顏 旭,關(guān)舒會(huì),饒欽雄,張其才,陳珊珊,宋衛(wèi)國(guó)*

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,上海 201403)

壬基酚(Nonylphenol,NP)作為一種有毒的異生化合物,常被用作精細(xì)化工中間體,是壬基酚聚氧乙烯醚(Nonylphenol ethoxylates,NPEOs)的主要合成物和降解產(chǎn)物,還被用作制造清潔劑、農(nóng)藥助劑、樹脂穩(wěn)定劑、潤(rùn)滑油添加劑等[1-2]。 作為典型的內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)之一,NP 具有類雌激素活性和生物毒性[3]。 蔬菜可能是對(duì)人類有害的NP 的潛在來源。 根據(jù)任杰等[4]的研究,分析了從?？谑须S機(jī)抽取的5 種蔬菜,發(fā)現(xiàn)均有4-NP 檢出,白菜和油菜的檢出率為100%,含量為1.26—8.58 μg∕kg。 張濤等[5]抽取了長(zhǎng)沙市61 種市售蔬菜,檢測(cè)了4 種類雌激素含量,結(jié)果顯示壬基酚的檢出率最高,含量為4.92—90.96 ng∕g。 在蔬菜中已有NP 檢出,嚴(yán)重影響食品安全及消費(fèi)者健康。 因而,開發(fā)準(zhǔn)確、靈敏的食品中NP 檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

蔬菜中壬基酚的含量分析常采用固相萃取(Solid phase extraction,SPE)方法凈化,液相色譜(HPLC)或高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用測(cè)定[6]。 閆冬良等[7]建立了SPE-HPLC 方法,測(cè)定芹菜中4-壬基酚在內(nèi)的6 種環(huán)境雌激素,檢出限為3.7—6.3 μg∕L,平均加標(biāo)回收率在89.60%—97.13%。 She 等[8]通過石墨化炭黑串聯(lián)N-丙基乙二胺(PSA) 管固相萃取凈化,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法(HPLC-MS∕MS)測(cè)定了蔬菜中4-NP 在內(nèi)的NPEOs 及其殘留物含量,添加回收率為65%—118%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%—6.2%。 實(shí)際樣品檢測(cè)中,為了降低基質(zhì)效應(yīng),提高測(cè)定準(zhǔn)確性,減少對(duì)儀器損害,樣品前處理顯得至關(guān)重要[1,9]。 PSA 作為前處理中應(yīng)用廣泛的吸附材料,但不能被回收利用[10]。 相對(duì)成熟的新型吸附材料如碳納米管[11]、石墨烯[12]具有優(yōu)異的吸附性能,也被用于樣品的前處理凈化。 此外硅酸鹽類吸附劑來源廣泛、價(jià)格低廉[13]。 趙潔等[14]利用球磨法制備了多孔的硅酸鎂吸附材料,對(duì)水中亞甲基藍(lán)的最大吸附量為280 mg∕g。 通過一步水熱法引入硅酸鈉、和鎂鹽對(duì)天然凹凸棒進(jìn)行改性,對(duì)Cu2+和亞甲基藍(lán)的最大吸附量分別為527.22 mg∕g 和210.64 mg∕g[15]。 Navickiene 等[16]評(píng)估了硅酸鎂在分散固相萃取凈化,結(jié)合GC-MS∕MS 聯(lián)合測(cè)定啤酒中的15 種農(nóng)藥殘留的應(yīng)用,結(jié)果表明硅酸鎂是一種有效的替代凈化材料,方法具有準(zhǔn)確性、可靠性的同時(shí)降低了成本。 硅酸鹽類吸附劑在廢水中染料、重金屬吸附,前處理領(lǐng)域已被證實(shí)具有良好的性能,但是對(duì)壬基酚的應(yīng)用研究還未見報(bào)道。

本研究通過溶膠-凝膠法制備具有良好吸附性能、更具經(jīng)濟(jì)效益的新型硅酸鎂(MS-1∶6)作為固相萃取填料,優(yōu)化洗脫液和洗脫體積,考察重復(fù)利用性和對(duì)蔬菜中壬基酚的凈化效果,以期建立一種更具經(jīng)濟(jì)效益的蔬菜中4-NP 檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters 公司);AB 5500 型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)ABSCIEX 公司);MX-S 渦旋儀(美國(guó)賽洛捷克公司);萬分之一電子分析天平(上海Ohaus 公司);NEVAP-12 氮吹儀(美國(guó)Organomation 公司);CQ-250-DST 超聲波清洗器(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠);D-37520 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo 公司);蔬菜粉碎機(jī)(中山市歐麥斯電器有限公司);Ultra 系列超純水(上海首立實(shí)業(yè)有限公司);GM-0.1A 負(fù)壓抽濾裝置(天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

4-壬基酚(99%)、硝酸(AR)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;氨水、乙腈、丙酮、正己烷、甲醇(HPLC 級(jí),德國(guó)Merck 公司);氯化鈉(AR,上海愛彼化學(xué)試劑有限公司);九水硅酸鈉(GR)、氯化鎂(99%)、氫氧化鈉(96%)、鹽酸(AR)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;多層氧化石墨烯(GO 98%,上海源葉生物科技有限公司);氨基化多壁碳納米管(AMNCTs 95%,上海阿拉丁試劑有限公司);N-丙基乙二胺(PSA 40 μm,上海安捷倫科技有限公司)。 試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 4-NP 標(biāo)準(zhǔn)曲線和添加樣品制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5 000 mg∕L):準(zhǔn)確稱量0.50 g 4-NP 溶于50 mL 的棕色容量瓶,用甲醇充分溶解并定容。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(50 mg∕L):用甲醇稀釋4-NP 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)使用液(10 mg∕L):取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL 于50 mL 的棕色容量瓶,超純水定容,充分混勻。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別用乙腈和蔬菜基質(zhì)提取液將4-NP 稀釋成0.01 mg∕L、0.05 mg∕L、0.1 mg∕L、0.25 mg∕L、0.5 mg∕L 的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于-18 ℃冰箱中儲(chǔ)存,保質(zhì)期6 個(gè)月,其余溶液4 ℃冰箱中儲(chǔ)存,保質(zhì)期3 個(gè)月。 配制標(biāo)準(zhǔn)使用液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)保證甲醇處于較低含量( ＜2‰),以避免共溶劑效應(yīng)。

考慮到不同蔬菜基質(zhì)中的干擾物成分不同對(duì)殘留分析的影響,選取5 種具有代表性的蔬菜:白菜(十字花科植物)、四季豆(豆科植物)、生菜(菊科植物)、黃瓜(葫蘆科植物)、洋蔥(百合科植物),購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng),并進(jìn)行空白樣品4-NP 含量測(cè)定。 5 種蔬菜中加入適量中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加水平為10 μg∕kg、50 μg∕kg、100 μg∕kg,每組5 個(gè)重復(fù)。

1.3 吸附材料

1.3.1 溶膠-凝膠法制備硅酸鎂

硅酸鎂現(xiàn)用現(xiàn)制,具體方法為:在水浴持續(xù)攪拌下,通過向0.5 mol∕L 九水硅酸鈉溶液中相同濃度的氯化鎂溶液,控制鎂∕硅比例為1∶6。 混勻之后,用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH,在水浴條件下繼續(xù)攪拌2 h,放置陳化12 h,傾出上層溶液,用去離子水洗滌,去除雜質(zhì)和氯離子,烘箱60 ℃烘干,研磨,編號(hào)MS-1∶6,待用。

1.3.2 吸附性能考察

在25 ℃、35 ℃、45 ℃條件下,準(zhǔn)確稱取6 mg 的吸附材料,分別置于一組含有30 mL(10 mg∕L)4-NP 溶液的琥珀色玻璃瓶中,恒溫氣浴振蕩,間隔相應(yīng)時(shí)間取樣(0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min、240 min、300 min),使用0.22 μm 的濾膜分離吸附劑和吸附質(zhì)。 利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定吸附質(zhì)濃度,所有試驗(yàn)平行進(jìn)行3 次,每個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)由平均值獲得。 按照公式計(jì)算吸附量:

其中,qt(mg∕g)是t時(shí)每單位量吸附劑吸附的4-NP 的量,C0是4-NP 的初始濃度,Ce是t時(shí)4-NP 溶液的濃度,V是4-NP 溶液體積,m是吸附劑的投加量。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品的提取與凈化

提取方法參考張其才等[17],將蔬菜勻漿后,準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確到0.01 g)于50 mL 塑料離心管中,加入20 mL 乙腈,渦旋提取2 min,超聲提取10 min,加入氯化鈉5 g,振蕩1 min,于8 000 r∕min 下離心5 min;取上清液5 mL 于試管中,待凈化。

分別稱取200 mg 的MS-1∶6、GO、AMCNTs、PSA 均勻裝填入商品SPE 柱管(3 mL),自上而下分別是墊片、吸附劑、墊片。 5 mL 乙腈,5 mL 超純水負(fù)壓預(yù)淋洗SPE 柱。 將待凈化溶液上樣到SPE 柱,固相萃取儀負(fù)壓下以1 mL∕min 的流速通過SPE 柱,接收上樣液,另加入5 mL 乙腈洗脫,氮?dú)獯蹈?加入1 mL 乙腈復(fù)溶,過0.22 μm 有機(jī)濾膜轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中,外標(biāo)法定量測(cè)定。

1.4.2 儀器條件

色譜柱:Waters BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速0.35 mL∕min,流動(dòng)相A 相為甲醇,B 相為0.1%氨水。 梯度洗脫程序:0—2.0 min,30% A,70% B;2.0—5.5 min 95% A;5.5—6.0 min,30%A,70% B。 進(jìn)用量2 mL,柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧負(fù)離子源掃描(ESI -);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);離子化電壓5 kV;溫度500 ℃;噴霧氣55 μL∕min;氣簾氣35 μL∕min;4-NP 母離子為219.3 m∕z,定性離子對(duì)為133.0∕147 m∕z,定量離子為133.0 m∕z,碰撞能量為-38 eV∕-37 eV。

1.4.3 方法確定

主要包括:基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限、定量限及方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成硅酸鎂的吸附性能

為了考察MS-1∶6對(duì)4-NP 的吸附性能,建立吸附量(mg∕g)與時(shí)間的關(guān)系曲線,在25 ℃、35 ℃、45 ℃3 個(gè)溫度下進(jìn)行。 如圖1 所示,MS-1∶6表現(xiàn)出優(yōu)異的吸附性能,25 ℃下對(duì)4-NP 的最大吸附量為30.84 mg∕g。 隨著溫度的升高,4-NP 的吸附量逐漸降低,表明在較低溫度下有利于MS-1∶6對(duì)4-NP 的吸附,可以滿足常溫條件下對(duì)樣品的SPE 凈化要求。

圖1 溫度對(duì)4-NP 吸附量的影響Fig.1 Effect of temperature on adsorption of 4-NP

2.2 合成硅酸鎂SPE 柱凈化方法的優(yōu)化

為了得到最佳凈化結(jié)果,得到合適的洗脫溶劑。 以50 μg∕kg 乙腈溶液上樣,比較了10 mL 甲醇、乙腈、丙酮和正己烷∶丙酮(1 ∶9)4 種不同極性的有機(jī)溶劑洗脫效果,結(jié)果見圖2A,乙腈的平均回收率(103%)高于甲醇(76%)、丙酮(51.5%)和正己烷∶丙酮(1∶9)(42.6%)。 在此基礎(chǔ)上,選擇乙腈作為活化-洗脫溶劑。

圖2 洗脫溶劑(A)和用量(B)對(duì)4-NP 回收率的影響Fig.2 Effect of types of eluent(A) and volume of eluent(B) on the recovery of 4-NP

在50 μg∕kg 添加濃度下,比較了2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL 乙腈用量對(duì)4-NP 洗脫回收率的影響。 結(jié)果見圖2B,在洗脫液為2 mL 時(shí),平均回收率為60%,洗脫液為5 mL 時(shí),對(duì)4-NP 的回收率接近100%。 繼續(xù)增大洗脫液體積后,回收率也趨于穩(wěn)定。 從經(jīng)濟(jì)效果和減少氮吹時(shí)間的方面考慮,選取5 mL的乙腈用量進(jìn)行洗脫。

2.3 多種材料凈化效果的比較

作為凈化中常用的吸附材料,PSA 主要吸附方式為靜電吸附,氨基是主要吸附功能基[18];GO 具有高比表面積,豐富的表面含氧基團(tuán)等特點(diǎn),具有較好的吸附性能[19]。 凈化材料不同,凈化程度的強(qiáng)弱不同,從而影響回收率[20]。 因此,在上述優(yōu)化后的洗脫條件下,采用固相萃取作為前處理凈化方法,研究了MS-1∶6與現(xiàn)有商業(yè)吸附材料、N-丙基乙二胺(PSA)對(duì)4-NP 的基質(zhì)效應(yīng)的影響。 選用白菜作為代表基質(zhì),在50 μg∕kg 添加濃度下,對(duì)5 mL 乙腈提取液進(jìn)行凈化,結(jié)果見圖3A,經(jīng)過SPE 凈化后的平均回收率為GO(102.52%) ＞MS-1∶6(87.20%) ＞AMCNTs(85.10%) ＞PSA(79.60%)。 相比于其他材料,MS-1∶6在價(jià)格上更具明顯優(yōu)勢(shì)[PSA 56 元(人民幣,下同)∕g,GO 300 元∕g,AMCNTs 119.8 元∕g,MS-1∶6 0.2 元∕g]。 因此,新型MS-1∶6作為固相萃取柱填料進(jìn)行樣品4-NP 凈化,經(jīng)濟(jì)可行,但需要進(jìn)一步方法學(xué)考察。

圖3 4 種吸附材料凈化后4-NP 的基質(zhì)效應(yīng)(A)固相萃取小柱的循環(huán)使用(B)Fig.3 Matrix effect of 4-NP purified by four adsorption materials(A) and recycle of SPE cartridge(B)

2.4 固相萃取小柱循環(huán)使用

固相萃取柱的循環(huán)使用性是衡量材料應(yīng)用的重要指標(biāo)之一,選用白菜作為代表基質(zhì),在50 μg∕kg 的4-NP 添加濃度下,進(jìn)行重復(fù)吸附-解析循環(huán)6 次,考察所填充的小柱的可重復(fù)使用性能。 在最優(yōu)的條件下進(jìn)行吸附-洗脫,一個(gè)循環(huán)結(jié)束后,將小柱放于氮?dú)饬飨麓蹈?以減少試驗(yàn)誤差。 如圖3B 所示,在經(jīng)過6 次的重復(fù)使用后,回收率大于80%,在蔬菜中4-NP 的前處理中具有較好的應(yīng)用前景。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限與定量限

通過溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(msolvent)和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(mmatrix)來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)。ME=mmartix∕msolvent,基質(zhì)效應(yīng)為0.8—1.2 時(shí)可接受[17,21]。 本試驗(yàn)評(píng)估3 種蔬菜的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見表1。3 種蔬菜都表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)均小于0.8,因此本研究采用的是基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量。 在10—500 μg∕L 范圍內(nèi),質(zhì)量濃度與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)均不低于0.999。以3 倍信噪比(S∕N)作為4-NP 測(cè)定濃度的檢出限(LOD),以10 倍信噪比(S∕N)作為4-NP 測(cè)定濃度的定量限(LOQ)。 在白菜、生菜、洋蔥3 種基質(zhì)中的方法檢出限分別為0.6 μg∕kg、0.8 μg∕kg、0.6 μg∕kg,定量限為2 μg∕kg。

表1 3 種蔬菜中4-NP 的基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限和定量限Table 1 Matrix effect,linearity,LOD and LOQ of 4-NP in three vegetables

2.5.2 方法回收率和精密度

方法準(zhǔn)確性與精密度用回收率和變異系數(shù)衡量。 表2 結(jié)果顯示了最優(yōu)條件下4-NP 在5 種蔬菜基質(zhì)中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 在10 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為84.13%—103.42%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.54%—7.81%;在50 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為85.64%—106.56 %,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.41%—10.86 %;在100 μg∕kg 的添加水平下,5 種蔬菜中4-NP 回收率為94.36%—102.27%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%—7.13%。 綜上所述,4-NP 回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合食品中壬基酚測(cè)定的再現(xiàn)性要求。 該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性,滿足復(fù)雜樣品中痕量物質(zhì)的分析要求,能夠應(yīng)用于蔬菜中NP 的測(cè)定。

表2 4-NP 在5 種蔬菜中的平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Average addition recoveries and RSDs of 4-NP added to five vegetables(n=5) %

2.6 方法比對(duì)

將本研究與近年來已報(bào)道的對(duì)食品及食品包裝材料的檢測(cè)方法進(jìn)行比較,結(jié)果見表3。 本方法溶劑消耗量低于常規(guī)檢測(cè)方法,節(jié)省了檢測(cè)成本。 無需內(nèi)標(biāo),無需衍生化處理,方法簡(jiǎn)單,易操作。 采用負(fù)壓下SPE 凈化,減少了前處理時(shí)間。 檢出限與其他液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限相近,低于其他檢測(cè)方法,表明該方法具有較高靈敏度,可以滿足蔬菜等低脂肪含量食品中的4-NP 測(cè)定。

表3 本研究與已報(bào)道的方法比較Table 3 This study compared with other reported method

3 結(jié)論與討論

本研究合成一種硅酸鎂吸附材料,采用負(fù)壓SPE 凈化模式,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析,建立了蔬菜中4-NP 的檢測(cè)方法。 對(duì)4-NP 具有較好的吸附效果,凈化效果優(yōu)于傳統(tǒng)凈化材料(PSA),略高于AMCNTs,低于GO。 具有較高成本優(yōu)勢(shì),為GO 的1∕1 500,AMCNTs 的1∕600,PSA 的1∕280。 5 種蔬菜中4-NP 回收率為88.63%—106.82%,RSD 為1.5%—10.86%,檢出限為0.6—0.8 μg∕kg,定量限為2 μg∕kg,滿足蔬菜中壬基酚的測(cè)定要求。

黃榮榮等[28]在樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)后,經(jīng)Carb∕NH2固相萃取柱凈化,平均回收率為87.9%—98.0%。 馬啟明等[29]采用凝膠滲透色譜柱(GPC)凈化,收集14—17 min 組分旋轉(zhuǎn)蒸干,對(duì)奶粉中4-NP回收率為87.3%—96.5%,本流程較為簡(jiǎn)單,減少溶劑消耗,并且回收率較高。 本研究建立MS-1∶6固相萃取凈化方法對(duì)蔬菜中4-NP 檢測(cè)具有較高回收率,提高效率,并且減少溶劑的使用,方法靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,具有廣泛的應(yīng)用前景。