鉀作為敏感性測(cè)定毒物,對(duì)水蚤進(jìn)行24 h LC50測(cè)試試驗(yàn),檢驗(yàn)所用水蚤是否符合敏感性要求。重鉻酸鉀對(duì)水蚤的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。3次試驗(yàn)水蚤的24 h LC50平均值為1.304 mg/L,3次試驗(yàn)濃度變化較小,誤差為0.54%,說(shuō)明試驗(yàn)水蚤具有非常好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。重鉻酸鉀對(duì)水蚤24 h有效濃度的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)值為0.9～2.0 mg/L,說(shuō)明所用水蚤的敏感性符合試驗(yàn)要求。

表1 重鉻酸鉀對(duì)水蚤的急性毒性試驗(yàn)

1.6 十二烷基三甲基氯化銨試驗(yàn)濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)

采用靜置3 d的自來(lái)水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨水溶液濃度0.10 mg/L、1.00 mg/L為預(yù)實(shí)驗(yàn)濃度,經(jīng)24 h急性毒性試驗(yàn)后,0.10 mg/L濃度條件下的30只水蚤死亡1只,1.00 mg/L濃度條件下30只水蚤全部死亡。因此,十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性效應(yīng)濃度按對(duì)數(shù)濃度設(shè)定為:0.00 mg/L、0.10 mg/L、0.16 mg/L、0.25 mg/L、0.40 mg/L、0.63 mg/L、1.00 mg/L。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

根據(jù)受試物濃度與水蚤死亡數(shù),利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26(IBM SPSS Statistics 26),結(jié)合數(shù)據(jù)繪圖工具Origin 2021和Microsoft Office Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性效應(yīng)

采用靜置3 d的自來(lái)水為培養(yǎng)水體,十二烷基三甲基氯化銨線性對(duì)數(shù)濃度0.10～1.00 mg/L為試驗(yàn)濃度,24 h急性毒性試驗(yàn)濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系如圖1所示。

圖1 24 h濃度與水蚤死亡數(shù)關(guān)系圖

空白對(duì)照組30只水蚤生長(zhǎng)正常,未有死亡現(xiàn)象,說(shuō)明所用培養(yǎng)水體對(duì)水蚤生長(zhǎng)代謝不會(huì)產(chǎn)生毒性作用,在十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10 mg/L時(shí)24 h死亡數(shù)為1只,由圖1可以看出,水蚤死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的變大而增加。濃度為0.10～0.25 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)低于3,說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨不敏感。當(dāng)溶液濃度增加到0.40 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)從3指數(shù)式快速增大到9,說(shuō)明水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的敏感性突然增大。濃度為0.63 mg/L時(shí),水蚤死亡數(shù)為21只。濃度為1.00 mg/L時(shí),30只水蚤全部死亡。

不同濃度的十二烷基三甲基氯化銨在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)水蚤的影響如圖2所示。前4 h內(nèi)水蚤的死亡數(shù)基本為0,說(shuō)明在前4 h內(nèi)水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的敏感性較低。從第4 h到第8 h的這段時(shí)間,在濃度為0.63 mg/L和1.00 mg/L的條件下水蚤死亡數(shù)分別從1、2增加到7、23,水蚤死亡數(shù)量的突然增大說(shuō)明水蚤對(duì)十二烷基三甲基氯化銨的耐受性在8 h左右,且從第8 h到24 h時(shí)間段內(nèi)濃度越高水蚤的死亡數(shù)越高。

圖2 不同濃度不同時(shí)間段水蚤死亡數(shù)的關(guān)系圖

圖3是16 h和24 h水蚤死亡數(shù)隨濃度的變化與指數(shù)Exp3P2模型曲線。由圖3a可以看出,16 h的兩條曲線幾乎重合,說(shuō)明水蚤的死亡數(shù)隨著十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)。由圖3b可以看出,十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度為0.10～0.63 mg/L時(shí),其水蚤的死亡曲線與指數(shù)擬合曲線幾乎重合,溶液濃度為1.00 mg/L時(shí)水蚤的死亡數(shù)低于指數(shù)擬合曲線,水蚤試驗(yàn)數(shù)由30只改為60只,相同條件下試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)60只水蚤也全部死亡,說(shuō)明試驗(yàn)時(shí)間為24 h、溶液濃度為1.00 mg/L的條件下,水蚤的死亡數(shù)與指數(shù)擬合曲線偏離較大的原因是試驗(yàn)水蚤的樣本數(shù)量不同。

a 16 h

16 h和24 h水蚤死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系可用指數(shù)Exp3P2模型描述,其指數(shù)擬合曲線方程為

y=ea+bx+cx2

(1)

其中16 h和24 h指數(shù)擬合曲線所對(duì)應(yīng)方程(1)的具體參數(shù)值如表2所示。

表2 16 h和24 h對(duì)應(yīng)方程(1)的具體參數(shù)值

由表2可知,16 h時(shí)R2值為0.999 29,表明水蚤的死亡數(shù)與十二烷基三甲基氯化銨溶液濃度在Exp3P2模型下擬合度非常高,說(shuō)明水蚤的死亡數(shù)與溶液濃度之間的關(guān)系符合Exp3P2指數(shù)模型,水蚤的死亡數(shù)隨著溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。24 h同理可得,R2值為0.999 17,其擬合度也非常高,水蚤的死亡數(shù)也符合隨溶液濃度的增大呈指數(shù)增長(zhǎng)的規(guī)律。

將表2數(shù)據(jù)輸入SPSS 26軟件所得結(jié)果如下:

(1) 卡方檢驗(yàn):由皮爾遜擬合優(yōu)度檢驗(yàn)得,在樣品濃度不取對(duì)數(shù)時(shí)得到的卡方值為0.609;在樣品濃度取對(duì)數(shù)時(shí)得到的卡方值為11.638;卡方值越接近零時(shí)擬合效果越好,因此采用樣品濃度不取對(duì)數(shù)時(shí)的卡方值作為最終的檢驗(yàn)值。

(2) 概率估算:由參數(shù)估算值得到線性回歸方程為:y=-2.388+4.717x,95%置信區(qū)間為3.513～5.921。概率為0.500時(shí)對(duì)應(yīng)的估算值為0.506,下限值為0.451,上限值為0.576。

由內(nèi)插法計(jì)算十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應(yīng)如圖4所示,當(dāng)y=0.5(概率為50%)時(shí),x的值為0.625,即十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50=0.625 mg/L。說(shuō)明十二烷基三甲基氯化銨在濃度為0.625 mg/L的條件下對(duì)水生生物即有較高毒性,對(duì)水生態(tài)影響較大。十二烷基三甲基氯化銨能溶解紅細(xì)胞,水蚤屬于枝角類(lèi)動(dòng)物,其血液含有血紅素,血紅素溶于血漿,肌肉、卵巢和腸壁的細(xì)胞中也含血紅素,因此十二烷基三甲基氯化銨可通過(guò)破壞血紅素對(duì)水蚤生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響,從而導(dǎo)致其死亡。

圖4 十二烷基三甲基氯化銨轉(zhuǎn)換后概率響應(yīng)圖

2.2 水蚤急性毒性分級(jí)

樣品的急性毒性主要根據(jù)動(dòng)物經(jīng)口、經(jīng)皮半數(shù)致死量(LD50)、吸入半數(shù)致死濃度(LC50)進(jìn)行分級(jí),由受試動(dòng)物體重與樣品的半數(shù)致死量(濃度)進(jìn)行評(píng)價(jià)。水體中污染物對(duì)動(dòng)物的急性毒性分級(jí)不但與污染物濃度有關(guān),還與受試動(dòng)物體重有關(guān)。

2.2.1 水蚤稱(chēng)重實(shí)驗(yàn)

水蚤稱(chēng)重實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)兩種稱(chēng)重方法。

方法一:將水蚤分為大水蚤(≥4 mm)、中水蚤(1～4 mm)、小水蚤(≤1 mm),如圖3所示。這3種水蚤分別隨機(jī)選取10只,用吸水紙將其表面水分吸干,用接種環(huán)將其移放至稱(chēng)量紙上,稱(chēng)量后記錄數(shù)據(jù)并將水蚤放回原處,再重新隨機(jī)選取10只水蚤,重復(fù)操作以上步驟,稱(chēng)取10次,得到大水蚤、中水蚤、小水蚤稱(chēng)量10次的數(shù)據(jù),分別求取平均值,再將得到的3組平均值求取平均值,為0.007 61 g。

方法二:不分大小隨機(jī)選取十只水蚤按照方法一的步驟進(jìn)行稱(chēng)重,稱(chēng)取10次,求取平均值,為0.006 48 g。

由圖5可知,將水蚤實(shí)體用顯微鏡全部放大70倍,獲得的圖片經(jīng)測(cè)量得到隨機(jī)選取的大水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為5 mm。同理可得中水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為2 mm,小水蚤實(shí)際長(zhǎng)度為1 mm。據(jù)此劃分大、中、小水蚤的范圍為:長(zhǎng)度≤1 mm的水蚤劃分為小水蚤;長(zhǎng)度在1～4 mm的水蚤劃分為中水蚤;長(zhǎng)度≥4 mm的水蚤劃分為大水蚤。

小水蚤

在探究十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤影響的試驗(yàn)中,每個(gè)燒杯的試驗(yàn)蚤數(shù)量都是10只,因此將10只水蚤作為一個(gè)整體所得到的平均質(zhì)量用于后續(xù)步驟的比例縮放。將兩種方法所得10只水蚤平均質(zhì)量再取平均值(0.007 045 g),得到最終將用于后續(xù)推算步驟中使用的數(shù)值。

2.2.2 水蚤急性毒性分級(jí)推算

由于國(guó)家目前對(duì)藥品急性毒性的劃分是經(jīng)過(guò)大鼠或者小鼠實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果進(jìn)行劃分,沒(méi)有通過(guò)水蚤急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行劃分,所以根據(jù)目前已知的急性毒性分級(jí)推算得到以水蚤為研究對(duì)象的急性毒性分級(jí)。

推算步驟如下:根據(jù)前面水蚤稱(chēng)重實(shí)驗(yàn)所得10只水蚤平均質(zhì)量為0.006 67 g,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g、大鼠180～240 g、豚鼠200～250 g、家兔2.0～2.5 kg、貓1.5～2.0 kg為宜。表3為工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

將小鼠作為研究對(duì)象,用于急性毒性使用小鼠體重以18～25 g,取其平均值為21.5 g。10只水蚤平均質(zhì)量為0.007 045 g,即小鼠的平均質(zhì)量是10只水蚤平均質(zhì)量的3 052倍。由表4可知,小鼠吸入2 h不同毒性分級(jí)LC50值為已知。將這些數(shù)值乘以12得到的數(shù)值,再除以3 052即可得到新的毒性分級(jí)以及相對(duì)應(yīng)的濃度范圍。將最終得到的數(shù)值作為水蚤在溶液中接觸24 h LC50值。結(jié)果如表4所示。十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50為0.625 mg/L,經(jīng)過(guò)查詢比對(duì)發(fā)現(xiàn)推算得到的十二烷基三甲基氯化銨毒性與其他實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果基本一致,屬于高毒性物質(zhì)。

表4 新急性毒性劃分等級(jí)

李渭印等[10]研究了次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的急性毒性并根據(jù)相關(guān)毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚進(jìn)行等級(jí)劃分。其試驗(yàn)結(jié)果表明次氯酸鈉、表面活性劑、苯酚對(duì)大型蚤的24 h LC50分別為0.216 mg/L、8.590 mg/L、41.295 mg/L。劃分結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級(jí),表面活性劑屬于中毒等級(jí),苯酚屬于低毒等級(jí)。將其試驗(yàn)結(jié)果按照表4急性毒性劃分等級(jí)進(jìn)行毒性劃分,結(jié)果為:次氯酸鈉屬于高毒等級(jí),表面活性劑屬于中等毒級(jí),苯酚屬于低毒等級(jí),所得結(jié)果和李渭印等得到的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

以水蚤(大型蚤)為研究對(duì)象,探究了十二烷基三甲基氯化銨對(duì)水蚤的急性毒性影響,并設(shè)計(jì)相關(guān)試驗(yàn)得到了以水蚤為研究對(duì)象的急性毒性劃分等級(jí),結(jié)果如下:

(1)十二烷基三甲基氯化銨的24 h LC50值為0.625 mg/L,對(duì)應(yīng)急性毒性劃分等級(jí)為高毒性,對(duì)水生生物毒性較高,如果進(jìn)入自然水體中的濃度高于LC50值,將對(duì)水生態(tài)環(huán)境造成一定的負(fù)面影響,產(chǎn)生安全風(fēng)險(xiǎn)。

(2)對(duì)目前已知的急性毒性等級(jí)劃分進(jìn)行改進(jìn),得到了以水蚤為研究對(duì)象的新的急性毒性劃分等級(jí),并通過(guò)相關(guān)案例的對(duì)比驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

(3)水蚤的急性毒性試驗(yàn)可以快捷方便地初步評(píng)估判斷水體中是否含有有毒有害物質(zhì)及其是否會(huì)對(duì)周?chē)鷳B(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。