王瑞飛, 孔盈利, 魏藝璇, 白 雙, 展莉平, 張 昊, 李明軍, 楊清香

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007; 2.河南省農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)與技術(shù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,河南 新鄉(xiāng) 453007)

禽畜糞便中含有大量營(yíng)養(yǎng)成分,是一種潛在的生物質(zhì)能源。中國(guó)每年的禽畜糞便產(chǎn)生量超過(guò)3.0×109t,但是其綜合利用率不足60%[1]。禽畜糞便的不合理處置不僅造成大量養(yǎng)分流失,而且極易造成農(nóng)業(yè)面源污染,給生態(tài)環(huán)境造成巨大壓力[2]。因此,禽畜糞便的資源化利用不僅能降低禽畜糞便的污染風(fēng)險(xiǎn),而且能夠?qū)崿F(xiàn)禽畜糞便的再利用,對(duì)推動(dòng)禽畜養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。

目前,高溫堆肥已經(jīng)成為中國(guó)實(shí)現(xiàn)禽畜糞便資源化的最有效方式之一[3],具有無(wú)害化處理徹底、附加值高、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn),但也存在腐熟周期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)流失多等問(wèn)題。為了提高高溫堆肥的效果,研究者主要圍繞2個(gè)方面展開(kāi)研究。一方面是高溫堆肥過(guò)程中的條件(如物料成分、通風(fēng)量、含水率等)的優(yōu)化[4-5],另一方面是開(kāi)發(fā)推進(jìn)禽畜糞便腐熟進(jìn)程的微生物菌劑、硝酸鉀等外源添加劑[6]。研究發(fā)現(xiàn),微生物是高溫堆肥順利進(jìn)行的核心決定因素,其他條件和因素往往通過(guò)影響堆肥中的微生物來(lái)調(diào)控有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和物料的腐殖化[7-8]。由于接種微生物菌劑可以直接調(diào)節(jié)堆肥物料中的微生物種類和數(shù)量,提高微生物活性,加速有機(jī)質(zhì)的分解,因此,研究微生物菌劑對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落變化的影響及其作用機(jī)制已經(jīng)成為目前堆肥研究中的熱點(diǎn)[9-11]。

雞糞是中國(guó)重要的有機(jī)肥源之一,生物炭是固體廢棄物在缺氧條件下熱解產(chǎn)生的具有發(fā)達(dá)空隙結(jié)構(gòu)、比表面積大的穩(wěn)定富碳物質(zhì)。已有研究結(jié)果表明,生物炭與雞糞混合后使堆肥物料的堆體密度更小、透氣性更好,有利于微生物的繁殖和活性發(fā)揮[12]。近年來(lái),伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)在各種環(huán)境微生物群落分析中的應(yīng)用[13],部分研究者已經(jīng)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)生物炭禽畜糞便堆肥中的微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性和豐度進(jìn)行了分析。例如,Jiang等[14]通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)測(cè)序發(fā)現(xiàn),牛糞生物炭堆肥中主要真菌屬的豐富度隨著堆制進(jìn)程的推進(jìn)而變化,在堆制初期的真菌主要是曲霉屬真菌(Aspergillus)和未分類真菌(Unclassied fungi),在堆制末期的真菌主要是Myriococcum、未分類的小囊菌(UnclassifiedMicroascaceae)和枝頂孢屬真菌(Acremonium),且與不加生物炭的牛糞堆肥中的微生物群落變化有明顯區(qū)別;Duan等[15]通過(guò)16S rDNA、ITS測(cè)序發(fā)現(xiàn),羊糞蘋(píng)果樹(shù)生物炭混合能夠增加堆制過(guò)程中細(xì)菌的多樣性,減少真菌群落的多樣性,與微生物相關(guān)的酶活性也隨之改變,從而加快了腐熟進(jìn)程;Zhai等[16]通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),在雞糞生物炭混合堆肥堆制過(guò)程中,N2O釋放相關(guān)微生物從22個(gè)下降到19個(gè),從而削弱了反硝化進(jìn)程,提升了堆肥質(zhì)量。盡管目前相關(guān)研究已取得了一定進(jìn)展,但是鮮有研究利用高通量測(cè)序技術(shù)全面評(píng)價(jià)菌劑對(duì)雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中細(xì)菌、真菌群落演替的影響。

本研究首先分析微生物菌劑對(duì)雞糞-生物炭堆肥理化性質(zhì)的影響。隨后,通過(guò)細(xì)菌16S rDNA、真菌ITS高通量測(cè)序技術(shù)和信息學(xué)分析,探討菌劑對(duì)堆肥堆制中細(xì)菌、真菌群落演替的影響。最后,利用種子萌發(fā)試驗(yàn)初步評(píng)估菌劑腐熟雞糞-生物炭堆肥對(duì)植物生長(zhǎng)的潛在促進(jìn)作用,以期為深入闡明菌劑促進(jìn)禽畜糞便堆制過(guò)程中腐熟的微生物學(xué)機(jī)制提供理論借鑒,為堆肥腐熟菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

上海青種子,購(gòu)自河南省新鄉(xiāng)市種子市場(chǎng)。2019年6月,在河南省焦作市武陟縣某生物有機(jī)肥廠進(jìn)行雞糞-生物炭堆肥堆制試驗(yàn)。雞糞含水率50%,總有機(jī)碳含量28.62%,全氮含量1.70%,碳氮質(zhì)量比約17∶1;生物炭含水率10%,總有機(jī)碳含量30.11%,全氮含量1.11%,碳氮比約27∶1。

菌劑菌種的制備。芽孢桿菌(Bacillussp.)BA、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K1、巨大芽孢桿菌(Bacillusmagaterium)J2和木霉(Trichodermasp.)M1,均為筆者所在課題組自行篩選并保藏。用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(4 g磷酸氫二銨,2 g硫酸鉀,1 g氯化鈉,20 g葡萄糖,10 ml 100倍濃縮的微量元素,0.6 g七水合硫酸鎂,1 000 ml蒸餾水,pH值7.0)進(jìn)行細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)(37 ℃,24 h),調(diào)整活菌數(shù)達(dá)1×108CFU/ml;用麩皮培養(yǎng)基(含有40%水分的麩皮)對(duì)木霉M1進(jìn)行培養(yǎng)(28 ℃,7 d),用無(wú)菌水沖洗收集孢子,調(diào)節(jié)孢子含量至1×108CFU/ml。堆肥堆制前將細(xì)菌和孢子等量混合。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品的采集

將雞糞和生物炭混合均勻,調(diào)節(jié)含水率約為50%,碳氮比約為21∶1,采集初始混合樣品(CS),然后將混合物料分為對(duì)照組、處理組(各5 t混合物料),處理組接種細(xì)菌和真菌混合菌劑(1×106CFU/kg);對(duì)照接入與處理組等量的無(wú)菌水。堆體表面覆土,每周翻堆1次。堆肥堆制持續(xù)64 d,在堆肥堆制的第4 d、14 d、30 d、53 d,于同一堆體5個(gè)不同點(diǎn)距堆體表面20 cm處分別取樣,均勻混合作為1個(gè)樣品,并分成2份,分別用于堆肥理化性質(zhì)測(cè)定、DNA提取(高通量測(cè)序)。根據(jù)采樣時(shí)間,分別將對(duì)照組樣品命名為C4(4 d)、C14(14 d)、C30(30 d)、C53(53 d),分別將處理組樣品命名為T(mén)4(4 d)、T14(14 d)、T30(30 d)、T53(53 d)。

1.3 堆肥理化性質(zhì)測(cè)定

每天8:30-9:30用溫度計(jì)分別測(cè)定堆體中心面3個(gè)位置距表面20 cm處的溫度,取其平均值作為堆體溫度,同時(shí)記錄環(huán)境溫度;用105 ℃烘干法測(cè)定堆體含水率,將堆肥樣品與蒸餾水按照1∶10(質(zhì)量體積比)混勻后測(cè)定pH值[17];采用總有機(jī)碳(Total organic carbon,TOC)儀測(cè)定總有機(jī)碳含量[18];用連續(xù)流動(dòng)分析儀(AA3型)測(cè)定全氮含量[19];銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量的測(cè)定方法參考NY525-2012《有機(jī)肥料》[20]。

1.4 高通量測(cè)序

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取樣品DNA,用NanoDrop2000 Spectrophotomete(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)DNA純度和濃度,用上海美吉公司的Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因V3、V4區(qū)(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和真菌ITS區(qū)(ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGA-3′)的擴(kuò)增測(cè)序[21]。

1.5 種子萌發(fā)試驗(yàn)

種子萌發(fā)試驗(yàn)參考已有的方法[22],并做適當(dāng)修改,具體操作如下:將5 g腐熟后的雞糞-生物炭堆肥與去離子水按1∶10(質(zhì)量體積比)混合后浸提30 min,獲得浸提液,將上海青種子先用1%次氯酸鈉溶液浸泡15 min,再用蒸餾水清洗3遍。取5 ml浸提液,加入鋪有濾紙的直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,每皿放置30粒種子(共2皿),25 ℃培養(yǎng)48 h。記錄種子發(fā)芽情況和根長(zhǎng),以去離子水代替浸提液的處理作為對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

用Graphpad prism 8.0、Origin 2018和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,借助上海美吉公司云平臺(tái)(https://cloud.majorbio.com/)進(jìn)行高通量數(shù)據(jù)分析。分別用FLASH 1.2.11、QIIME 1.9.1和UCHIME 8.1進(jìn)行高通量測(cè)序數(shù)據(jù)原始讀數(shù)合并、質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)優(yōu)化,用Uparse 7.0.1090、Bayesian算法獲得操作分類單元(OTU,相似度97%),用Silva細(xì)菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)菌、真菌分類,用Mothur 1.30.2計(jì)算Shannon指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑對(duì)雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中理化特性的影響

2.1.1 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中物料顏色、狀態(tài)及氣味的影響 顏色和狀態(tài)是堆肥物料腐殖化的重要表觀特征[23]。隨著堆肥堆制過(guò)程中水分、多糖類物質(zhì)含量的變化,物料通常由塊狀、易粘結(jié)、有惡臭味逐漸變得均勻松散且有土腥味。圖1顯示,鮮雞糞與生物炭混合后,堆體呈現(xiàn)粘結(jié)狀,內(nèi)部呈黑色,臭味明顯。隨著堆制過(guò)程的推進(jìn),對(duì)照(未接種菌劑)和處理組(接種菌劑)堆體的顏色均漸變?yōu)楹稚５?處理組堆體的顏色變化早于對(duì)照。在堆肥堆制的第4 d時(shí),處理組的塊狀堆體物料團(tuán)塊已明顯變小,刺激性糞臭味基本消除,蚊蠅聚集減少;在堆肥堆制第14 d時(shí),堆體物料已呈現(xiàn)團(tuán)粒狀松散狀態(tài);在堆肥堆制第53 d,堆體帶有明顯土腥味。但是,對(duì)照在堆肥堆制第30 d才呈現(xiàn)團(tuán)粒狀松軟狀態(tài),直至堆肥堆制第53 d仍有刺激性臭味。上述表觀特征的變化表明,接種菌劑明顯加快了堆肥堆體的腐熟進(jìn)程。

A:堆肥堆制的現(xiàn)場(chǎng)場(chǎng)景;B:不同時(shí)間堆肥物料的形態(tài)、顏色變化。圖1 菌劑對(duì)堆肥堆體顏色及形態(tài)的影響Fig.1 Effects of microbial agents on compost color and morphology

2.1.2 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中溫度、含水率和pH值的影響 溫度、pH值和含水率與微生物新陳代謝密切相關(guān),經(jīng)常作為判斷堆肥是否腐熟的重要指標(biāo)[24]。溫度監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,對(duì)照、處理組均能在堆肥堆制的0～4 d內(nèi)快速升溫,其中處理組堆體的溫度在堆肥堆制第4～15 d維持在70 ℃以上,最高溫度達(dá)到76 ℃,之后溫度開(kāi)始下降,在堆肥堆制第64 d,堆體溫度降至40 ℃左右。對(duì)照的溫度雖然在堆肥堆制的第4 d升至60 ℃以上,但是在堆肥堆制第4～64 d,其溫度長(zhǎng)期維持在60 ℃以上,并且其最高溫度(72 ℃)明顯低于處理組(圖2A)。含水率監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,物料的初始含水率約為50%,在堆肥堆制第53 d,對(duì)照、處理組的含水率分別為15.39%、17.06%,但是處理組含水率在堆肥堆制第4～30 d的下降速度明顯快于對(duì)照(圖2B)。pH值監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,2組堆肥堆體的pH值始終保持在7.5～8.3,在堆肥堆制第53 d,對(duì)照、處理組的pH值分別為8.20、7.97,均符合中國(guó)農(nóng)業(yè)有機(jī)肥的標(biāo)準(zhǔn),但是2組堆肥pH值的變化趨勢(shì)有所不同(圖2C)。以上結(jié)果表明,接種微生物菌劑明顯促進(jìn)了雞糞-生物炭堆肥堆體的溫度、水分和pH值的變化,有利于堆肥堆體的腐熟。

A:溫度;B:含水率;C:pH值。圖2 菌劑對(duì)堆肥堆體溫度、含水率及pH值的影響Fig.2 Effects of microbial agents on composting temperature, moisture content and pH

2.1.3 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中總有機(jī)質(zhì)、全氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量的影響 堆肥的腐熟本質(zhì)上是微生物對(duì)物料中的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行降解轉(zhuǎn)化的過(guò)程[8]。有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果表明,物料中總有機(jī)質(zhì)的平均初始含量為383.70 g/kg,隨著堆肥堆制過(guò)程的推進(jìn),處理組和對(duì)照有機(jī)質(zhì)含量整體均呈下降趨勢(shì),在堆肥堆制第53 d,對(duì)照和處理組的總有機(jī)質(zhì)含量分別比堆肥初期降低了18.9%(72.60 g/kg)和38.8%(148.90 g/kg)(圖3A)。全氮含量測(cè)定結(jié)果表明,平均初始全氮含量為21.50 g/kg,隨著堆肥堆制過(guò)程的推進(jìn),處理組與對(duì)照的全氮含量均呈上升趨勢(shì),在堆肥堆制第53 d,對(duì)照和處理組全氮含量分別增加了36.05%(7.75 g/kg)和64.05%(13.77 g/kg)(圖3B)。銨態(tài)氮含量測(cè)定結(jié)果表明,銨態(tài)氮的平均初始含量為186.20 mg/kg,在堆肥堆制過(guò)程中,處理組的銨態(tài)氮含量始終低于對(duì)照,在堆肥堆制第53 d,對(duì)照和處理組的銨態(tài)氮含量分別比堆肥初期降低了30.5%(56.70 mg/kg)和50.8%(94.53 mg/kg)(圖3C)。以上結(jié)果表明,菌劑能極大促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解,增加堆肥堆體的全氮含量,減少堆肥堆體中的銨態(tài)氮含量,從而產(chǎn)生明顯的保氮效果。

A:總有機(jī)質(zhì)含量;B:全氮含量;C:銨態(tài)氮含量。圖3 菌劑對(duì)堆肥堆體中總有機(jī)質(zhì)、全氮及銨態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of microbial agents on the contents of total organic matter, total nitrogen and ammonium nitrogen in compost

有效磷含量測(cè)定結(jié)果表明,物料中的有效磷初始含量為71.00 mg/kg,在堆肥堆制過(guò)程中,處理組的有效磷含量始終高于對(duì)照(圖4A)。在堆肥堆制第53 d,對(duì)照和處理組的有效磷含量分別比堆肥初期增加了16.5%(11.75 mg/kg)和38.6%(27.45 mg/kg)。速效鉀含量測(cè)定結(jié)果表明,物料中的速效鉀初始含量為224.10 mg/kg,其在堆肥堆制過(guò)程中的變化趨勢(shì)與有效磷含量相似,在堆肥堆制第53 d,對(duì)照和處理組的速效鉀含量分別比堆肥初期增加35.1%(78.74 mg/kg)和57.6%(129.14 mg/kg)(圖4B)。由此可見(jiàn),菌劑能夠促使物料中的磷元素、鉀元素向更易被植物吸收的可利用態(tài)轉(zhuǎn)變。

A:有效磷含量;B:速效鉀含量。圖4 菌劑對(duì)堆肥堆體中有效磷、速效鉀含量的影響Fig.4 Effects of microbial agents on the content of available phosphorus and available potassium in compost

2.2 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中細(xì)菌、真菌群落多樣性的影響

高通量測(cè)序結(jié)果顯示,不同樣品產(chǎn)生的細(xì)菌高質(zhì)量序列數(shù)為45 189～56 038條,這些序列聚類為377～632個(gè)分類操作單元(Operational taxonomic unit,OTU);真菌高質(zhì)量序列數(shù)為55 390～73 234條,這些序列聚類為128～637個(gè)OTU。處理組細(xì)菌OTU數(shù)量和Shannon指數(shù)在各個(gè)時(shí)期均明顯高于對(duì)照,而真菌的相應(yīng)數(shù)值總體上表現(xiàn)出相反趨勢(shì)(表1)。上述結(jié)果表明,菌劑促進(jìn)了堆肥堆制過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。

表1 高溫堆肥堆體樣品中細(xì)菌、真菌的豐度與多樣性

2.2.1 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中細(xì)菌群落組成的影響 如圖5所示,在門(mén)水平上,對(duì)照中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌的相對(duì)豐度維持在80.0%以上,為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén),放線菌門(mén)(Actinobacteria)細(xì)菌的相對(duì)豐度在堆肥堆制后期(第53 d)明顯提高,達(dá)到16.00%。處理組中,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在堆肥堆制前30 d仍為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén),相對(duì)豐度>78.00%,但是放線菌門(mén)(Actinobacteria)細(xì)菌的相對(duì)豐度在堆肥堆制后期(第53 d)提高到66.40%,取代厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌成為最豐富的細(xì)菌門(mén)細(xì)菌,變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)細(xì)菌的相對(duì)豐度也明顯提高,分別達(dá)到為4.80%、10.00%和6.00%。

CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對(duì)照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制時(shí)間為14 d、30 d、53 d。Firmicutes:厚壁菌門(mén);Actinobacteria:放線菌門(mén);Proteobacteria:變形菌門(mén);Bacteroidetes:擬桿菌門(mén);Chloroflexi:綠彎菌門(mén);Others:其他。圖5 門(mén)水平上細(xì)菌群落組成Fig.5 Composition of bacterial community at phylum level

如圖6所示,在堆肥堆制第14 d,在屬水平上,對(duì)照細(xì)菌相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)屬主要為櫻桃樣芽孢桿菌(Cerasibacillus)、未分類芽孢桿菌(Unclassified-f-Bacillaceae)、假纖細(xì)芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)和肉桿菌(Atopostipes)等。隨著堆肥堆制過(guò)程的進(jìn)行,上述屬細(xì)菌的相對(duì)豐度不斷發(fā)生變化,如肉桿菌(Atopostipes)的相對(duì)豐度明顯降低,櫻桃樣芽孢桿菌、未分類芽孢桿菌的相對(duì)豐度先升后降,在堆肥堆制第53 d接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細(xì)芽孢桿菌的相對(duì)豐度先降后升,在堆肥堆制第53 d,相對(duì)豐度分別高達(dá)33.23%、10.75%。在堆肥堆制第14 d,處理組相對(duì)豐度大于1.00%的優(yōu)勢(shì)菌屬(10個(gè))與對(duì)照(8個(gè))有高度的相似性(7個(gè)一致),但是相對(duì)豐度存在顯著差異,如櫻桃樣芽孢桿菌、假纖細(xì)芽孢桿菌在處理組的相對(duì)豐度分別為3.20%、22.17%,但在對(duì)照中的相對(duì)豐度分別為22.12%、11.40%。隨著堆肥堆制過(guò)程的推進(jìn),處理組與對(duì)照中相對(duì)豐度大于1.00%的共有屬的組成成員逐漸減少,在堆肥堆制第53 d,處理組只有5個(gè)相對(duì)豐度大于1.00%的屬與對(duì)照相同,并且這些屬的相對(duì)豐度均低于4.00%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),處理組中糖霉菌(Glycomyces)、阮繼生氏菌(Ruania)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)的相對(duì)豐度較高,分別為8.00%、13.39%、16.46%,而對(duì)照中這3個(gè)細(xì)菌的相對(duì)豐度則接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細(xì)芽孢桿菌、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)、海洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。由此可見(jiàn),在屬水平上,處理組和對(duì)照的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在堆肥堆制進(jìn)程中的變化有明顯差異。

A:第14 d相對(duì)豐度差異顯著的細(xì)菌屬;B:第30 d相對(duì)豐度差異顯著的細(xì)菌屬;C:第53 d相對(duì)豐度差異顯著的細(xì)菌屬。CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對(duì)照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制時(shí)間為14 d、30 d、53 d。Pseudogracilibacillus:假纖細(xì)芽孢桿菌;Cerasibacillus:櫻桃樣芽孢桿菌;Unclassified-f-Bacillaceae:未分類芽孢桿菌; Bacillus:芽孢桿菌;Bhargavaea:布哈加瓦氏菌;Atopostipes:肉桿菌;Oceanobacillus:海洋芽孢桿菌;Thermobifida:高溫雙歧菌屬;Amphibacillus:雙芽孢桿菌屬;Saccharomonospora:糖單胞菌屬;Tepidimicrobium:熱微菌屬;Planifilum:直絲菌屬;Streptomyces:鏈霉菌屬;Corynebacterium_1:棒狀桿菌_1;Glycomyces:糖霉菌;Ruania:阮繼生氏菌;Gracilibacillus:薄壁芽孢桿菌屬;Unlassified-f-Micrococcaceae:未分類的微球菌科成員;Virgibacillus:枝芽孢桿菌屬;Salinicoccus:鹽水球菌屬;Brachybacterium:短狀桿菌屬;Georgenia:喬治菌屬;Brevibacterium:短桿菌屬;Norank-f-Bacillaceae:未明確屬的芽孢桿菌科成員。 圖6 屬水平上細(xì)菌相對(duì)豐度有顯著差異的群落Fig.6 Communities with significant differences in relative abundance of bacteria at the genus level

2.2.2 菌劑對(duì)堆肥堆制過(guò)程中真菌群落組成的影響 如圖7所示,在門(mén)水平上,子囊菌門(mén)(Ascomycota)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)、未分類真菌門(mén)(Unclassified-Fungi)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)為所有樣品中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),尤其是Ascomycota占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位,其在各樣品中的相對(duì)豐度為57.73%～98.76%。此外,對(duì)照樣品中Ascomycota的相對(duì)豐度在堆肥堆制第30 d、53 d分別為59.24%、74.14%,明顯低于其在處理組第30 d的相對(duì)豐度(69.94%)和第53 d的相對(duì)豐度(98.76%)。

如圖8所示,在屬水平上,在堆制第14 d的堆肥樣品中,對(duì)照、處理組中相對(duì)豐度>1.00%的屬均包含被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)、念珠菌(Diutina)、籃狀菌(Talaromyces) 和鐮刀霉(Fusarium)等,但被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)在處理組中的相對(duì)豐度均高于對(duì)照,而籃狀菌屬(Talaromyces)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)則相反。隨著堆肥堆制進(jìn)程的推進(jìn),被孢霉(Mortierlla)、念珠菌(Diutina)、籃狀菌(Talaromyces)和鐮刀霉(Fusarium)的相對(duì)豐度在對(duì)照中均出現(xiàn)顯著下降,在堆肥堆制第53 d均低于5.00%;毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)的相對(duì)豐度則顯著上升,在堆肥堆制第53 d達(dá)到6.90%;德巴利氏酵母(Debaryomyces)的相對(duì)豐度先下降后上升,在堆肥堆制第53 d達(dá)到13.45%。在處理組中,盡管上述菌的相對(duì)豐度隨著堆肥堆制進(jìn)程的推進(jìn)也表現(xiàn)出浮動(dòng),但是枝頂孢霉(Acremonium)在處理組中的相對(duì)豐度變化最為明顯,呈現(xiàn)連續(xù)升高的趨勢(shì),在堆肥堆制第53 d高達(dá)94.9%,成為處理組真菌群落中的絕對(duì)主導(dǎo),其他菌的相對(duì)豐度均低于1.00%,而對(duì)照中枝頂孢霉(Acremonium)的相對(duì)豐度則一直處于較低水平。因此可見(jiàn),真菌群落成員的相對(duì)豐度在處理組和對(duì)照中表現(xiàn)出明顯差異。

A:堆肥堆制第14 d相對(duì)豐度差異顯著的真菌屬;B:堆肥堆制第30 d相對(duì)豐度差異顯著的真菌屬;C.堆肥堆制第53 d相對(duì)豐度差異顯著的真菌屬。CS代表雞糞和生物炭的起始混合樣品,C表示對(duì)照,T表示處理組,14、30、53分別代表堆肥堆制的第14 d、30 d、53 d。 Mortierella:被孢霉;Diutina:念珠菌;Debaryomyces:德巴利氏酵母;Talaromyces:籃狀菌; Trichoderma:木霉;Fusarium:鐮刀霉;Aspergillus:曲霉;Cutaneotrichosporon:毛孢子菌;Wallemia:節(jié)擔(dān)菌屬;Guehomyces:耐冷酵母屬;Plectosphaerella:小不整球殼屬;Metarhizium:綠僵菌屬;Penicillium:青霉屬;Acremonium:枝頂孢霉;Dichotomopilus:二分枝毛殼屬;Dipodascus:雙足囊菌屬;Saitozyma:沙蜥屬;Acaulium:無(wú)莖真菌屬;Acrostalagmus:筍頂孢屬;Melanocarpus:黑果球粉衣屬。圖8 屬水平的真菌相對(duì)豐度存在顯著差異的物種Fig.8 Species with significant differences in relative abundance of fungi at genus level

2.3 菌劑處理的堆肥促進(jìn)上海青種子萌發(fā)和根生長(zhǎng)的效果

在菌劑處理的堆肥浸提液培養(yǎng)下,上海青種子的萌發(fā)結(jié)果如圖9所示,可以看出,處理組種子培養(yǎng)48 h的萌發(fā)率(91.60%)高于對(duì)照(83.30%),其平均根長(zhǎng)(1.59 cm)是對(duì)照(1.25 cm)的1.27倍。因此可見(jiàn),菌劑處理的堆肥有效刺激了種子萌發(fā)和根生長(zhǎng),對(duì)植物生長(zhǎng)有潛在促進(jìn)作用。

A:不同時(shí)間點(diǎn)的根長(zhǎng);B:培養(yǎng)第48 h的發(fā)芽率;C:培養(yǎng)第48 h的根長(zhǎng)。圖9 菌劑處理的堆肥對(duì)上海青種子萌發(fā)率和根長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of the compost treated with microbial agents on seed germination rate and root length of Brassica rapa var. chinensis (Linnaeus) Kitamura

3 討 論

高溫堆制是實(shí)現(xiàn)禽畜糞便資源化、無(wú)害化的重要手段,但是傳統(tǒng)的高溫堆制往往存在周期長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)流失多等問(wèn)題[2]。接種微生物菌劑能夠直接影響堆體中的微生物組成,從而有效促進(jìn)堆肥腐熟,克服傳統(tǒng)高溫堆制的缺點(diǎn)。因此,開(kāi)發(fā)高效腐熟菌劑,深入探討其微生物學(xué)機(jī)制就顯得尤為重要。

相關(guān)研究結(jié)果表明,堆肥是否腐熟不能用單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[24]。因此,本研究首先綜合評(píng)價(jià)菌劑對(duì)雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中多個(gè)腐熟指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示,菌劑顯著促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中溫度、含水率、pH值的變化和臭味的去除,并縮短腐熟時(shí)間,而且菌劑處理的堆肥最終全氮、有效磷和速效鉀含量均高于對(duì)照。本研究結(jié)果也得到了其他研究結(jié)果的間接支持。例如,Xu等[25]研究發(fā)現(xiàn),由部分高溫和中溫微生物組成的菌劑可使牛糞-秸稈堆肥中的氨氣釋放量減少29.98%～46.94%;Li等[26]研究發(fā)現(xiàn),由枯草芽孢桿菌等菌種組成的菌劑延長(zhǎng)了豬糞-玉米芯堆肥的高溫時(shí)間,使堆肥中的硝態(tài)氮含量比對(duì)照高21 g/kg。盡管本研究中所用菌劑能高效促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥堆體腐熟,但是在中國(guó),豬、牛、禽、羊的糞污產(chǎn)生量分別占畜禽糞污總產(chǎn)量的33.9%、48.3%、4.7%、13.1%[27]。因此,本研究中所用菌劑能否在其他禽畜糞便堆肥中廣泛應(yīng)用值得進(jìn)一步探討。

微生物群落是影響堆肥腐熟的核心因素[28-31],本研究結(jié)果表明,外加菌劑能高效促進(jìn)堆肥堆制過(guò)程中微生物群落的變化。與對(duì)照相比,菌劑處理堆肥中的一些門(mén)如放線菌門(mén)(Actinobacteria)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)的相對(duì)豐度顯著升高,可能由于菌劑處理的堆肥提前進(jìn)入腐熟期,為這些微生物生長(zhǎng)提供了良好的環(huán)境條件[32]。屬水平的分析結(jié)果表明,菌劑可能從2個(gè)方面促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥中微生物群落的演替。一方面,接種菌劑提高了與有機(jī)質(zhì)降解、同化相關(guān)微生物[如假纖細(xì)芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、直絲菌(Planifilum)[33-34])]的相對(duì)豐度,同時(shí)降低了與碳氮損失相關(guān)微生物[如櫻桃樣芽孢桿菌(Cerasibacillus)、肉桿菌(Atopostipes)[35-36]]的相對(duì)豐度。上述結(jié)果與菌劑促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥中總有機(jī)質(zhì)含量減少和全氮含量增加的結(jié)果相呼應(yīng)。另一方面,菌劑促進(jìn)了生防真菌的生長(zhǎng)。例如,枝頂孢霉(Acremonium)中的成員如Acremoniumsp. Ld-03能夠抑制病原真菌鐮刀霉(Fusarium)的生長(zhǎng),可能通過(guò)產(chǎn)生多種肽類和環(huán)肽類抗生素實(shí)現(xiàn)[37-38]。在本研究中,枝頂孢霉(Acremonium)在處理組堆肥堆制進(jìn)程中相對(duì)豐度持續(xù)升高,最終高達(dá)94.9%。此外,菌劑處理能夠明顯降低一些潛在病原菌如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)[39]、鐮刀霉(Fusarium)的相對(duì)豐度。此外,在堆肥堆制第14 d、30 d,處理組堆肥中布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細(xì)芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)的相對(duì)豐度均顯著高于對(duì)照,然而在堆肥堆制第53 d,上述細(xì)菌在對(duì)照中的相對(duì)豐度卻顯著高于處理組。由此可見(jiàn),布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纖細(xì)芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢桿菌(Gracilibacillus)這3個(gè)菌在常規(guī)的雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中也會(huì)隨著堆肥堆制進(jìn)程的推進(jìn)而使相對(duì)豐度發(fā)生改變,但是接種菌劑則會(huì)加速這一過(guò)程。

綜上,接種微生物菌劑可能通過(guò)影響堆肥堆制過(guò)程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物的相對(duì)豐度、抑制病原微生物生長(zhǎng)、加速高溫堆肥堆制過(guò)程中微生物的演替等促進(jìn)堆肥理化性質(zhì)的變化,從而提高堆肥的腐熟速度和質(zhì)量。本研究結(jié)果為闡明微生物菌劑在高溫堆肥堆制過(guò)程中的微生物學(xué)機(jī)制及其應(yīng)用提供了參考,在下一步研究中,將對(duì)菌劑接入量、菌劑中各菌種比例對(duì)堆肥堆制進(jìn)程的影響及菌劑使用范圍進(jìn)行探究,以期開(kāi)發(fā)出更為高效的堆肥腐熟菌劑。

4 結(jié) 論

微生物菌劑能夠高效促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥過(guò)程中溫度、水分、pH值的變化和臭味的去除,增加堆肥中的總氮、有效磷鉀含量,減少堆肥中銨態(tài)氮含量,因此微生物菌劑能有效加快雞糞-生物炭堆肥的腐熟進(jìn)程,提高堆肥質(zhì)量。微生物菌劑能夠高效促進(jìn)雞糞-生物炭堆肥堆制過(guò)程中微生物群落的演替。在門(mén)水平上,菌劑能夠促使堆肥堆體中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌子囊菌門(mén)(Ascomycota)真菌的相對(duì)豐度明顯提高,而絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌由厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌變?yōu)榉啪€菌門(mén)(Actinobacteria)細(xì)菌;在屬水平上,菌劑能夠刺激堆肥堆體中具有強(qiáng)有機(jī)質(zhì)降解能力的假纖細(xì)芽孢桿菌(Pseudogracilibacillus)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)等和具有生防潛力的鏈霉菌(Streptomyces)、枝頂孢霉(Acremonium)等相對(duì)豐度提高,降低一些致病性真菌屬[如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)和鐮刀霉(Fusarium)]真菌的相對(duì)豐度。處理組堆肥有效刺激了上海青種子萌發(fā)和根生長(zhǎng),種子培養(yǎng)48 h后的萌發(fā)率、根長(zhǎng)分別達(dá)到91.60%、1.59 cm,均高于對(duì)照。