胡建業(yè),洪若菲,魏秀武,韓雨燕,洪 軍

(1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河南 平頂山 467036;2.河南工業(yè)大學(xué) 國(guó)際教育學(xué)院,河南 鄭州 450001)

韭菜屬百合科多年生宿根草本植物,其根、莖、葉、花和籽都具有重要的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,具有補(bǔ)腎溫陽(yáng)、行氣理血、潤(rùn)腸通便、益肝健胃等藥理作用。已從韭菜中分離提取到含硫化合物、黃酮類化合物、甾體皂苷類化合物、含氮化合物、植物油類、維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、多糖等化學(xué)成分[1]。對(duì)韭菜功能研究報(bào)道較多,韭菜醇提物具有較好的抑菌效果,如100%韭菜醇提物對(duì)沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等都有一定的抑制作用,其中對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng),不同菌株之間的抑菌效果有顯著性差異,且韭菜醇提物中含有豐富的硫醚類及酯類化合物,其中硫醚類化合物占了總樣品組分的27.39%,這些硫醚類化合物可能是韭菜抑菌作用的主要活性物質(zhì)[2]。趙剛等[3]研究表明在離體條件下韭菜水提液對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。在韭菜的抗氧化作用中,孫志勇等[4]采用乙醇浸潤(rùn)萃取韭菜葉及韭菜籽中活性物質(zhì),結(jié)果表明韭菜籽及韭菜葉醇提物對(duì)DPPH自由基和羥基自由基都有較強(qiáng)的清除能力。也有報(bào)道表明韭菜提取物(70%乙醇提取)可以使大鼠血清中的總膽固醇含量下降約38%,甘油三酯含量下降15%,但高密度脂蛋白膽固醇增加不顯著,表明韭菜提取物對(duì)輔助降血脂有一定的作用[5]。關(guān)于韭菜水提物和醇提物活性成分及其功能差別的研究較少。

為探討不同溶劑提取工藝對(duì)活性成分及功能的異同,以韭菜為研究對(duì)象,根據(jù)相似相溶原理,分別采用水提法和醇提法提取韭菜中活性物質(zhì),確定其多糖、蛋白質(zhì)和黃酮的含量,并對(duì)其不同提取物的抑菌率、降血脂及抗氧化能力等方面進(jìn)行研究,為韭菜的應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

韭菜(市售);乙醇、蒽酮、硫酸、葡萄糖、30%H2O2、抗壞血酸、硫酸亞鐵、無(wú)水亞硫酸鈉、水楊酸、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸均由洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠提供;考馬斯亮藍(lán)由天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;牛血清白蛋白由北京索萊寶科技有限公司提供;瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨由西亞化學(xué)科技(山東)有限公司提供;DPPH由上海麥克林生化科技有限公司提供;豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉均由上海源葉生物科技有限公司提供。

供試菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、綠膿桿菌CGMCC1.2620,均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GFL-125型烘箱(天津萊博特瑞儀器設(shè)備有限公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、HWS12型恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、KQ5200DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、Genesys 10S型紫外分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技公司)、酶標(biāo)儀(美國(guó)PE公司)、立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 韭菜活性物質(zhì)的提取

取新鮮韭菜清洗,將韭菜葉切成長(zhǎng)約3～5 cm小段,放置于45 ℃烘箱中烘干。48 h后取出粉碎,過(guò)40目篩。稱取一定量韭菜粉末,按液料比201 (mL/g)的比例加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行超聲處理,設(shè)置超聲溫度為60 ℃,超聲時(shí)間為60 min,超聲功率為200 W,提取韭菜脂溶性物質(zhì),即韭菜醇提液[6-7]。韭菜水溶性物質(zhì)的提取工藝與之相似,用蒸餾水替代乙醇溶液。然后通過(guò)真空抽濾去渣,將抽濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.5 g/mL,裝入棕色密封瓶放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用前將韭菜水提液和醇提液分別用蒸餾水和乙醇稀釋10倍,得到0.05 g/mL溶液,備用。

1.3.2 韭菜不同提取物中活性成分的含量測(cè)定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用蒽酮-硫酸比色法在625 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定多糖含量[8],并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白質(zhì)含量[9]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硝酸鋁顯色法在510 nm處測(cè)定黃酮含量[10]。

將韭菜水溶性和脂溶性提取液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù);將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別計(jì)算水溶性和脂溶性提取液中的多糖、蛋白質(zhì)和黃酮含量。

1.3.3 韭菜活性物質(zhì)的功能研究

1.3.3.1 韭菜不同提取物的抑菌活性測(cè)定

采用微量肉湯法檢測(cè)韭菜活性物質(zhì)的抑菌率。將制備的韭菜水溶性和脂溶性提取物稀釋液再稀釋10倍,即0.005 g/mL,進(jìn)行過(guò)濾除菌。取培養(yǎng)后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌菌懸液,將菌懸液用液體培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL,取菌懸液160 μL,加入提取液40 μL,置于96孔板中;用菌懸液作陽(yáng)性對(duì)照、以液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照,每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將96孔板置于37 ℃,70 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)18～24 h,觀察微生物生長(zhǎng)情況,在600 nm處測(cè)量吸光度,分別計(jì)算提取物的抑菌率[11]。

1.3.3.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性測(cè)定

(1)不同提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定。

在10 mL的具塞試管中加入1 mL 0.05 g/mL的提取液和4 mL DPPH試劑(6.5×10-5mol/L醇溶液),在517 nm下測(cè)量吸光度,記為A1;用1 mL乙醇溶液代替提取液,做空白對(duì)照記為A0;測(cè)量1 mL無(wú)水乙醇溶液與相同體積提取液的吸光值,記為A2。

以相同濃度的抗壞血酸溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,將以上溶液在避光條件下反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀測(cè)量相應(yīng)的吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),求平均值以減少誤差,計(jì)算水提液和醇提液對(duì)DPPH自由基的清除效果[12]。計(jì)算公式為DPPH自由基清除率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

(2)不同提取物對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定。

先加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液于10 mL的具塞試管中;再加入1 mL 0.05 g/mL韭菜提取液;最后加入1 mL 0.1 mol/L H2O2溶液。將試管置于37 ℃水浴鍋中溫水浴30 min處理,在酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)量吸光度A1,以同體積蒸餾水代替提取液樣品的吸光度為A0,以同體積蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度為A2。在同樣條件下,以相同濃度的抗壞血酸溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù),計(jì)算水提液和醇提液對(duì)羥基自由基的清除能力[13]。計(jì)算公式為羥基自由基清除率 %=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

1.3.3.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

以豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉作為3種膽酸鹽試劑,在10 mL的離心管中加入1 mL提取液和4 mL膽酸鹽試劑(0.3 mmol/L,用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.3),37 ℃恒溫振蕩1 h,后取出在6 000 r/min的離心機(jī)中,離心10 min。取上清液2.5 mL于20 mL的試管中,緩慢加入7.5 mL 60%硫酸溶液,輕輕搖勻,于70 ℃水浴鍋中水浴20 min,取出后再冰水浴5 min,最后在387 nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)1,以蒸餾水代替提取液做空白組A0,以蒸餾水代替硫酸溶液作為對(duì)照組A2。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算提取液對(duì)豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率[14]。計(jì)算公式為結(jié)合率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜提取物中活性成分的含量

根據(jù)測(cè)得相應(yīng)濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度,獲得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.991 7x+0.117 2,R2=0.991 7;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.529 5x+0.280 6,R2=0.992 7;黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.010 8x+0.023 4,R2=0.995 2。根據(jù)以上回歸方程,將不同提取液測(cè)量的OD值代入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別測(cè)得韭菜提取物中活性成分含量,如表1所示。

表1 韭菜不同提取物中活性成分含量 mg/g

由表1可知,韭菜水提液中多糖的含量顯著高于韭菜醇提液,說(shuō)明韭菜中的多糖易溶于水,且多糖含量豐富;水提液中的蛋白質(zhì)含量較韭菜醇提液稍高,但差別不明顯。說(shuō)明韭菜中的蛋白質(zhì)種類豐富,既有水溶性蛋白,又有脂溶性蛋白;而韭菜水提液中的黃酮含量少于醇提液中的黃酮含量,但總體上韭菜中黃酮含量占比較少。此結(jié)果與劉華等[15]研究的在最優(yōu)提取工藝條件下,獲得的韭菜和韭黃中提取的總黃酮含量(分別為3.68 mg/g和0.53 mg/g)相比較少,可能與提取工藝、韭菜來(lái)源等不同有關(guān),本研究中韭菜醇提液采用95%的乙醇溶劑制備,主要成分是葉綠素。

2.2 韭菜活性物質(zhì)的功能

2.2.1 韭菜不同提取物的抑菌活性測(cè)定

在3種受試菌中,韭菜醇提液的抑菌率均顯著高于水提液的抑菌率(見(jiàn)表2),說(shuō)明溶解在乙醇中的蛋白質(zhì)、黃酮等成分比溶解在水中的相應(yīng)成分具有更強(qiáng)的抑菌活性。從韭菜提取液對(duì)不同菌株的抑菌活性來(lái)分析,韭菜水提液和醇提液在金黃色葡萄球菌中的抑菌率分別是33.90%、60.49%;兩種提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率均低于對(duì)另外兩種菌株(大腸桿菌和綠膿桿菌)。

表2 韭菜不同提取物的抑菌活性比較

由表2可知,韭菜醇提液的抑菌性強(qiáng)于韭菜水提液,但是韭菜水提液和醇提液對(duì)3種菌株抑菌活性的順序是一致的。這與李洪山等[2]研究100%韭菜醇提物對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等都有一定的抑制作用相一致,但與崔東亞等[16]提出的韭菜水提液對(duì)金黃色葡萄球菌強(qiáng)于大腸桿菌存在偏差,產(chǎn)生偏差的原因推測(cè)可能與提取工藝及所用溶劑不同有關(guān)。

2.2.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性測(cè)定

表3為韭菜不同提取物對(duì)自由基清除能力比較,韭菜醇提物對(duì)DPPH自由基的清除率比韭菜水提物的清除率高,而韭菜水提液對(duì)羥基自由基的清除率較韭菜醇提液清除率稍高,但與相同濃度的抗壞血酸相比,韭菜提取液對(duì)DPPH自由基和羥基自由基清除率相對(duì)較弱。這可能與韭菜水溶性物質(zhì)和醇溶性物質(zhì)活性成分差異有關(guān)。表明韭菜提取物具有一定的抗氧化能力,但較抗壞血酸的抗氧化能力弱。這與孫志勇等[4]研究乙醇浸潤(rùn)萃取提取韭菜葉及韭菜籽中活性物質(zhì)表明韭菜的水提液和醇提液都具有明顯的抗氧化功能一致。

表3 韭菜不同提取物對(duì)自由基清除能力比較

2.2.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

體內(nèi)降低膽固醇的主要途徑是與膽酸鹽結(jié)合,因其可有效排除體內(nèi)膽汁酸,間接降低膽固醇含量,從而使血脂含量降低。在降血脂實(shí)驗(yàn)中,計(jì)算韭菜水提液和醇提液對(duì)豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率,如圖1所示。在3種膽酸鹽中,韭菜水提液與膽酸鹽的結(jié)合率明顯高于韭菜醇提液的結(jié)合率,表明韭菜水提液的降血脂效果較醇提取液好。一方面說(shuō)明溶解在水中的降血脂活性成分高于乙醇中的降血脂成分;另一方面可能是由于膽酸鹽本身作為鹽類物質(zhì),其水溶性就高于脂溶性。在3種膽酸鹽中,韭菜提取物對(duì)牛膽酸鈉的結(jié)合率均高于另外兩種膽酸鹽,說(shuō)明韭菜提取物與含有牛膽酸鈉的血脂相結(jié)合效果較好。

圖1 韭菜不同提取物對(duì)3種鹽的結(jié)合率測(cè)定

3 結(jié)論

本研究對(duì)韭菜水溶性和脂溶性活性物質(zhì)進(jìn)行提取,并對(duì)提取物的抑菌活性、抗氧化和降血脂能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明韭菜水提液中多糖和蛋白質(zhì)含量較高。韭菜醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌的抑菌率較水提液高。醇提液對(duì)DPPH自由基的清除率高,而水提液對(duì)羥基自由基的清除率高,與抗壞血酸相比,韭菜提取物的抗氧化能力較弱。韭菜水提液對(duì)豬膽鹽、牛膽酸鈉、脫氧膽酸鈉的結(jié)合率均較醇提液高,表明水提液在輔助降血脂方面效果較好。