馬誕驊，陳吉俊，石宇遠，范佳燕，高紅燕，田柳，王梁

口腔鱗狀細胞癌（OSCC）簡稱口腔鱗癌，約占口腔惡性腫瘤的90%，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)60%的OSCC 患者在確診時已是晚期，常規(guī)治療效果不佳[1]。因此，深入研究OSCC的發(fā)病機制不僅有利于早期癌變指標(biāo)的確認和篩查，更有助于提高患者的生存率。miRNA是由內(nèi)源基因編碼的小非編碼核糖核苷酸序列，一般由17 ～22 個核苷酸組成。在OSCC 研究中可以發(fā)現(xiàn)，miRNA 可參與調(diào)節(jié)OSCC 細胞的多種生物學(xué)行為，如增殖、凋亡、細胞周期阻滯、侵襲、轉(zhuǎn)移，進而影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[2]。有研究表明，miR-19a 與多種癌癥發(fā)病密切相關(guān)[3]，但目前關(guān)于miR-19a 在OSCC 中的表達及其調(diào)控機制的研究甚少。本研究旨在探討miR-19a 對OSCC 細胞增殖、遷移能力的作用及調(diào)控機制，為臨床治療提供新的思路及依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞與試劑 CAL27（口腔鱗癌細胞系，購自美國ATCC）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gbico 公司）；青霉素-鏈霉素（美國Gbico 公司）；miR-19a 模擬物（mimic）和對照隨機（購自上海吉瑪制藥公司）；Lipofectamine3000 等轉(zhuǎn)染試劑（購自美國Invitrogen 公司）；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和試劑（購自Takara公司）；Western blotting 用一抗：-actin、GRK6 和PKC（購于美國abcam公司）；二抗（購自美國Santa Cruz公司）；BCA試劑盒（購于中國碧云天公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CAL27 細胞培養(yǎng)基：10%胎牛血清、1%鏈霉素、青霉素。培養(yǎng)箱條件為37 ℃，將處于對數(shù)生長期的CAL27 細胞，胰酶消化，收集并計數(shù)細胞，于轉(zhuǎn)染前24 h以每孔5×105的細胞密度接種于6 孔板中，加入500l 無雙抗新鮮高糖DMEM 培養(yǎng)基，細胞均勻鋪板后放在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日觀察細胞生長情況，待細胞達到30%～50%融合度進行轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)皿分為miR-19a mimic 組、陰性對照組和空白對照組。用DEPC 水配制成終濃度為50 nmol 的模擬物/陰性對照物，置于—80 ℃保存。分別用500l opti-MEM 稀釋20l模擬物或陰性對照物，500l opti-MEM 稀釋20l Lipofectamine 3 000 L，混勻后加入細胞孵育6 h，然后更換培養(yǎng)基?？瞻讓φ战M中不滴加轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

1.3 miRNA 提取和RT-PCR 使用E.Z.N.A.micro-RNA isolation kit 提取細胞中miRNA，嚴格遵照試劑盒說明書操作，將純化后的RNA 保存于—80 ℃?zhèn)溆?。采用HiScript ⅡReverse Transcriptase kit 合成cDNA，反應(yīng)體系為20l，反應(yīng)條件：42 ℃3 min，60 ℃15 min，85℃5 min。以cDNA 為模板，利用ChamQ Universal SYBR qRCR Master Mix 進行qPCR，反應(yīng)體系為20l，反應(yīng)條件：95 ℃2 min，40個循環(huán)的60 ℃5 s、95 ℃10 s。以-actin 為內(nèi)參，進行電泳顯影，最后通過Image J對條帶的灰度值進行分析統(tǒng)計，引物見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.4 細胞活力檢測 采用MTT 法檢測細胞活力，用胰蛋白酶消化細胞后，按細胞濃度1×104/ml接種；分別于12、24、48 及72 h 后終止細胞培養(yǎng)，PBS 清洗后各組加入100l 常規(guī)培養(yǎng)基，20l MTT 溶液，孵育4 h 后吸掉液體，加入150l 二甲基亞砜溶液，混勻靜置，490 nm 波長處測定吸光度值。

1.5 細胞劃痕實驗 用胰酶消化CAL27 細胞，重懸，計數(shù)，以1×105/ml 接種于6 孔板中，待細胞融合后進行劃痕處理，分別于0、12、24 h 后在40 倍鏡下觀察劃痕愈合情況。Image J 測算遷移面積，計算劃痕愈合率，公式：劃痕愈合率（%）=（初始劃痕面積—12 h/24 h 后劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。

1.6 蛋白免疫印跡法 采用蛋白免疫印跡法檢測GRK6、PKC 含量。用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，確定電泳上樣量。電泳轉(zhuǎn)膜后，4 ℃環(huán)境下用5%脫脂奶粉封閉過夜。第2 天用TBST 洗膜3 次后，加入一抗，4 ℃環(huán)境下孵育過夜。第3 天再用TBST 洗膜3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h 后進行洗膜、顯影，最后通過Image J 對條帶的灰度值進行分析統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計方法 采用Graphpad prism 軟件進行分析，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 法驗證miR-19a mimic 轉(zhuǎn)染效率

miR-19a mimic 轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)miR-19a mRNA 水平高于陰性對照組（P ＜0.05），而陰性對照組與空白對照組miR-19a mRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），該結(jié)果表明轉(zhuǎn)染成功，可進行下一步實驗，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細胞miR-19a mRNA 表達水平變化

2.2 轉(zhuǎn)染miR-19a mimic 后對CAL27 細胞增殖能力的影響 培養(yǎng)48 及72h 后，miR-19a mimic 組細胞活力與陰性對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05），見圖2。

圖2 miR-19a 對CAL27 細胞增殖的影響

2.3 miR-19a對CAL27 細胞遷移能力的影響 劃痕處理12 h 后，miR-19a mimic 組與空白對照組細胞遷移差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），劃痕處理24 h 后，miR-19a mimic 組CAL27 細胞的遷移數(shù)多于空白對照組（P ＜0.05），見圖3。

圖3 miR-19a 對CAL27 細胞遷移能力的影響

2.4 miR-19a 對CAL27 細胞中PKC、GRK6 蛋白活性的影響 miR-19a mimic 組與陰性對照組相比，CAL27 細胞中的GRK6 蛋白含量降低（P ＜0.05）；陰性對照組與空白對照組GRK6 蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。miR-19a mimic 組與陰性對照組相比，PKC蛋白水平升高（P＜0.05），陰性對照組與空白對照組PKC 蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖4。

圖4 miR-19a 對CAL27 細胞中GRK6、PKC 蛋白水平的影響

3 討論

miRNA 被認為是轉(zhuǎn)錄后水平上基因表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。近年來，越來越多的研究證明miRNA在OSCC 的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，被認為是OSCC 早期臨床診斷和治療的重要途徑[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 通過靶向調(diào)控TGFBR3，促進舌鱗狀細胞癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移[5]。在其他非口腔癌癥研究中也發(fā)現(xiàn)miR-19a 具有促癌作用。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 通過調(diào)節(jié)TIMP-2 表達參與喉鱗狀細胞癌的發(fā)生及發(fā)展。Calabrese 等[7]研究證明，miR-19a 在未分化甲狀腺癌細胞中呈現(xiàn)過表達，且參與了未分化甲狀腺癌細胞惡化。Liu 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a通過靶向調(diào)控TIA1，促進結(jié)直腸癌細胞增殖擴散。Feng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 作為促癌因子參與膀胱癌的發(fā)生。以上研究均表明，miR-19a 在多種腫瘤細胞中過表達并發(fā)揮促癌作用，增強腫瘤細胞的增殖及遷移水平。

本研究通過在CAL27 細胞中轉(zhuǎn)染miR-19a mimics，提高細胞中miR-19a 表達水平，探究miR-19a 在OSCC中的作用。結(jié)果顯示miR-19a能夠促進CAL27細胞增殖與遷移。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a 促進CAL27 細胞增殖與遷移作用可能與GRK6 有關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRKs）是一種多功能蛋白激酶家族，其通過磷酸化G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）細胞質(zhì)環(huán)和尾部的特定絲氨酸/蘇氨酸殘基，催化GPCRs失敏。正常生理情況下GPCRs 通過激活PKA 和PKC進而調(diào)節(jié)機體各項生理功能[10]。GRK6、GRK4 和GRK5 同屬于GRK4 亞族，廣泛分布于全身并參與多種疾病進程[11]。Zhang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA 技術(shù)抑制MM1R 細胞中GRK6 活性，可促進細胞凋亡。Qiu 等[12]在對下咽鱗狀細胞癌進行研究中發(fā)現(xiàn)，GRK6 明顯降低，且GRK6 表達降低與下咽鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Yao 等[13]研究表明，GRK6表達水平降低與肺腺癌細胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。以上研究表明，GRK6 表達下調(diào)會促進癌細胞的增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a 過表達導(dǎo)致CAL27 細胞的GRK6 表達明顯減少，提示miR-19a的過表達誘導(dǎo)的細胞增殖和遷移可能與GRK6 下調(diào)相關(guān)，同時GRK6 是否為miR-19a 的下游靶基因也仍需通過進一步的靶向結(jié)合實驗來證明。

PKC 是GPCRs 下游蛋白激酶，GPCRs 可通過激活PKC，介導(dǎo)細胞增殖和遷移，調(diào)節(jié)細胞凋亡等生理功能。在OSCC 相關(guān)研究中有報道指出，PKC 抑制劑十字孢堿通過促進P120ctn 和E-cad 蛋白表達，從而抑制癌細胞的增殖和遷移[14]。Tsai 等[15]研究顯示，PKC 抑制劑可以通過抑制OSCC 細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）活性，從而抑制腫瘤形成。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 過表達導(dǎo)致CAL27 細胞的PKC 表達顯著升高，提示miR-19a的過表達誘導(dǎo)的細胞增殖和遷移，其機制可能與GRK6 介導(dǎo)的PKC 表達變化有關(guān)。

本研究首先證實了miR-19a 能促進OSCC 的增殖和遷移，其機制可能與GRK6 介導(dǎo)的PKC 通路有關(guān)，通過下調(diào)GRK6 表達，提高PKC活性，進而誘導(dǎo)癌細胞的增殖及遷移。后續(xù)實驗將證明GRK6 是否為miR-19a的下游靶基因，進一步通過沉默miR-19a技術(shù)來驗證miR-19a 對OSCC 的作用，更深入研究GRK6-PKC 機制介導(dǎo)的下游細胞凋亡及增殖通路，更全面研究miR-19a 在OSCC 病程發(fā)展中的作用，為OSCC 的miRNA 靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 馬誕驊：實驗設(shè)計、實驗操作、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；陳吉俊、石宇遠：實驗試劑材料準(zhǔn)備、文獻檢索、實驗操作；范佳燕、高紅燕、田柳：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)分析；王梁：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費支持