梁董茜 ，王晶晶 ，王 欣 ，柴天川 ，李春花 ，4，5#（.河北中醫(yī)藥大學藥學院，石家莊 05000；.保定市第一中醫(yī)院腦病科，河北 保定 07000；.河北省中醫(yī)院制劑室，石家莊 0500；4.河北省中藥組方制劑技術創(chuàng)新中心，石家莊 05009；5.河北省高校中藥開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應用技術研發(fā)中心，石家莊 05009）

麻杏咳喘方是河北省中醫(yī)院治療“風溫肺熱病”“哮病”等疾病的經(jīng)驗方，臨床使用近20年，療效確切。該方由蜜麻黃、炒苦杏仁、蟬蛻、地龍、陳皮、防風、矮地茶、桑白皮、清半夏、厚樸、穿山龍、僵蠶、甘草組成，具有疏風宣肺、止咳平喘之效，主要用于治療風邪犯肺、肺氣失宣所致的咳嗽、咽癢、干咳無痰或少痰等。方中蜜麻黃宣肺平喘，炒苦杏仁潤肺止咳，二者共為君藥；蟬蛻疏散風熱，地龍清熱息風平喘，二者均為臣藥；陳皮、厚樸理氣止咳化痰，防風祛風解表，矮地茶化痰止咳，清半夏、桑白皮清肺化痰，穿山龍止咳平喘，僵蠶祛痰止咳，同為佐藥；甘草調和諸藥為使藥。該方為傳統(tǒng)中藥湯劑，需臨用前進行煎煮，質量不易控制，且煎液體積較大、服用不便、不利貯存，故本研究團隊擬將其開發(fā)為顆粒劑，以便臨床使用。

Box-Behnken響應面法是對實驗條件多個因素及水平進行分析的優(yōu)選方法，具有實驗次數(shù)少、結果準確度高等特點[1]；層次分析（analytic hierarchy process，AHP）-熵權法是對各指標進行賦權的方法，兼具AHP 法、熵權法的優(yōu)點，使所得結果更加真實可靠[2]。本研究以浸泡時間、加水量、總提取時間為考察因素，以蜜麻黃的有效成分鹽酸麻黃堿[3]、矮地茶的有效成分巖白菜素[4]、防風的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷[5]、陳皮的有效成分柚皮苷和橙皮苷[6—7]的含量以及出膏率為考察指標，采用AHP-熵權法對上述7 種指標進行賦權，通過Box-Behnken響應面法篩選出麻杏咳喘顆粒的最佳水提工藝，以期為麻杏咳喘顆粒的開發(fā)及應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

LC-20A型高效液相色譜儀購自日本Shimadzu公司（包括LC-20AT 泵、SIL-20A 自動進樣器、SPD-M20A 紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱）；SQP型十萬分之一電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TG328B 型萬分之一分析天平購自上海精密科學儀器有限公司；TGL-16B 型離心機購自上海安亭科學儀器廠；RE-52 型旋轉薄膜蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠；SAS67120型超純水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；BGG-9240A 型鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

蜜麻黃（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號211201）、炒苦杏仁（產(chǎn)地河北，批號220501）、蟬蛻（產(chǎn)地河北，批號220502）、陳皮（產(chǎn)地浙江，批號21103001）、防風（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號220501）、桑白皮（產(chǎn)地四川，批號220201）、清半夏（產(chǎn)地河北，批號D211201）、厚樸（產(chǎn)地四川，批號220501）、穿山龍（產(chǎn)地河北，批號220301）、僵蠶（產(chǎn)地四川，批號220501）、甘草（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號220301）均購于河北藥興藥業(yè)有限公司，地龍（產(chǎn)地廣東，批號21103001）、矮地茶（產(chǎn)地河北，批號18032601）購于國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司，以上飲片經(jīng)檢查均符合2020年版《中國藥典》（一部）項下相關規(guī)定。鹽酸麻黃堿（批號171241-201809，純度100.0%）、巖白菜素（批號111532-202005，純度94.4%）、升麻素苷（批號111522-202214，純度95.7%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-202212，純度97.8%）、柚皮苷（批號110722-202116，純度93.5%）、橙皮苷（批號110721-202220，純度97.2%）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結果

2.1 指標成分的含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Venusil MP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，10%A→16%A；12～44 min，16%A→24%A；44～55 min，24%A→35%A；55～60 min，35%A→90%A）；柱溫為30 ℃；檢測波長分別為210 nm（鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、柚皮苷）、283 nm（5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷）；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取各味飲片共59.5 g，加10倍量（mL/g）水浸泡30 min，煎煮2 h；過濾煎液，離心，取上清液減壓濃縮至119 mL，得濃縮液。取2 mL 濃縮液置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。同法制得分別缺蜜麻黃、矮地茶、防風、陳皮的陰性樣品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備

精密稱定鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解后定容，制得上述成分質量濃度分別為1.870 0、0.726 0、0.590 0、1.020 0、0.232 0、2.140 0 mg/mL的單一對照品母液。吸取各對照品母液1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.1.4 方法學考察

（1）專屬性考察：取上述供試品溶液、各陰性樣品溶液、混合對照品溶液、甲醇溶液（空白）適量，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。結果顯示，甲醇溶液無干擾，混合對照品溶液和供試品溶液中各指標成分的分離度均大于1.5，專屬性良好。結果見圖1。

圖1 專屬性考察結果的色譜圖

（2）線性關系考察：取“2.1.3”項下混合對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，得各成分不同質量濃度的對照品溶液，按上述色譜條件進樣分析，以質量濃度為橫坐標（x）、以峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結果見表1。

表1 各指標成分的線性關系考察結果

（3）精密度試驗：取“2.1.3”項下混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為2.06%、2.42%、2.70%、1.56%、1.95%、0.69%（n＝6），表明儀器精密度良好。

（4）重復性試驗：按“2.1.2”項下制備方法，平行制備供試品溶液6份，按上述色譜條件進樣，記錄峰面積，根據(jù)外標法計算各成分含量，得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量的RSD 分別為1.73%、2.28%、1.82%、1.56%、0.62%、2.61%（n＝6），表明該方法重復性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，于室溫放置0、4、8、12、16、24 h 時，分別按上述色譜條件進樣，記錄峰面積，得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.04%、2.01%、2.76%、1.89%、1.42%、1.47%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗：取已知各成分含量的濃縮液1 mL，共6 份，精密加入與各成分含量成1∶1（m/m）比例的鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷對照品各適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果顯示，鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷的平均加樣回收率分別為101.54%、100.73%、101.80%、97.47%、98.86%、101.67%，RSD 分別為2.46%、2.38%、1.62%、1.52%、1.25%、2.39%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.2 出膏率的測定

精密量取濃縮液適量，置于干燥、恒重的蒸發(fā)皿中，采用烘箱于105 ℃下干燥至恒重；取出，放入干燥器中冷卻30 min，稱重，采用減重法計算出膏率[8]。

2.3 綜合評分相關指標的權重確定

2.3.1 AHP法主觀賦權

采用AHP 法對設定的各項指標進行主觀賦權[2]，根據(jù)麻杏咳喘顆粒處方中各味藥的君臣佐使關系及用量，對各指標進行層次劃分，順序為鹽酸麻黃堿＝巖白菜素＞橙皮苷＝柚皮苷＞升麻素苷＝5-O-甲基維斯阿米醇苷＞出膏率，由此構建優(yōu)先判斷矩陣，見表2。計算得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷、出膏率的主觀權重系數(shù)W1分別為0.250 8、0.250 8、0.084 6、0.084 6、0.145 5、0.145 5、0.038 1，一致性比率為0.009 1（＜0.10），表明所計算的指標權重系數(shù)可靠、有效。

表2 各指標的優(yōu)先判斷矩陣

2.3.2 熵權法客觀賦權

采用熵權法對設定的各項指標進行客觀賦權[2]，運用極值法無量綱化處理所得數(shù)據(jù)，以熵值法確定各指標權重系數(shù)（W2）。原始數(shù)據(jù)矩陣為X＝（Xij）mn，其中Xij為正指標，使用公式對已知數(shù)據(jù)進行處理，得標準化數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)均向右平移0.000 01 個單位以消除0 的影響。采用公式Hj=計算各指標熵值（0≤Hj≤1，Pij=為概率矩陣）。采用公式計算各指標客觀權重系數(shù)。

2.3.3 綜合權重系數(shù)確定及綜合評分計算

將AHP法、熵權法確定的各指標權重系數(shù)W1、W2相結合，計算綜合權重系數(shù)（W綜合）：W綜合=[2]。將各指標的W綜合代入公式，計算綜合評分，綜合評分＝100×（鹽酸麻黃堿含量/鹽酸麻黃堿含量最大值×鹽酸麻黃堿的W綜合+巖白菜素含量/巖白菜素含量最大值×巖白菜素的W綜合+升麻素苷含量/升麻素苷含量最大值×升麻素苷的W綜合+5-O-甲基維斯阿米醇苷含量/5-O-甲基維斯阿米醇苷含量最大值×5-O-甲基維斯阿米醇苷的W綜合+柚皮苷含量/柚皮苷含量最大值×柚皮苷的W綜合+橙皮苷含量/橙皮苷含量最大值×橙皮苷的W綜合+出膏率/出膏率最大值×出膏率的W綜合）。

2.4 麻杏咳喘顆粒水提工藝參數(shù)的單因素實驗

本研究考察了浸泡時間、加水量、總提取時間、提取次數(shù)4個因素對提取效果的影響[8]。按“2.3”項下方法計算鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷和出膏率的綜合權重，發(fā)現(xiàn)當考察因素為浸泡時間時，各指標的W綜合分別為0.205 4、0.233 5、0.073 0、0.101 4、0.208 0、0.146 4、0.032 2；考察因素為加水量時，各指標的W綜合分別為0.235 5、0.258 6、0.079 5、0.094 8、0.118 7、0.179 0、0.033 9；考察因素為總提取時間時，各指標的W綜合分別為0.198 7、0.200 6、0.077 1、0.096 9、0.240 1、0.149 5、0.037 1；考察因素為提取次數(shù)時，各指標的W綜合分別為0.246 1、0.269 0、0.070 7、0.086 0、0.140 1、0.145 5、0.042 7。以7項指標的綜合評分作為指標，在固定其他3個條件不變的前提下，分別對浸泡時間（0、30、60、90 min）、加水量（6、7、8、9、10 倍）、總提取時間（90、150、210、270、330 min）、提取次數(shù)（1、2、3 次）進行單因素考察，各平行3次。結果見圖2。

圖2 麻杏咳喘顆粒提取工藝參數(shù)的單因素考察結果

由圖2可知，圖2A的曲線呈上升-平穩(wěn)趨勢，圖2B、圖2C的曲線均呈上升-下降趨勢；由于提取次數(shù)為不連續(xù)因素，故不作為Box-Behnken 響應面實驗的考察因素。另外，圖2D 中曲線呈上升趨勢，提取次數(shù)為2、3 次時的綜合評分分別為88.95、90.82 分，數(shù)值差距小，且差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.450），故固定提取次數(shù)為2 次。因此，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)及生產(chǎn)實際，選取浸泡時間30 min、加水量8倍、總提取時間150 min作為Box-Behnken響應面實驗優(yōu)化的中心點。

2.5 Box-Behnken 響應面法優(yōu)化麻杏咳喘顆粒的水提工藝

2.5.1 Box-Behnken響應面實驗設計

參照單因素實驗結果，應用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行Box-Behnken 響應面實驗設計[1]，固定提取次數(shù)為2 次，以綜合評分為響應值，考察浸泡時間（A）、加水量（B）、總提取時間（C）對水提工藝的影響。具體因素與水平見表3。

表3 因素與水平表

2.5.2 Box-Behnken響應面實驗方案及結果

按“2.3.2”項下方法計算得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的熵值分別為0.889 1、0.911 9、0.921 9、0.908 0、0.913 8、0.909 6、0.917 0；客觀權重系數(shù)W2分別為0.176 4、0.140 2、0.124 3、0.146 3、0.137 1、0.143 8、0.132 0。AHP法所得主觀權重系數(shù)W1不變，以AHP-熵權法綜合賦權計算得鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的W綜合分別為0.298 5、0.237 2、0.071 0、0.083 6、0.134 6、0.141 2、0.033 9。按“2.3.3”項下公式計算不同Box-Behnken響應面實驗方案所得綜合評分，結果見表4。

表4 Box-Behnken響應面實驗方案及結果

2.5.3 Box-Behnken響應面實驗結果分析

采用Design-Expert V8.0.6.1軟件多元擬合分析17組實驗所得綜合評分，得多元二次回歸方程：綜合評分＝92.99+1.77A+3.23B+3.59C+1.87AB+0.4AC－1.09BC－5.58A2－4.93B2－3.17C2。方差分析結果見表5。

表5 Box-Behnken響應面實驗的方差分析結果

由表5可知，擬合模型的P值為0.004 3（＜0.01），表明模型顯著；失擬項的P值為0.133 1（＞0.05），表明失擬不顯著，提示其他未明原因對實驗結果影響較小，模型可靠。R2、Radj2分別為0.919 8、0.816 8，表明81.68%的響應值變化可被模型解釋；r為0.919 8，表明所選變量可造成91.98%的響應值變化。變異系數(shù)為2.99%（＜10%），表明實驗重復性、模型擬合度均良好。由此可知，該模型可用于分析并預測麻杏咳喘顆粒的水提工藝。一次項A為不顯著影響，B、C為顯著影響，3個因素對綜合評分的影響程度依次為C＞B＞A，即總提取時間＞加水量＞浸泡時間；交互項的影響均不顯著；二次項A2、B2、C2均為顯著影響。

經(jīng)軟件處理數(shù)據(jù)后，得到反映因素間交互強弱的等高線圖和響應面圖，具體見圖3。等高線圖中閉合曲線形狀越趨向于正圓形時交互作用越弱，閉合曲線越趨向于橢圓形時交互作用越強；響應面圖中曲面越陡、坡度越大，則因素間交互作用對綜合評分的影響越大。由圖3A可知，閉合曲線為更接近于圓形的橢圓形，曲面坡度變化較小，表明綜合評分變化不明顯，AB交互作用不顯著；由圖3B 可知，橢圓形閉合曲線更接近于圓形，曲面坡度變化小，表明綜合評分變化不明顯，AC交互作用不顯著；由圖3C 可知，閉合曲線接近于圓形，曲面坡度變化較小，表明綜合評分變化不明顯，BC交互作用不顯著。將響應面圖中的曲面坡度變化進行比較后發(fā)現(xiàn)，圖3A 中B曲面比A曲面坡度變化大，圖3B 中C曲面較陡峭，圖3C中C曲面較B曲面更陡峭，由此可知，3個因素對綜合評分的影響程度與方差分析結果相同。

圖3 各因素對麻杏咳喘顆粒水提工藝綜合評分的影響

進一步利用軟件預測麻杏咳喘顆粒的最佳水提工藝參數(shù)為：浸泡時間36.93 min，加水量8.31倍，總提取時間181.65 min。結合實際生產(chǎn)操作的可行性，將參數(shù)調整為：浸泡時間40 min，加水量8倍，總提取時間180 min（即第1次提取120 min，第2次提取60 min）。

2.5.4 工藝驗證

按比例稱取處方飲片119 g，平行3 份，按上述最佳預測工藝進行驗證實驗，得綜合評分為94.82分（RSD＝0.96%，n＝3），與預測值94.64分差異較小，表明預測、優(yōu)化后所得工藝均穩(wěn)定可行。

3 討論

筆者在前期預實驗中通過高效液相色譜法檢測出了苦杏仁苷、甘草苷，但兩者分離度較低，經(jīng)更換流動相、調整流動相比例后，仍未能提高其分離度，故本研究不將其列為指標成分。

筆者參考2020 年版《中國藥典》對各單味藥材進行含量測定時，考察了以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時對實驗結果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，當流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液時，色譜峰分離度良好、基線平穩(wěn)。采用DAD 檢測器在190～800 nm 波長范圍內(nèi)對供試品溶液進行全波長掃描后發(fā)現(xiàn)，鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、柚皮苷在210 nm 波長處的紫外吸收較強，5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷在283 nm波長處的紫外吸收較強，故本研究選擇雙波長對供試品進行測定。

本研究選用主、客觀賦權相結合的AHP-熵權法確定各指標權重，相比于僅用AHP法或熵權法賦權更加科學合理。AHP法由研究者賦權各指標，能考慮到組方藥材間關系、用量、療效，但忽視了實際實驗數(shù)據(jù)，主觀性強[9]；熵權法根據(jù)實際得到的數(shù)據(jù)賦權各指標，消除了主觀影響，卻忽略了各指標間的主次輕重[10]。因此，AHP-熵權法能兼具二者的優(yōu)點，使結果更合理可靠。

本研究以AHP-熵權法賦權計算鹽酸麻黃堿、巖白菜素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、柚皮苷、橙皮苷含量和出膏率的綜合評分，采用Box-Behnken 響應面法對麻杏咳喘顆粒的水提工藝進行優(yōu)化，方法科學可靠，篩選出麻杏咳喘顆粒的最佳水提工藝為浸泡時間40 min，加水量8倍，總提取時間180 min。經(jīng)驗證，該方法可行，可為麻杏咳喘顆粒的進一步開發(fā)提供參考。