閆春梅 高春山 鄭偉 王秀蘭 劉長(zhǎng)有 金香琴

(吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院,吉林長(zhǎng)春 130033)

鴨綠江茴魚(yú)(Thymallusarcticusyaluensis)隸屬于鮭形目、茴魚(yú)科,主要分布于吉林省鴨綠江流域,分布區(qū)域狹小,群體間不存在地理隔離[1]。該魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩,營(yíng)養(yǎng)豐富,經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高,是優(yōu)質(zhì)名貴珍稀魚(yú)類。受諸多因素影響,近年來(lái)鴨綠江茴魚(yú)資源嚴(yán)重衰退,已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物[2]。自2013年開(kāi)始,孫鍇等[3]、王秀蘭等[4]、曹永芬等[5]分別在鴨綠江茴魚(yú)人工繁殖及成魚(yú)養(yǎng)殖方面進(jìn)行了科學(xué)研究,突破了鴨綠江茴魚(yú)人工養(yǎng)殖的技術(shù)瓶頸。馬波等[6]、劉云國(guó)等[7]和Sun等[8]相繼應(yīng)用線粒體D-loop基因序列分析法和微衛(wèi)星標(biāo)記法對(duì)茴魚(yú)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)分析,更加精確地分析了茴魚(yú)的群體遺傳結(jié)構(gòu),為茴魚(yú)種質(zhì)資源分析及保護(hù)夯實(shí)了基礎(chǔ),也為茴魚(yú)人工增殖放流提供了科學(xué)依據(jù)。但關(guān)于鴨綠江茴魚(yú)群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究至今鮮有報(bào)道。

本研究將擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)方法應(yīng)用于鴨綠江茴魚(yú)群體遺傳多樣性研究中,利用AFLP標(biāo)記高度的靈敏性、較好的重復(fù)性和豐富的信息量等優(yōu)勢(shì),分析并探討鴨綠江茴魚(yú)群體遺傳結(jié)構(gòu)及群體種質(zhì)資源現(xiàn)狀,以支持鴨綠江茴魚(yú)資源可持續(xù)利用研究的穩(wěn)步開(kāi)展,為資源的長(zhǎng)期開(kāi)發(fā)利用提供重要的數(shù)據(jù)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用鴨綠江茴魚(yú)采捕自吉林省內(nèi)各江段,其中鴨綠江上游采捕48尾,松花江上游采捕24尾;臨江金鯊養(yǎng)殖場(chǎng)采集18尾,共計(jì)90尾。

PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司;引物、AFLP試劑盒、DNA提取試劑盒及其他試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 DNA提取

DNA提取按照離心柱型動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行。提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和濃度后,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AFLP分析

參照AFLP試劑盒的說(shuō)明方法進(jìn)行AFLP反應(yīng),并適當(dāng)優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.3.1 酶切連接

采用一步法進(jìn)行酶切連接反應(yīng),接頭引物序列詳見(jiàn)表1。具體反應(yīng)體系(20 μL)如下:10×Reaction buffer 2.5 μL,10 mmol/L ATP 2.5 μL,Adapter 1 μL,EcoR I/MseI 2 μL,T4 Ligase 1 μL,模板DNA 4 μL(50 ng/μL),AFLP-Water 7 μL。混勻后瞬時(shí)離心,37 ℃ 5 h,8 ℃ 4 h,4 ℃保存過(guò)夜。

表1 AFLP接頭及預(yù)擴(kuò)增引物序列

1.3.2 預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系,具體配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,預(yù)擴(kuò)增引物(EcoR I/MseI 50 ng/μL等比混合)1 μL,dNTPs 1 μL,TaqDNA polymerase(2 U/μL) 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 18 μL?；旌暇鶆蚝笏矔r(shí)離心,94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.3.3 選擇性擴(kuò)增

以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物1∶20稀釋后作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增為25 μL反應(yīng)體系,具體配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,EcoR I 引物(共8種) 1 μL,MseI 引物(共8種) 1 μL,dNTPs 0.5 μL,TaqDNA polymerase 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 17.5 μL?；靹蚝笏矔r(shí)離心。94 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃,擴(kuò)增12輪。接著按94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s擴(kuò)增23輪。選擇性擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表2。

表2 選擇性擴(kuò)增引物序列

1.3.4 AFLP圖譜分析

AFLP多態(tài)性分析采用ABI 377測(cè)序儀進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GENESCAN 3.1提取數(shù)據(jù),利用Binthere軟件提取樣品片段大小。利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)01矩陣處理,將不為0的數(shù)值轉(zhuǎn)換為1,數(shù)值0不變,生成由0和1組成的原始矩陣。利用Popgen 32軟件分析位點(diǎn)總數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)、多態(tài)性位點(diǎn)頻率、觀測(cè)等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)等遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。利用NTSYSpc-2.11F軟件對(duì)原始矩陣求DICE相似系數(shù)矩陣。用SHAN程序中的UPGMA方法進(jìn)行聚類分析,并通過(guò)Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 AFLP選擇性擴(kuò)增結(jié)果

篩選多態(tài)性好且條帶清晰的EcoR I和MseI引物組合8對(duì),對(duì)90尾茴魚(yú)進(jìn)行了AFLP分析,結(jié)果見(jiàn)表3。8組引物共擴(kuò)增出2 670個(gè)位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)2 466個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)比例為92.4%。其中,引物組合E10M6多態(tài)性位點(diǎn)比例最高,達(dá)到99.4%;引物組合E3M7多態(tài)性比例最低,為84.0%。

表3 8組引物的多態(tài)性分析

2.2 遺傳多樣性分析

利用Popgen 32軟件分析3個(gè)群體90尾鴨綠江茴魚(yú)的遺傳多樣性,結(jié)果見(jiàn)表4。其中E10M6引物組合的各項(xiàng)參數(shù)值均最高,觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)為1.708 3,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.257 0,Nei’s多樣性指數(shù)(H)為0.160 4,Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.256 2。3個(gè)群體比較,鴨綠江上游群體的各項(xiàng)參數(shù)值均最高,Na為1.340 9,Ne為1.153 8;H為0.093 2,I為0.144 7;臨江群體次之,松花江上游群體各項(xiàng)參數(shù)值均最低。

利用Popgen 32軟件分析3個(gè)茴魚(yú)群體的遺傳分化情況,結(jié)果見(jiàn)表5。8對(duì)引物組合的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.176 7～0.254 7,其中E10M6值最大,E6M5值最小,表明8對(duì)引物組合在3個(gè)群體間的遺傳分化占總?cè)后w雜合度的17.67%～25.47%。3個(gè)群體的平均Gst值為0.219 4,表明3個(gè)群體間發(fā)生了一定程度的分化。其中,松花江上游群體與臨江群體間平均Gst值為0.232 2,松花江上游群體與鴨綠江上游群體間平均Gst值為0.186 6,鴨綠江上游群體與臨江群體間平均Gst值為0.094 3,可見(jiàn)任意兩個(gè)群體間均發(fā)生了中等程度以上的遺傳分化。

表5 3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體間的遺傳分化系數(shù)

通過(guò)分析DICE相似系數(shù)矩陣,90尾茴魚(yú)的遺傳相似性為0.820 6～0.936 3。其中,3個(gè)群體內(nèi)遺傳相似性分別為:鴨綠江上游群體0.832 2～0.936 3,平均0.895 9;松花江上游群體0.879 6～0.931 7,平均0.900 9;臨江群體0.855 3～0.910 3,平均0.881 6。利用8對(duì)引物對(duì)3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體進(jìn)行UPGMA聚類分析,結(jié)果顯示,3個(gè)茴魚(yú)群體中,松花江上游群體單獨(dú)聚為一支,鴨綠江上游群體和臨江群體出現(xiàn)聚群情況。

圖1 3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

遺傳多樣性(genetic diversity)又稱基因多樣性,是指種內(nèi)基因的變化,包括種內(nèi)顯著不同的種群間和同一種群內(nèi)的遺傳變異。AFLP是一種基于PCR反應(yīng)選擇性地?cái)U(kuò)增限制片段的方法,根據(jù)特異片段或多態(tài)位點(diǎn)的頻率或遺傳相似性可進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳分化等研究。本研究主要是對(duì)吉林省鴨綠江茴魚(yú)群體進(jìn)行種群內(nèi)的遺傳變異分析。從多肽位點(diǎn)比例(PPL)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、總?cè)后w雜合度(Ht)、亞群體雜合度(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst)和群體遺傳相似性等幾個(gè)遺傳多樣性分析常用指標(biāo),對(duì)分別采捕(采集)自鴨綠江上游、松花江上游以及臨江金鯊養(yǎng)殖場(chǎng)的共計(jì)90尾鴨綠江茴魚(yú)的鰭條樣本進(jìn)行了AFLP遺傳多樣性分析。

3.1 鴨綠江茴魚(yú)遺傳多樣性水平分析

鴨綠江茴魚(yú)分布于鴨綠江上游及其支流水系中,其分類學(xué)地位一直存有爭(zhēng)議[1]。2011年,孫家賢等[9]對(duì)黑龍江茴魚(yú)、下游黑龍江茴魚(yú)及黑龍江上游呼瑪河流域北極茴魚(yú)等3種茴魚(yú)的遺傳多樣性進(jìn)行了微衛(wèi)星比較分析,確定3種茴魚(yú)遺傳多樣性水平很高,種間產(chǎn)生了顯著的遺傳分化,并支持3種茴魚(yú)在屬內(nèi)各為獨(dú)立種的分類學(xué)地位。Koskinen等[10]、Stamford等[11]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記和mtDNA-RFLP標(biāo)記分別研究了歐洲和美洲不同茴魚(yú)群體的地理遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系。Froufe等[12]、Weiss等[13]和馬波等[6]利用線粒體D-loop區(qū)DNA序列分析了不同茴魚(yú)群體的分子進(jìn)化關(guān)系。但關(guān)于鴨綠江茴魚(yú)遺傳多樣性水平的分析研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。大規(guī)模的群體遺傳分析是更好地保護(hù)茴魚(yú)群體資源的重要手段和方法。本研究利用AFLP方法,對(duì)吉林省內(nèi)鴨綠江茴魚(yú)3個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多樣性水平分析,共篩選出8組多態(tài)性好且條帶清晰的引物,對(duì)90尾茴魚(yú)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,總計(jì)擴(kuò)增出2 670個(gè)位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)2 466個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)的比例高達(dá)92.4%,顯著高于福建近海竹莢魚(yú)閩東和閩南群體(63.28%、61.89%)[14]及廣東省吉富羅非魚(yú)群體(87.17%)[15],可見(jiàn)本研究中90尾鴨綠江茴魚(yú)遺傳多態(tài)性較高。究其原因,可能是本研究采集的鴨綠江茴魚(yú)大多數(shù)來(lái)自野生環(huán)境,且采自不同地域,這也表明吉林省內(nèi)茴魚(yú)種質(zhì)資源質(zhì)量較好。

本研究對(duì)3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳變異分析,Na、Ne、H、I這4個(gè)指標(biāo)的結(jié)果顯示,鴨綠江上游群體各項(xiàng)值均最高,分別為1.340 9、1.153 8、0.093 2、0.144 7;臨江群體次之,松花江上游群體各項(xiàng)值最低。篩選出8組引物對(duì)3個(gè)群體的90尾鴨綠江茴魚(yú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,計(jì)算結(jié)果,Na為1.251 7～1.340 9,Ne為1.130 0～1.153 8,H為0.078 2～0.093 2,I為0.119 8～0.144 7,這與吉林省雜色杜父魚(yú)野生群體的測(cè)量值相當(dāng)(Na為1.203 7～1.316 6,Ne為1.111 9～1.151 7,H為0.067 0～0.091 2,I為0.102 0～0.141 0)[16],而略低于翹嘴紅鲌?zhí)吧后w(Na為1.579 9,Ne為1.385 9,I為0.322 1)[17],可見(jiàn)本研究采集的90尾鴨綠江茴魚(yú)個(gè)體間存在一定的遺傳變異,對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性為中等。

3.2 鴨綠江茴魚(yú)遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳分化系數(shù)度量的是群體間的基因多樣性。Wright[18]認(rèn)為,當(dāng)群體之間的遺傳分化處于中等程度時(shí),遺傳分化系數(shù)通常在0.05～0.15。本研究利用Ht、Ns及Gst指標(biāo)值對(duì)3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體的遺傳分化情況進(jìn)行分析,Gst平均值為0.219 4,這與條斑星鰈引進(jìn)群體的Gst值相近(0.219)[19],而高于福建近海竹莢魚(yú)閩東和閩南群體(0.044 3)[14]。表明本研究3個(gè)鴨綠江茴魚(yú)群體之間的遺傳分化程度很高。

遺傳相似性及UPGMA聚類分析結(jié)果顯示,3個(gè)群體90尾鴨綠江茴魚(yú)個(gè)體的遺傳相似性較高,為0.820 6～0.936 3,遺傳距離較小。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)明顯看出,松花江上游群體單獨(dú)聚為一支,鴨綠江上游群體和臨江群體聚為一支,表明3個(gè)群體間出現(xiàn)了較高程度的分化,這與遺傳分化系數(shù)顯示的結(jié)果相一致。