于愛清 施永海 徐嘉波 嚴(yán)銀龍 鄧平平

(上海市水產(chǎn)研究所,上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 200433)

脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding proteins,FABPs)隸屬于蛋白分子量在14～16 kD的胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員,與脂肪酸和膽固醇等親脂性物質(zhì)結(jié)合而參與疏水性長鏈脂肪酸在細(xì)胞內(nèi)、外的轉(zhuǎn)導(dǎo),并影響脂類代謝酶的活性、胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因的轉(zhuǎn)錄,也能夠作為分泌型蛋白調(diào)控細(xì)胞的生長和增殖[1-2]。FABP1與其他FABPs家族成員一樣,均具有類似的結(jié)構(gòu):一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋域和由10個反平行β鏈組成的β桶,配體長鏈脂肪酸結(jié)合在β折疊內(nèi)空洞中心,空洞中心的水分子能夠置換脂肪酸,維持空洞內(nèi)的靜電網(wǎng)絡(luò)和蛋白穩(wěn)定性[1-2]。目前,哺乳動物FABPs按照首次分離或鑒定的時間和表達(dá)的組織特異性,主要分為FABP1(肝臟型)、FABP2(小腸型)、FABP3(心臟型)、FABP4(脂肪型)、FABP5(表皮型)、FABP6(回腸型)、FABP7(腦型)、FABP8(髓鞘型)和FABP9(睪丸型)等9種類型[3]。不同類型的FABPs基因序列之間具有高度同源性,分別高度表達(dá)于不同的組織,而伴隨著研究的深入,該蛋白家族的生物學(xué)功能不斷被挖掘和擴(kuò)展到生長、發(fā)育、營養(yǎng)及免疫等諸多方面。

哺乳動物和禽類的FABP1基因往往與動物的肌內(nèi)脂肪酸沉積[4]、肌內(nèi)脂肪酸含量[5]和肉質(zhì)緊密相關(guān),被應(yīng)用于生產(chǎn)性狀的遺傳改良和品種/系的選育研究。在魚類中,FABPs基因家族的研究主要集中于基因克隆、組織表達(dá)和表達(dá)模式、基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪酸沉積及生長性狀的相關(guān)性分析等方面[6-7]。Liu等[8]開展了斑馬魚(Daniorerio)FABP3基因的結(jié)構(gòu)和功能研究,發(fā)現(xiàn)斑馬魚FABP3在各組織均有表達(dá),在心臟中表達(dá)量最高,并且與斑馬魚的卵黃發(fā)育和肝臟脂肪酸代謝功能密切相關(guān)。廖玉英等[9]對暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)FABP3基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)研究,探明暗紋東方鲀的FABP3基因主要參與脂肪酸分解過程,并探討了在暗紋東方鲀飼料中用豆油替代魚油的可行性。林亞秋等[10]開展了齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)和鯉(Cyprinuscarpio)FABP3基因的克隆、表達(dá)模式及其與肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的相關(guān)性研究,發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚FABP3基因的表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān),而鯉的FABP3基因則與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)。俞菊華等[2]開展了建鯉(C.carpiovarJian)FABP3基因多態(tài)性與增重性狀的相關(guān)性研究,獲得了1個與建鯉雌、雄魚魚種階段和雌魚成魚階段增重顯著相關(guān)(P<0.05)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(C30G),發(fā)現(xiàn)CC基因型個體增重顯著快于CG型個體,有望應(yīng)用于建鯉的分子輔助良種研究。楊曉等[7]開展了紅鰭東方鲀(T.rubripes)FABP7基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)性研究,獲得了兩個與紅鰭東方鲀生長性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)(G676A和A731C),有望應(yīng)用于后期紅鰭東方鲀的分子育種研究。截至目前,長江刀鱭FABPs基因家族的相關(guān)研究鮮見報道。

刀鱭(Coiliaectenes)又名長頜鱭,俗稱刀魚、毛刀魚,隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬(Coilia),主要分布于我國黃渤海、東海海域及以長江為代表的通海江河[11-12]。長江下游刀鱭的產(chǎn)量最高,因其魚體豐腴肥滿、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美而享有“長江三鮮”之首的美譽(yù)[13-15]。近年來,由于受到棲息地水域環(huán)境的污染、人類工程建設(shè)及酷漁濫捕等因素的影響,長江刀鱭自然種質(zhì)資源急劇衰退[16]。但隨著人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟,以及長江流域十年禁捕政策的實施,自然種質(zhì)資源衰退的現(xiàn)狀得到了極大緩解。與此同時,養(yǎng)殖需求日益擴(kuò)大,而良種卻極為匱乏,亟需選育出一個具有優(yōu)良性狀的長江刀鱭新品系進(jìn)行推廣養(yǎng)殖。

本研究以上海市水產(chǎn)研究所的長江刀鱭核心選育群體F3為研究對象,基于長江刀鱭的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得長江刀鱭FABP1基因(CeFABP1基因)的部分cDNA序列,利用基因克隆和直接測序技術(shù)獲得CeFABP1基因的cDNA全長序列和基因組DNA序列,通過對該基因DNA上的多態(tài)性SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選,開展基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究,以期能夠為長江刀鱭種質(zhì)資源評估和分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用長江刀鱭均取自于上海市水產(chǎn)研究所奉賢科研基地于2017年獲得的長江刀鱭核心選育群體(F3)。

隨機(jī)選取3尾2齡刀鱭置于冰上,放置1～2 min待其輕微麻醉后,進(jìn)行活體解剖。將肝組織迅速解剖分離出來,用無菌DEPC水沖洗后,置于液氮中迅速冷卻,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于長江刀鱭FABP1基因的cDNA全長克隆研究。

隨機(jī)選取100尾同批次同池塘飼養(yǎng)的2齡長江刀鱭,用游標(biāo)卡尺和電子天平測得其平均體長為(21.89±4.51) cm,平均體高為(3.40±0.74) cm,平均體質(zhì)量為(39.83±22.73) g。剪取部分魚的尾鰭置于盛有95%乙醇的1.5 mL離心管中,分別編號后,置于-20 ℃冰柜中保存,用于長江刀鱭FABP1基因的基因組DNA擴(kuò)增、SNP位點(diǎn)篩選及其基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。

隨機(jī)選取大規(guī)格雌性刀鱭(99.18±12.81)g、小規(guī)格雌性刀鱭(16.10±0.26)g、大規(guī)格雄性刀鱭(59.75±3.19)g和小規(guī)格雄性刀鱭(18.90±0.44)g各3尾,置于冰上,放置1～2 min,至其輕微麻醉后進(jìn)行活體解剖。將肝臟剖離出來,用無菌DEPC水沖洗后,置于液氮中迅速冷卻,然后置于-80 ℃超低溫冰箱保存,用于開展長江刀鱭FABP1基因在大/小規(guī)格長江刀鱭的相對表達(dá)量研究。

1.2 總RNA和基因組DNA的提取

長江刀鱭肝臟組織總RNA的提取均參照Trizol Reagent Kit(RNA Extraction Kit,Invitrogen)試劑盒說明書進(jìn)行?？俁NA溶解于DEPC水后,利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計測定其濃度和純度,并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量,EB(溴化乙錠)染色凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。將質(zhì)量較好的RNA(28S和18S條帶清晰,且28S與18S的灰度比約為2∶1、無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)、點(diǎn)樣孔附近無殘留,表明RNA無降解,質(zhì)量可靠)置于-80 ℃超低溫冰箱保存,備用。

長江刀鱭鰭條組織基因組DNA的提取參照天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)說明書進(jìn)行。DNA樣本提取完成后,利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測樣本DNA的質(zhì)量和濃度;經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,顯示無拖尾降解現(xiàn)象、條帶清晰,且OD260 nm/OD280 nm的值在1.8～2.0的DNA樣品,稀釋至50 ng/μL后,保存于-20 ℃冰柜中,備用。

1.3 長江刀鱭FABP1基因cDNA全長克隆

(1)cDNA第一鏈的合成:長江刀鱭肝臟所提取的總RNA經(jīng)測定質(zhì)量和濃度后,按照PrimeScriptTMReal-time PCR Kit試劑盒(Takara公司,北京)的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得用于長江刀鱭cDNA序列拼接所需的cDNA模板,利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度,用RNase free水將終濃度統(tǒng)一調(diào)整為200 ng/μL后,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)5’-RACE和3’-RACE cDNA模板的合成:參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Takara公司,北京)說明書的方法,獲得長江刀鱭肝臟組織的3’-末端和5’-末端的cDNA模板,然后利用NanoVue Plus紫外可見分光光度計檢測反轉(zhuǎn)錄好的cDNA模板濃度,最后用Tricine-EDTA 緩沖液將該模板的濃度稀釋至500 ng/μL,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)長江刀鱭FABP1基因cDNA全長的克隆?；诒菊n題組刀鱭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得CeFABP1的部分cDNA序列,并利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計基因特異性引物(CeFABP1-QC)(見表1),對CeFABP1的部分cDNA序列拼接質(zhì)量進(jìn)行驗證?；跍y序驗證后的序列,設(shè)計特異性RACE引物(5’GSP-1～2和3’GSP-1～2),以反轉(zhuǎn)錄合成的長江刀鱭肝臟5’-cDNA或3’-cDNA為模板,利用SAMRT-RACE技術(shù)獲得CeFABP1的cDNA序列全長。反應(yīng)體系為25 μL,包括12.5 μL 2×TaqPCR Mix,2 μL 5’ RACE-Ready或3’ RACE-Ready cDNA,2.5 μL UPM(通用引物),0.5 μL 5’或3’基因特異性引物(5’GSP-1～2和3’GSP-1～2),用ddH2O補(bǔ)充總體積至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,72 ℃延伸3 min,5個循環(huán);94 ℃變性30 s,70 ℃延伸30 s,72 ℃再延伸3 min,5個循環(huán);94 ℃變性30 s,在引物最適的退火溫度退火30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環(huán)后,72 ℃再延伸10 min,4 ℃+∞。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的條帶割膠純化,并進(jìn)行T-A克隆測序,測序菌液經(jīng)菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后,交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序(測序所用引物為23-Mer和24-Mer)。

表1 用于長江刀鱭FABP1基因擴(kuò)增所用引物序列

(4)以大規(guī)格/小規(guī)格雌、雄長江刀鱭肝臟組織cDNA模板,利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測長江刀鱭FABP1基因的表達(dá)差異情況?；陂L江刀鱭FABP1基因的cDNA序列設(shè)計qRT-PCR引物(見表1),利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)在StepOne Plus實時熒光定量PCR儀(ABI,美國)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照該試劑盒說明書進(jìn)行,每個樣品做3次技術(shù)重復(fù),以長江刀鱭β-actin為內(nèi)參基因,利用2-ΔΔCt法計算長江刀鱭FABP1基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 CeFABP1的生物信息學(xué)分析

利用VecScreen在線軟件篩除CeFABP1基因克隆測序序列中的載體序列,并經(jīng)SMART-RACE技術(shù)克隆并拼接CeFABP1基因的cDNA全長。利用NCBI ORF-Finder、SMART、Predict-protein、SWISS-MODEL和ExPasy-ProtParam等在線軟件預(yù)測該基因的開放式閱讀框,預(yù)測信號肽和結(jié)構(gòu)域,分析該基因蛋白組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì);用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 CeFABP1基因組DNA擴(kuò)增和多態(tài)SNP位點(diǎn)篩選

基于CeFABP1基因的cDNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因特異性PCR擴(kuò)增引物(見表1)。其中,CeFABP1-FL是參照大西洋鯡FABP1基因內(nèi)含子和外顯子的相對位置設(shè)計而成,用于擴(kuò)增CeFABP1基因的第1內(nèi)含子、第2內(nèi)含子和第3內(nèi)含子序列;CeFABP1-SC則以CeFABP1基因組DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計而成,然后以具有極端生長表型的不同刀鱭,即體質(zhì)量最大的10尾魚[(89.53±14.51) g]和體質(zhì)量最小的10尾魚[(18.75±1.62) g]的DNA樣本為模板,利用直接測序法篩選CeFABP1基因組DNA上的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.6 CeFABP1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性

基于初步的多態(tài)性SNP位點(diǎn)篩選結(jié)果,鑒于長江刀鱭FABP1基因組DNA上的SNP位點(diǎn)間隔均較小,不易用其他方法進(jìn)行分型,因此采用直接測序法(引物CeFABP1-SC)對100尾長江刀鱭進(jìn)行基因分型?；诨蚍中徒Y(jié)果,利用GenAIEx 6.5軟件[17]計算長江刀鱭養(yǎng)殖群體的有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)和期望雜合度(expected heterozygosity,Ne)等遺傳參數(shù),并對14個SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗;利用PIC-CALC軟件計算實驗群體中每個SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC);利用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(general linear model,GLM)分析不同SNP位點(diǎn)的不同基因型及其與刀鱭生長性狀(體質(zhì)量、體高和體長)的關(guān)聯(lián)程度。

2 結(jié)果

2.1 CeFABP1基因序列特征和生物信息學(xué)分析

CeFABP1 cDNA全長525 bp,開放式閱讀框由384個核苷酸所編碼的127個氨基酸組成,以ATG作為起始密碼子,TGA作為終止密碼子;5’-非編碼區(qū)和3’-非編碼區(qū)長度分別為99 bp和42 bp,在3’-非編碼區(qū)域具有明顯的多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA)(見圖1)。長江刀鱭FABP1基因組DNA由1 285個核苷酸組成(見圖2),包括4個外顯子和3個內(nèi)含子。

CeFABP1蛋白的原子組成為C617H1011N161O195S5,蛋白分子量為13.965 kD,理論等電點(diǎn)為6.12。CeFABP1蛋白的氨基酸組成見表2。結(jié)果顯示,氨基酸殘基中負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為16個,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為15個,其中色氨酸(Trp)缺失,數(shù)量為0;賴氨酸(Lys)數(shù)量最多(13個),占氨基酸總數(shù)的10.24%?；诘鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性劃分標(biāo)準(zhǔn),若不穩(wěn)定系數(shù)≤40即為穩(wěn)定性蛋白。CeFABP1氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)為32.10,表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

表2 長江刀鱭FABP1基因編碼蛋白的氨基酸組成

CeFABP1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測為混合型,由19個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的14.96%)構(gòu)成α-螺旋(alpha-helices),58個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的45.67%)構(gòu)成無規(guī)則卷曲(random coil),50個氨基酸(占氨基酸總數(shù)的39.37%)構(gòu)成伸展鏈(extend stand)(見圖3)。利用SWISS-MODEL軟件對CeFABP1蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示,CeFABP1蛋白三維結(jié)構(gòu)主要由10個β折疊和2個α-螺旋組成(見圖4)。

注:藍(lán)色代表α-螺旋,紅色e代表伸展鏈,橘黃色c代表無規(guī)則卷曲。

圖4 長江刀鱭FABP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

基于CeFABP1氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,CeFABP1首先與大西洋鯡聚為一支,再與美洲西鯡聚為一支,最后與其他魚類聚為一支。這一結(jié)果與傳統(tǒng)的分類關(guān)系相一致(見圖5)。

圖5 長江刀鱭FABP1基因編碼區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 長江刀鱭FABP1基因在肝臟組織的表達(dá)量分析

鑒于長江刀鱭雌、雄個體的表型差異相對較大,本研究大/小規(guī)格的雌、雄長江刀鱭為實驗材料,以小規(guī)格長江刀鱭為對照組,大規(guī)格長江刀鱭為試驗組,基于肝臟組織,開展長江刀鱭FABP1基因的相對表達(dá)量研究。結(jié)果顯示,在雌性長江刀鱭中,大規(guī)格長江刀鱭的FABP1基因mRNA的表達(dá)量是小規(guī)格長江刀鱭的0.55倍;在雄性長江刀鱭中,大規(guī)格長江刀鱭的FABP1基因mRNA的表達(dá)量是小規(guī)格長江刀鱭的0.80倍(見圖6),表明長江刀鱭FABP1基因?qū)τ陂L江刀鱭雌、雄群體的生長表型均具有負(fù)向調(diào)控作用。

圖6 長江刀鱭FABP1基因在大/小規(guī)格雌、雄個體肝臟的表達(dá)量變化

2.3 長江刀鱭FABP1基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性及遺傳分析

基因多態(tài)性檢測結(jié)果顯示,CeFABP1基因組DNA上總共檢測到14個SNP位點(diǎn)(見圖2中有下劃線且加粗的字體),其中在第1內(nèi)含子上檢測到1個SNP突變位點(diǎn)(g.250A>G);在第2內(nèi)含子上檢測到11個SNP位點(diǎn)(g.544A>T、g.564C>T、g.577A>T>C、g.595A>C、g.637G>T、g.654A>G、g.659G>T、g.670C>G、g.840A>G、g.908C>T和g.108 6A>G);在第3外顯子和內(nèi)含子上分別檢測到1個SNP位點(diǎn)(g.110 4A>G和g.111 8C>G)。

CeFABP1基因上14個突變位點(diǎn)共組成43種基因型,分別將基因型與刀鱭的生長性狀(體質(zhì)量、體長和體高)關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果見表3。從表3中可以看出,14個位點(diǎn)不同基因型個體間的體質(zhì)量、體高和體長性狀均沒有顯著差異(P>0.05)。14個突變位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率(見表4)的分析結(jié)果顯示,不同SNP位點(diǎn)具有不同的基因型頻率和等位基因頻率,其中還有1個具有較高多態(tài)性的三等位基因突變位點(diǎn)(g.577A>T>C)。

表3 長江刀鱭FABP1基因的14個突變位點(diǎn)及其與生長性狀的相關(guān)性分析

表4 14個突變位點(diǎn)在刀鱭養(yǎng)殖群體中的基因型和等位基因頻率

CeFABP1基因上的14個突變位點(diǎn)在刀鱭養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性參數(shù)見表5。有效等位基因數(shù)(Ne)為1.523～2.767,觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.410～0.760和0.343～0.639,多態(tài)信息含量(PIC)為0.284～0.565,其中13個SNP位點(diǎn)均屬于中度多態(tài)(0.250.5)。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢測結(jié)果顯示,3個SNP位點(diǎn)(g.577A>T>C、g.654A>G和g.1 104A>G)均顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05),11個SNP位點(diǎn)(g.250A>G、g.544A>T、g.564C>T、g.595A>C、g.637G>T、g.659G>T、g.670C>G、g.840A>G、g.908C>T、g.1 086A>G和g.1 118C>G)符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。

表5 長江刀鱭FABP1基因上14個突變位點(diǎn)的遺傳參數(shù)分析

3 討論

脂肪酸結(jié)合蛋白通過結(jié)合細(xì)胞內(nèi)游離的脂肪酸和其他疏水性配體,將其輸送到過氧化物酶體、線粒體和細(xì)胞核等細(xì)胞器,調(diào)控動物機(jī)體內(nèi)脂肪酸的氧化和甘油三酯及磷脂合成等脂質(zhì)代謝過程[6],在能量貯存、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物膜的合成、過氧化物酶體的氧化、酶活力的調(diào)節(jié)、機(jī)體免疫反應(yīng)及細(xì)胞的增殖和分化等生理生化過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[6]。研究表明,淡水硬骨魚類具有豐富的Δ12及Δ15等脂肪酸去飽和酶,能夠?qū)営退岷蛠喡樗徂D(zhuǎn)化為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸,并儲存在肌肉等組織中[6,18],使魚類成為人類多不飽和酸脂肪酸攝入的重要食物來源[6]。因此,對魚類脂肪酸代謝相關(guān)基因的研究尤為重要。人類的FABP1基因主要表達(dá)在肝臟,且與脂肪肝、肝硬化及肝癌的發(fā)生密切相關(guān),因而被作為肝損傷早期的高敏感檢測指標(biāo)[19]。禽畜類的FABP1基因與生產(chǎn)性能密切相關(guān),往往被作為生產(chǎn)性能遺傳改良的重要候選基因[4-5,19-20]。目前對魚類FABP1基因的研究較少,僅對FABPs基因家族部分成員開展了基因克隆、基因表達(dá)和表達(dá)模式及其基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪沉積和生長性狀相關(guān)性研究[7,10,21-23],對長江刀鱭相關(guān)方面的研究更是鮮見。因此,對長江刀鱭脂肪酸結(jié)合蛋白及其基因開展進(jìn)一步的研究,對于闡明長江刀鱭脂肪酸結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能及其在良種選育中的應(yīng)用具有重要意義。

本研究首次對長江刀鱭FABP1基因開展了SNP位點(diǎn)的篩選及其基因遺傳多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性研究,結(jié)果顯示,在長江刀鱭的FABP1基因上成功鑒定到14個SNP突變位點(diǎn),其中13個位點(diǎn)發(fā)生在內(nèi)含子上,表明該基因較為保守;而僅在第3外顯子檢測到1個突變位點(diǎn)(g.1 104A>G)。該位點(diǎn)的突變屬于非同義突變,已經(jīng)造成了氨基酸序列的改變,將原來的蘇氨酸(Thr)替換為丙氨酸(Ala),這對于該基因的mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生一定程度的影響,但是對于生長表型暫未產(chǎn)生顯著的影響(3種基因型個體的生長性狀沒有顯著差異)。與之相同的是,人類FABP1基因第3外顯子的1個突變位點(diǎn)(T94A,rs2241883)亦由原來的蘇氨酸(Thr)被替換為丙氨酸(Ala),后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),這個突變位點(diǎn)與人類臨床血脂異常、動脈硬化性腦梗死和非酒精性脂肪肝均顯著相關(guān)[24-25]。正常情況下,蘇氨酸(Thr)在哺乳動物中高度保守,不易發(fā)生突變,但在長江刀鱭中,該位點(diǎn)的突變對于長江刀鱭的其他生理功能是否有影響有待進(jìn)一步研究。

在動物的人工養(yǎng)殖繁育過程中,人工選擇的壓力會導(dǎo)致SNP在動物單個基因或者整個基因組的分布出現(xiàn)差異,特別是位于編碼區(qū)的SNP變異往往能夠引起氨基酸結(jié)構(gòu)的改變,進(jìn)而改變所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或活性,而內(nèi)含子SNP發(fā)生突變的概率經(jīng)常是外顯子的4.3倍[26],部分基因的內(nèi)含子序列含有增強(qiáng)元件或其他順式作用元件,能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄或者剪切,增加mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的穩(wěn)定性,從而影響基因的表達(dá)效應(yīng),因此,發(fā)生于內(nèi)含子的SNP亦不容忽視;而使用頻率不同的密碼子亦能夠?qū)е耺RNA翻譯效率和速度的差異,引起動物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的差異,最終導(dǎo)致動物的生長性能差異。近期有研究表明,發(fā)生在內(nèi)含子內(nèi)的突變能夠?qū)е滤a(chǎn)動物的生產(chǎn)性狀發(fā)生顯著差異[7],如斑點(diǎn)叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)MSTN基因第2內(nèi)含子上的1個突變位點(diǎn)與其體質(zhì)量、體長性狀顯著相關(guān)(P<0.05)[27];長江刀鱭(C.ectenes)MSTN基因第1內(nèi)含子上的1個突變位點(diǎn)與其體長、體高和體質(zhì)量性狀顯著相關(guān)(P<0.05)[28];在紅鰭東方鲀FABP7基因第3內(nèi)含子上檢測到1個與其體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長和體高等多數(shù)性狀均顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[7]。本研究中,在長江刀鱭FABP1基因內(nèi)含子上檢測到的13個突變位點(diǎn),與長江刀鱭的體長、體高和體質(zhì)量均沒有顯著的相關(guān)性,是否與長江刀鱭的脂肪酸含量有關(guān)有待后續(xù)進(jìn)一步的深入研究。此外,在本研究中,突變位點(diǎn)g.1 104A>G僅檢測到AA和AG基因型,并未檢測到GG基因型個體。一方面可能由于樣本量較少,有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行檢測驗證;另一方面,該位點(diǎn)純合GG基因型可能是致死基因型,會導(dǎo)致該基因型個體缺失。正常情況下,SNP突變以二等位基因為主,三等位和四等位基因非常少,幾乎可以忽略不計,而在本研究中,位點(diǎn)g.577A>T>C則是發(fā)生概率極小的三等位基因SNP(tri-allelic SNP),頻率最低的C等位基因頻率為22.5%,該位點(diǎn)的基因遺傳多態(tài)性顯著高于其他突變位點(diǎn)。

觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是群體遺傳變異程度的重要參考指標(biāo),對于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估具有重要作用。在本研究中,14個SNP位點(diǎn)對于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評估的結(jié)果顯示,觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.410～0.760、0.343～0.639和0.284～0.565,表明長江刀鱭養(yǎng)殖群體仍然具有豐富的遺傳變異和較好的種質(zhì)開發(fā)潛力?；贐otstein等[29]提出的多態(tài)信息含量(PIC)的判斷標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)PIC<0.25、0.250.5時,分別代表該位點(diǎn)具有低度、中度、高度多態(tài)性。在本研究中,14個SNP位點(diǎn)中有13個位點(diǎn)屬于中度多態(tài)(0.250.5),表明這些位點(diǎn)能夠有效應(yīng)用于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢測結(jié)果顯示,有3個SNP位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05),表明這些位點(diǎn)可能已經(jīng)受到不同程度的人工選擇壓力的影響。

本研究利用基因克隆和PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了長江刀鱭FABP1基因的cDNA全長序列和DNA序列,并利用直接測序法對長江刀鱭FABP1基因開展了多態(tài)性SNP位點(diǎn)的篩選、分型及其與生長性狀相關(guān)性的研究,成功鑒定到了14個多態(tài)性SNP位點(diǎn),這些位點(diǎn)雖然與生長性狀的相關(guān)性不顯著,但是卻能夠有效應(yīng)用于長江刀鱭養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估。