鐘玉杭 黃小玲 孫志豪

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞婦幼保健院東莞市新生兒疾病篩查中心 (廣東 東莞 523000)

1891年，奧地利病理學(xué)家GuidoWerdnig首次報(bào)告了脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)[1]，是由于脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，引起以肌無力、肌萎縮為臨床特征的常染色體隱性遺傳病(AR)。有研究報(bào)道新生兒時(shí)期發(fā)病率為1/6000～1/10000[2]，人群攜帶率約為1/42[3]，是嬰幼兒期致死性最高的遺傳性疾病。

近10年，隨著藥物治療取得重大突破[4]，SMA成為有藥可醫(yī)的罕見病。2019年2月，國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)正式批準(zhǔn)了諾西那生鈉(活性成分：諾西那生)上市，開啟國內(nèi)SMA精準(zhǔn)治療新時(shí)代[5]，2021年6月，第二款SMA治療藥物利司普蘭口服液在中國上市。隨后，2款藥物于2022，2023年納入醫(yī)保，使得SMA治療有?？梢溃瑴p輕了患者家庭負(fù)擔(dān)。

國內(nèi)，SMA篩查主要集中于育齡人群攜帶者[6-8]，尚未普及開展新生兒期SMA篩查，幾乎所有患兒就診時(shí)已有明顯的肌無力癥狀[9]。新生兒篩查是保證SMA早診早治，獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵。截止2022年，SMA新生兒篩查已在美國(篩查數(shù)量：2395718，發(fā)病率：1/13,310)、日本(篩查數(shù)量：22209，發(fā)病率：0)、澳大利亞(篩查數(shù)量：202388，發(fā)病率：1/10,652)、加拿大(篩查數(shù)量：139810，發(fā)病率：1/27,962)、意大利(篩查數(shù)量：58558，發(fā)病率：1/4880)、俄羅斯(篩查數(shù)量：12000，發(fā)病率：0)、德國(篩查數(shù)量：297163，發(fā)病率：1/6911)、比利時(shí)(篩查數(shù)量：127329，發(fā)病率：1/14,148)等[10-13]國家開展。中國臺(tái)灣[14]、浙江杭州[15]率先開展新生兒SMA篩查的臨床方法學(xué)探索研究，為我國SMA新生兒篩查開展積累了經(jīng)驗(yàn)。但針對(duì)新生兒篩查體系，如何選擇滿足新篩原則的技術(shù)方法學(xué)仍然需要不斷的積累經(jīng)驗(yàn)和創(chuàng)新[16]。例如基于DBS樣本的極微量DNA檢測(cè)方法學(xué)開發(fā)，不同實(shí)驗(yàn)環(huán)境的結(jié)果判讀參考區(qū)間制定及穩(wěn)定性，準(zhǔn)確性評(píng)估等。本文對(duì)SMA新生兒篩查的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，為廣大臨床工作者了解新生兒人群SMA篩查技術(shù)提供幫助。

1 SMA分子病理及臨床表現(xiàn)

SMA是脊髓前角a-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性引起的肌無力、肌萎縮為主要特征的疾病。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要是將脊髓及大腦的信號(hào)傳輸至肌肉和內(nèi)分泌腺，通過一系列的神經(jīng)傳導(dǎo)支配身體的效應(yīng)器官活動(dòng)。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(SMNl;OMIM 600354)雙等位基因發(fā)生致病變異影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活蛋白表達(dá)，導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)異常。SMN1位于染色體5q13，該區(qū)域500kb范圍內(nèi)還存在1個(gè)高度同源的SMN2(SMNc)基因，二者僅相差5個(gè)堿基，其中2個(gè)堿基位于外顯子7(c.840C/T)和8(c.＊239G/A)中，另外3個(gè)位于第6、7內(nèi)含子。SMN基因終止密碼子位于外顯子7的3’末端，外顯子8不編碼氨基酸，因此，SMN1和SMN2的編碼區(qū)序列僅在外顯子7中存在1個(gè)差異堿基(c.840C/T)。c.840T破壞了剪接增強(qiáng)子(ESE)活性,使得SMN2基因外顯子7被剪接掉，產(chǎn)物為截短體，導(dǎo)致有功能的SMN蛋白只占10%[17]。正常人群中兩條染色體上各有一個(gè)等位SMN1拷貝，在肯定者人群中約有4%的頻率會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)SMN1拷貝存在于同一條染色體上,形成[2+0]型攜帶者，SMN2修飾基因拷貝數(shù)可以0～5不等。5%～10%的正常人同源缺失SMN2基因，因此普遍認(rèn)為SMN2基因不是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存所必須的。研究顯示，95%～98%SMA患者存在SMN1基因純合缺失，主要是SMN1基因第7號(hào)外顯子的純合缺失，另有2%～5%SMA患者存在復(fù)合雜合突變。此外，SMN1基因啟動(dòng)子區(qū)域的異常也會(huì)影響基因表達(dá)及蛋白功能。

SMA臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性肌無力與肌萎縮，近端比遠(yuǎn)端嚴(yán)重，下肢無力重于上肢，通常不累及眼外肌、膈肌、心肌、面部表情肌，亦無中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常[18]。神經(jīng)肌電圖顯示為典型的神經(jīng)源性損害，靜息時(shí)可見纖維顫動(dòng)波和正銳波，規(guī)律自發(fā)性運(yùn)動(dòng)單元活動(dòng)單位是SMA的肌電圖的特征性改變[19]。血清酶學(xué)檢測(cè)可以檢測(cè)到肌酸激酶的異常升高。

根據(jù)起病年齡、運(yùn)動(dòng)里程碑及病情進(jìn)展程度將脊髓性肌萎縮癥分為0～Ⅳ型，發(fā)病年齡越早病情越重[20]。脊髓性肌萎縮癥0型患兒一般在出生前發(fā)病，若不治療，一般存活不超過1個(gè)月；脊髓性肌萎縮癥I型(Werdnig-Hoffman病)，[OMIM253300]，亦稱嚴(yán)重型，患兒于6月齡以內(nèi)發(fā)病，全身出現(xiàn)嚴(yán)重肌無力和肌張力減弱，腱反射消失或減退，沒有倚托不能坐，通常在2歲前因肺部感染而死亡，是臨床類型最嚴(yán)重類型；脊髓性肌萎縮癥Ⅱ型[OMIM 253550]，又稱中間型，患兒于出生后6～18個(gè)月發(fā)病，肢體的近端對(duì)稱無力為主，下肢比上肢重，能坐卻不能站立、行走，大多數(shù)患兒能存活到青少年;脊髓性肌萎縮癥Ⅲ型(Kugelburg-Welander病)，[OMIM253400]，多數(shù)兒童期或青春期發(fā)病，患兒可以獨(dú)立走動(dòng)，病情緩慢，能存活到成年;脊髓性肌萎縮癥Ⅳ型[OMIM271150]，亦稱為成年型，臨床表現(xiàn)較輕，發(fā)病和進(jìn)展隱匿，生存時(shí)間與常人相近，但患者可有行走困難[21]。

2 SMA篩查技術(shù)

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP)PCR-RFLP基本原理是通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，利用限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物形成長短不一的DNA片段，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分?？梢愿鶕?jù)SMN1與SMN2基因第7和8 外顯子間堿基不同，形成限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)差異，對(duì)SMN1存在的缺失進(jìn)行區(qū)分。白晉麗等[22]統(tǒng)計(jì)了2004年1月至2017年12月采用不同基因診斷技術(shù)出具的診斷報(bào)告人數(shù)和構(gòu)成比，結(jié)果表明PCR-RFLP是常用于早期診斷SMA的技術(shù)，但由于不能檢測(cè)SMN1基因單拷貝數(shù)狀態(tài)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)致病變異是復(fù)合雜合型的患者產(chǎn)生漏診或誤診現(xiàn)象[23]。2012年，金煜煒等[24]使用PCRRFLP與MLPA技術(shù)對(duì)339例疑似病例開展分析，結(jié)果顯示PCR-RFLP發(fā)現(xiàn)194例SMN1純合缺失，MLPA發(fā)現(xiàn)196例，兩種技術(shù)的一致性達(dá)到98.9%，無顯著差異(χ2=0.2,P=0.88)。PCR-RFLP僅發(fā)現(xiàn)4例SMN1疑似雜合缺失，而MLPA驗(yàn)證有17例，二者一致性為23.5%，存在顯著差異(χ2=8.29，P＜0.01)。因此，PCR-RFLP盡管特異性高，但對(duì)于SMN1雜合缺失并存在點(diǎn)突變的病例仍存在局限性。

2.2 多重連接探針擴(kuò)增(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)MLPA方法是目前SMN基因拷貝數(shù)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。以SMN基因的外顯子7及外顯子8作為靶標(biāo)，利用外顯子上的差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)雜交探針，對(duì)每段靶序列/靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸探針。將待測(cè)DNA樣品變性后與探針進(jìn)行雜交，當(dāng)左右兩側(cè)的探針都雜交到目標(biāo)區(qū)域時(shí)，探針可以被連接酶連接然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MLPA與一般PCR方法的不同之處在于，被擴(kuò)增的并非靶序列本身，而是被連接起來的探針。此外，還需要使用參考探針，引入多個(gè)管家基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行定量。目前基于MLPA 技術(shù)已經(jīng)開發(fā)了穩(wěn)定的SMA拷貝數(shù)檢測(cè)商品化試劑盒，能檢測(cè)SMN1第7和8外顯子拷貝數(shù)，明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人，同時(shí)可檢測(cè)患者SMN2拷貝數(shù)，SMN2作為修飾基因能為臨床干預(yù)策略制定提供有用的信息[25-26]。由于該方法對(duì)DNA的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，周期較長，成本高、對(duì)雜質(zhì)比較敏感，不適合大規(guī)模篩查，也不能用于鑒定SMN1的微小突變及[2+0]型攜帶者[27]，通常被用作技術(shù)對(duì)比和驗(yàn)證。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR) qPCR主要原理是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，利用Taqman探針法或SYBR Green熒光素染料實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列相對(duì)定量，是SMA新生兒篩查以及攜帶者篩查最經(jīng)濟(jì)有效的方法。周成等[28]利用qPCR法對(duì)19297名孕婦進(jìn)行攜帶者篩查，對(duì)攜帶者孕婦配偶進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，如果雙方同為攜帶者對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷。共檢出SMA攜帶者286例，攜帶率為1.48%，其中6對(duì)夫婦同為SMA攜帶者，經(jīng)產(chǎn)前診斷確診純合缺失患兒1例，SMN1基因E7、E8 雜合缺失胎兒4例，正常基因型胎兒1例，qPCR結(jié)果與MLPA驗(yàn)證一致。qPCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)操作簡便、實(shí)驗(yàn)成本低、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、技術(shù)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，非常適合SMA攜帶者篩查以及新生兒篩查。但其特異性略遜于MLPA方法[23]，為了確保SMN1的特異性并避免SMN2基因的影響，2018年，F(xiàn)ran?ois Boemer等[29]設(shè)計(jì)了一種使用錨定核酸探針的定量聚合酶鏈反應(yīng) (qPCR) 技術(shù)，在比利時(shí)列日地區(qū)啟動(dòng)了一項(xiàng)為期三年的試點(diǎn)項(xiàng)目，對(duì)136,339名新生兒進(jìn)行SMN1第7外顯子缺失檢測(cè)，旨在特異性識(shí)別SMN1基因中外顯子7純合缺失[30]。結(jié)果顯示本地區(qū)SMA發(fā)病率為1/13634，純合子缺失的發(fā)生率為1/15149[31]，共發(fā)現(xiàn)了9例SMA，對(duì)于有神經(jīng)肌肉疾病癥狀的患兒均被轉(zhuǎn)診到NMRC進(jìn)行MLPA復(fù)檢確診，確診提示qPCR在最初的DBS檢測(cè)中無假陽性。2018年10月，美國紐約州使用qPCR方法開展新生兒SMA篩查，結(jié)果顯示34名新生兒呈陽性，經(jīng)過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)qPCR用于SMN1拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠[32-33]。Jennifer L Taylor等[34]研究發(fā)現(xiàn)qPCR不僅能進(jìn)行新生兒血斑篩查，同時(shí)可用于篩查脊髓性肌萎縮癥和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷。

2.4 數(shù)字PCR(digitalpolymerase chain reaction，dPCR) 近年來，微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)方法發(fā)展迅速，原理是以單分子PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)DNA進(jìn)行絕對(duì)定量[35]。實(shí)驗(yàn)過程中通過稀釋法將樣本分到獨(dú)立區(qū)室，每個(gè)區(qū)室最多包含1拷貝模板，DNA被分配到數(shù)千個(gè)液滴進(jìn)行擴(kuò)增，通過記錄每個(gè)液滴的熒光信號(hào)判斷陽性或陰性，隨后根據(jù)柏松分布推算模版DNA的濃度或基因拷貝數(shù)。該方法擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴，非特異性擴(kuò)增少，對(duì)SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)檢測(cè)的CV值明顯優(yōu)于qPCR技術(shù)[36-37]，Noemi Vidal-Folch[38]對(duì)1530名嬰兒和12名SMA患者進(jìn)行濾紙干血斑SMN1和SMN2外顯子7拷貝數(shù)檢測(cè)，開發(fā)了一種適用于新生兒篩查、攜帶者狀態(tài)和脊髓肌萎縮評(píng)估的多重微滴數(shù)字PCR方法，可以同時(shí)檢測(cè)DBS和其他組織中的SMN1缺失和SMN2拷貝數(shù)變化，證實(shí)ddPCR可用于拷貝變異檢測(cè)[39-40]。2016年，鄒洋等[41]使用微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)對(duì)138例樣本(來自56個(gè)SMA家系，其中產(chǎn)前診斷樣本17例)開展SMN1基因外顯子7拷貝數(shù)的檢測(cè)。ddPCR與MLPA技術(shù)檢測(cè)結(jié)果的一致率為100%，ddPCR技術(shù)可滿足臨床 SMN1基因檢測(cè)及產(chǎn)前診斷的需求，但是目前數(shù)字PCR儀的普及率不高，在臨床應(yīng)用上暫時(shí)還無法替代qPCR方法。

2.5 測(cè)序法(sequencing)

2.5.1 Sanger測(cè)序，上世紀(jì)70年代末由美國生物化學(xué)家Frederick Sanger提出[42]，因其堿基測(cè)序準(zhǔn)確度高，被稱為基因檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”。2013年，曹延延等[43]評(píng)價(jià)了Sanger測(cè)序技術(shù)用于診斷缺失型脊髓性肌萎縮癥的可行性。通過識(shí)別樣本擴(kuò)增片段中SMN1及SMN2的4個(gè)差異位點(diǎn)判讀SMN1純合缺失，100例確診患者和110例對(duì)照樣本測(cè)試結(jié)果與MLPA結(jié)果一致性為100%。證實(shí)Sanger測(cè)序技可以用于缺失型脊肌萎縮癥的分子診斷。2017年，同一課題組對(duì)52例患者采用PCR-Sanger測(cè)序來檢測(cè)SMN1基因純合或雜合缺失以及復(fù)合雜合突變，并對(duì)診斷效率進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示該方法與MLPA一致性100%，不僅可以用于SMN1基因拷貝數(shù)純合或雜合缺失，還可以篩選SMN1基因上的點(diǎn)突變，進(jìn)行SMN1基因復(fù)合雜合變異病例診斷[44]。此外，王逸群等[45]對(duì)疑似復(fù)合雜合突變患者進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2例患兒分別在第5外顯子、第1外顯子兩處非固有差異的堿基位點(diǎn)處發(fā)生基因突變，而且均為已報(bào)道的SMA致病突變[44]，突變均源于患者母親。研究提示Sanger測(cè)序能檢測(cè)SMA突變位點(diǎn)，驗(yàn)證突變類型，為疾病及早診斷提供依據(jù)，具有重要的臨床意義。

2.5.2 二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS) 是基于PCR和芯片技術(shù)發(fā)展而來的高通量測(cè)序技術(shù)，臨床上常用于基因組微小變異和拷貝數(shù)檢測(cè)。2017年，F(xiàn)eng等[46]利用雜交捕獲和NGS技術(shù)對(duì)6738例臨床樣本進(jìn)行SMA攜帶者篩查。結(jié)果顯示與qPCR或MLPA比較，該方法對(duì)于攜帶者檢出靈敏度為100% (CI: 95.9-100%; n=90) ，特異性為99.6% (95% CI: 99.4-99.7%; n=6,648)，而且可以同時(shí)檢測(cè)SMN1拷貝數(shù)和SMN基因微小變異，但微小變異在SMN1和SMN2上的定位還無法明確[47-48]。2019年，Chen等[49]使用NGS技術(shù)以及新開發(fā)的生物信息學(xué)方法對(duì)12747例樣本SMN1和SMN2的拷貝數(shù)進(jìn)行攜帶者篩查，經(jīng)數(shù)字PCR驗(yàn)證顯示SMN1和SMN2拷貝數(shù)結(jié)果一致性分別為100% (48/48) 和98% (47/48)，該方法提示利用SMN1與SMN2基因8個(gè)基因組參考信息的差異，通過NGS技術(shù)和信息學(xué)可以對(duì)2個(gè)基因的拷貝數(shù)進(jìn)行精確鑒定。2020年，Zhao等[50]采用NGS對(duì)來自中國南方5省34個(gè)民族的10585對(duì)正常夫婦進(jìn)行SMA攜帶者篩查泛種族研究，研究揭示了不同民族間攜帶率的差異(0.3～4.3%)，可為未來的大規(guī)模篩查應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考，但不同民族采集的數(shù)據(jù)規(guī)模差異可能會(huì)影響攜帶率的統(tǒng)計(jì)。

2.6 其他方法除上述篩查技術(shù)外，還有DNA質(zhì)譜法[15]、液體微珠陣列[51]、高分辨熔解曲線分析(HRMA)[52]等方法被應(yīng)用于SMA突變檢測(cè)。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中HRMA發(fā)展迅速，在SMA新生兒篩查中具備較大潛力，目前可區(qū)分9種SMN拷貝數(shù)組合，但仍需繼續(xù)研究區(qū)分更多拷貝數(shù)組合[53]。

3 總 結(jié)

SMA是嚴(yán)重致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，中國人群攜帶率高達(dá)1/42，95%是由SMN1基因的外顯子7純合缺失引起的。目前已批準(zhǔn)用于治療的三種藥物分別是nusinersen、onasemnogene abeparvovec和risdiplam，也有幾種藥物正處于臨床前或早期臨床開發(fā)階段。

隨著諾西那生鈉和利司普蘭被納入醫(yī)保，推動(dòng)了國內(nèi)SMA新生兒篩查的開展。臨床試驗(yàn)證實(shí)在患兒出現(xiàn)癥狀前開始治療，患兒在存活率、運(yùn)動(dòng)里程碑達(dá)成等方面均有更大獲益。目前臨床上常用于SMA新生兒篩查的技術(shù)是qPCR和MLPA。在大多數(shù)程序中，首先通過qPCR完成篩查，對(duì)于疑診SMA進(jìn)行MLPA復(fù)核/驗(yàn)證。而數(shù)字PCR法、高分辨熔解曲線分析法、NGS等新興技術(shù)方法在臨床SMA新生兒篩查中具有巨大的潛力。新療法的開發(fā)讓SMA攜帶者和新生兒篩查在許多國家得以普及，攜帶者篩查有可能降低人群疾病發(fā)病率，但無法針對(duì)整個(gè)人群，并且明顯具有社會(huì)導(dǎo)向性，同時(shí)攜帶者篩查無法識(shí)別新突變，也不能完全涵蓋父親未知或父母一方或雙方缺席的嬰兒。而新生兒篩查具有普遍性，適用于所有兒童，無論其父母的狀況如何，都能使患者和社會(huì)從創(chuàng)新藥物中獲得最大利益。目前SMA的新生兒篩查已在國外多個(gè)國家開展，為我國開展大規(guī)模新生兒篩查提供了經(jīng)驗(yàn)。吳莉萍等[54]基于濾紙干血斑建立的基因組DNA自動(dòng)化提取方法及流程，為在現(xiàn)有新生兒篩查體系增加SMA篩查提供了技術(shù)基礎(chǔ)。新生兒篩查和攜帶者篩查同時(shí)實(shí)施將有效降低SMA發(fā)病率，對(duì)減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)、提高人口素質(zhì)具有重要意義。