朱立華，周融融，黃生武，何 丹，3，張海潮，3，謝 誼

（1.湖南國華制藥有限公司，湖南 長沙 410013；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208）

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年約有200萬新發(fā)病例和176萬死亡病例[1]。肺癌發(fā)病率在多數(shù)國家呈升高趨勢，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%~85%。大多數(shù)NSCLC臨床病例確診時已屬中晚期，失去了手術(shù)切除機(jī)會，而目前傳統(tǒng)放療、化療效果欠佳，5年生存率僅為5%~10%[2]。因此尋找新的更有效的治療方法顯得尤為重要。

近年來，中藥復(fù)方在控制腫瘤增殖、減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)、延長生存期、改善生活質(zhì)量等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。越來越多臨床醫(yī)生采取中西醫(yī)結(jié)合的方法治療腫瘤患者，如在西藥化學(xué)治療后，通過中藥調(diào)理，延長生存期并改善生活質(zhì)量。復(fù)方菝葜（Fufang Baqia，F(xiàn)FBQ）為國華制藥有限公司自主研發(fā)，由菝葜、魚腥草、貓爪草、土鱉蟲、款冬花、枸杞子、大棗（去核）、鮮鱧魚8味藥材組成，具有清熱解毒、軟堅散結(jié)、滋陰益氣、扶正培本之功，輔助治療肺癌、子宮頸癌等多種癌癥具有較好的療效[3]。研究表明，復(fù)方菝葜能穩(wěn)定腫瘤瘤體，抑制腫瘤生長，其治療肺癌的臨床有效穩(wěn)定率達(dá)88.24%[4]。前期研究通過HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，從復(fù)方菝葜組方中分析得到29種化學(xué)成分，并對其物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了初步探索，然而復(fù)方菝葜組成藥味較多、化合物構(gòu)成復(fù)雜，且關(guān)于其抗NSCLC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制尚未探明，限制了復(fù)方菝葜進(jìn)一步開發(fā)利用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用提供了一種將中醫(yī)整體理念與藥物發(fā)現(xiàn)相結(jié)合的新模式，使復(fù)方研究實(shí)現(xiàn)了從“一靶、一藥”模式轉(zhuǎn)向“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多組分治療”模式。

本研究結(jié)合前期物質(zhì)基礎(chǔ)分析，通過成分?jǐn)?shù)據(jù)庫平臺豐富復(fù)方菝葜成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選并構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，挖掘和預(yù)測復(fù)方菝葜多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同參與抗NSCLC的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)、作用途徑，旨在為其抗NSCLC的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供參考和科學(xué)依據(jù)。

1 方 法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 （1）藥材及化合物信息平臺：PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；2020年版《中華人民共和國藥典》。（2）非小細(xì)胞肺癌數(shù)據(jù)平臺：GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM，https://www.omim.org/）；DisGeNET數(shù)據(jù)庫（A database of genedisease associations, http://www.disgenet.org）。（3）靶標(biāo)預(yù)測平臺：Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）。（4）化合物結(jié)構(gòu)繪制軟件：ChemDraw 14.0。（5）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)平臺；UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org）。（6）網(wǎng)絡(luò)可視化平臺及軟件：STRING數(shù)據(jù)平臺（https://string-db.org）；Cytoscape 3.7.1軟件。（7）靶標(biāo)GO功能及KEGG富集平臺：DAVID平臺（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 藥材成分信息及靶標(biāo)預(yù)測 依次檢索復(fù)方菝葜中菝葜、魚腥草、貓爪草、土鱉蟲、款冬花、枸杞子、大棗、鮮鱧魚8味藥材，在2020年版《中華人民共和國藥典》、TCMSP數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)、PubChem中收集歸納各藥材成分、歸經(jīng)及靶標(biāo)信息。復(fù)方菝葜抗NSCLC的潛在候選成分需滿足吸收、分布、代謝和排泄標(biāo)準(zhǔn)（Absorption，Distribution，Metabolism，Elimination；ADME）：即類藥性（drug like, DL）≥0.18；口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%。針對數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)中有活性而無直接關(guān)聯(lián)靶標(biāo)信息的成分，則按照如下步驟預(yù)測靶標(biāo)：在PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索成分的SMILES字符串或下載成分結(jié)構(gòu)文件，將結(jié)果上傳至Swiss Target Prediction平臺進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，其中排名前10的靶標(biāo)被視為成分潛在靶標(biāo)。

1.3 非小細(xì)胞肺癌靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫 以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞在OMIM、GeneCards、DisGeNET3個疾病信息平臺中檢索NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白靶標(biāo)；采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對疾病靶標(biāo)名稱進(jìn)行規(guī)范化。

1.4 GO和KEGG富集分析 將預(yù)測到的復(fù)方菝葜活性靶標(biāo)與NSCLC相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行比對遴選，進(jìn)一步得到復(fù)方菝葜成分與疾病的共調(diào)控靶標(biāo)。通過DAVID在線平臺對共有靶標(biāo)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集。分別采用靶標(biāo)富集數(shù)量、通路富集P值進(jìn)行排序和可視化。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?通過Cytoscape 3.7.1軟件對上述收集的藥材成分、藥材靶標(biāo)、藥材歸經(jīng)、疾病靶標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)與可視化，分別構(gòu)建復(fù)方菝葜-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、藥材-活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)、蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network,PPI）。采用Merge工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)聯(lián)，并通過Network Analyzer統(tǒng)計各靶標(biāo)的中介中心度（BetweennessCentrality，BC）和連接度值（Degree），對各節(jié)點(diǎn)（node）的網(wǎng)絡(luò)中心度和重要度進(jìn)行評價。

1.6 分子對接 為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果，通過Autodocks 4.2.6軟件對關(guān)鍵活性分子與關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行虛擬分子對接。從PDB（http://www.pdb.org）平臺下載關(guān)鍵蛋白的3D結(jié)構(gòu)，在PubChem數(shù)據(jù)庫中收集關(guān)鍵活性分子（配體）的3D結(jié)構(gòu)，采用Autodocks 4.2.6軟件對蛋白和配體進(jìn)行去水，加氫，加電荷等前處理。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方菝葜-歸經(jīng)分析 以復(fù)方菝葜7味藥材為關(guān)鍵詞，從TCMIP、2020年版《中華人民共和國藥典》及文獻(xiàn)中收集并分析該方的歸經(jīng)信息，構(gòu)建復(fù)方菝葜-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。（見圖1）依據(jù)連接度值（Degree）大小對歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的各臟腑重要度進(jìn)行排序，依次為：肺經(jīng)（degree=4）、肝經(jīng)（degree=4）、腎經(jīng)（degree=3）、胃經(jīng)（degree=3）、脾經(jīng)（degree=2）、心（degree=1）。結(jié)果表明，復(fù)方菝葜對機(jī)體肺經(jīng)和肝經(jīng)的選擇性較高，其主要通過干預(yù)上述經(jīng)絡(luò)到達(dá)病位發(fā)揮治療作用。

2.2 復(fù)方菝葜抗NSCLC的網(wǎng)絡(luò)分析

2.2.1 復(fù)方菝葜“藥材-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò) 從文獻(xiàn)調(diào)研及數(shù)據(jù)庫中共收集復(fù)方菝葜641個活性成分，依據(jù)ADME標(biāo)準(zhǔn)對各成分進(jìn)行篩選和去重，共獲得99個潛在活性成分（菝葜9個、魚腥草5個、貓爪草10個、土鱉蟲4個、款冬花16個、枸杞子35個、大棗20個）?；谏鲜龌钚猿煞止差A(yù)測到313個潛在靶標(biāo)。（見表1）通過Cytoscape軟件中的Merge工具對藥材-成分及成分-靶標(biāo)信息進(jìn)行綜合關(guān)聯(lián)，構(gòu)建復(fù)方菝葜藥材-活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。（見圖2）復(fù)方菝葜的組方藥材均表現(xiàn)出多成分調(diào)控多靶標(biāo)的特性。槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（βsitosterol）、落新婦苷（astilbin）、花旗松素（taxifolin）、阿托品（atropine）、山奈酚（kaempferol）、7-O-甲基毛綱草酚（7-OMethyleriodictyol）、千金藤堿（stepholidine）、腺苷（adenosine）和光千金藤堿（stepharine）在網(wǎng)絡(luò)分析中被選定為復(fù)方菝葜抗NSCLC的潛在關(guān)鍵性活性成分。上述成分在網(wǎng)絡(luò)中呈現(xiàn)較高的Degreee值，可同時參與二十余個生物靶標(biāo)的調(diào)控。結(jié)果表明，復(fù)方菝葜全方合用具有多成分、多靶標(biāo)協(xié)同參與抗NSCLC的優(yōu)勢。

表1 復(fù)方菝葜“中藥-化合物-活性成分-潛在靶標(biāo)”信息

表2 復(fù)方菝葜有效成分信息

圖2 復(fù)方菝葜“藥材-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)

2.2.2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 為篩選復(fù)方菝葜抗NSCLC的潛在靶標(biāo)，進(jìn)一步構(gòu)建復(fù)方菝葜成分與疾病的靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，本研究以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards、OMIM和DisGeNET 3個數(shù)據(jù)庫平臺分別檢索到241、182和115個NSCLC相關(guān)靶標(biāo)，設(shè)為疾病背景數(shù)據(jù)庫。通過比對藥材的313個潛在靶標(biāo)，得到63個復(fù)方菝葜成分-疾病共有靶標(biāo)（見圖3），并將其視為GO、KEGG富集分析的候選靶標(biāo)。采用STRING平臺分析63個共有靶標(biāo)間的生物關(guān)聯(lián)，構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。（見圖4）拓?fù)鋽?shù)據(jù)顯示，Degree值排名前10的靶標(biāo)依次為MYC、TP53、EGFR、AKT1、CTNNB1、CASP3、CCND1、ERBB2、GAPDH、HIF1A，其在PPI網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)浞謹(jǐn)?shù)見表3。

表3 10 個核心靶標(biāo)的信息

圖3 復(fù)方菝葜成分-疾病共有靶標(biāo)圖

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選圖

2.3 復(fù)方菝葜抗NSCLC的靶標(biāo)及通路富集

2.3.1 GO富集 采用DAVID平臺對復(fù)方菝葜治療NSCLC的63個共有靶標(biāo)進(jìn)行GO功能富集，依據(jù)靶標(biāo)富集數(shù)量排序，篩選到前30項(xiàng)GO功能富集條目。（見圖5）結(jié)果顯示，復(fù)方菝葜主要通過細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)、胞外區(qū)、線粒體等細(xì)胞元件（Cellular component），參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡過程調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖調(diào)控、對外源刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過程（Biological process），起到蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等分子功能（Molecular function），從而發(fā)揮抗NSCLC的功效。

圖5 63 個共有靶標(biāo)的GO 生物功能富集分析

圖6 KEGG 通路富集分析

2.3.2 KEGG富集 通過KEGG注釋63個共有靶標(biāo)的富集通路，共得到34條與NSCLC發(fā)展或治療相關(guān)的生物途徑（P＜0.01）。（見表4）KEGG富集結(jié)果提示，復(fù)方菝葜治療NSCLC的途徑主要為多靶標(biāo)協(xié)同調(diào)控多條生物通路。

表4 復(fù)方菝葜治療NSCLC的34 條相關(guān)通路信息

2.4 分子對接 分子對接可以預(yù)測其結(jié)合模式的強(qiáng)弱，也就是結(jié)合能。兩者之間結(jié)合能越小，說明配體與受體的構(gòu)象越穩(wěn)定，通常結(jié)合能＜-5 kcal/mol時，結(jié)合活性較好。因此，本研究選擇自由度高的成分槲皮素、花旗松素和落新婦苷，與關(guān)鍵靶點(diǎn)MYC、TP53和EGFR進(jìn)行分子對接。（見表5、圖7）結(jié)果顯示，復(fù)方菝葜的關(guān)鍵活性成分與治療NSCLC的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性，但是其具體作用機(jī)制和相關(guān)靶點(diǎn)還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接的結(jié)合能 （kcal/mol）

圖7 分子對接的結(jié)果

3 討 論

NSCLC的治療及機(jī)制探索雖取得了重要進(jìn)展，但其總體治愈率和生存率仍然較低。NSCLC仍是目前致死率最高的肺癌類型之一[5]。因此繼續(xù)尋求新藥或聯(lián)合療法，以將臨床益處擴(kuò)大到更廣泛的患者群體，并改善NSCLC的預(yù)后是目前亟待解決的問題。復(fù)方菝葜聯(lián)合諸藥對于肺癌尤其是NSCLC中晚期，以及肺癌伴咳嗽、胸痛等癥具有顯著改善作用，但缺乏與之相關(guān)的機(jī)制探索[6-7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析從中藥整體性出發(fā)，可實(shí)現(xiàn)藥物“多藥味、多成分、多靶標(biāo)、多途徑”作用模式的可視化和系統(tǒng)化展示。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜中藥的機(jī)制研究中，為闡明中藥及其復(fù)方作用機(jī)制作用提供了新思路[8]。

復(fù)方菝葜-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，肺經(jīng)和肝經(jīng)（degree=4）是該方各藥味選擇性較高的經(jīng)絡(luò)，提示復(fù)方菝葜作用的主要病位在于肺和肝。同時該方對腎、胃、脾、心經(jīng)也有較好的富集。中醫(yī)古籍并無NSCLC病名記載，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)家依其特征將其歸為“肺積”“肺巖”“肺萎”等范疇。病機(jī)為正氣虛損，邪毒入肺，久則耗氣傷陰，造成脾胃虛弱，肝膽疏泄不暢[3,9-10]。復(fù)方菝葜中菝葜、魚腥草清熱解毒；貓爪草、土鱉蟲軟堅散結(jié)；枸杞子、大棗、鱧魚具有扶正祛邪之功；款冬花潤肺下氣；枸杞子滋補(bǔ)肝腎；大棗益氣健脾，調(diào)和諸藥[3]。復(fù)方菝葜全方合用，可能通過靶向多個經(jīng)絡(luò)，發(fā)揮扶正祛邪、提高脾胃運(yùn)化和肝膽疏泄的作用。

復(fù)方菝葜“藥材-活性成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)篩選得到10個潛在活性成分，包括1個四環(huán)三萜類化合物、3個生物堿類化合物、5個黃酮類化合物和1個腺苷。上述成分均可參與多個生物靶標(biāo)的調(diào)節(jié)從而發(fā)揮治療作用。研究顯示，菝葜總黃酮提取物可通過調(diào)控p53介導(dǎo)的凋亡信號通路，激活人NSCLC細(xì)胞A549的凋亡[11]。落新婦苷是菝葜中含量較高的黃酮類成分，具有抗炎、抑制免疫、保肝護(hù)腎等藥理活性[12]。其可通過上調(diào)Bax、cleaved-Caspase-3，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來增強(qiáng)順鉑促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用[13]。研究表明，槲皮素可通過介導(dǎo)PI3K/Akt、AMPK/mTOR、Stat3/Mcl-1和NF-κB等多條通路，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞遷移與侵襲[14-16]。β-谷甾醇[17]、花旗松素[18-19]、山奈酚[20]和腺苷[21]均可顯著降低NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力。千金藤堿能抑制A549細(xì)胞血紅素加氧酶-1（heme oxy-genase-1, HO-1）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的基因表達(dá)，發(fā)揮抗癌細(xì)胞增殖作用[22]。這些化合物可能是復(fù)方菝葜治療NSCLC的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)，也提示復(fù)方菝葜具有多成分、多靶標(biāo)協(xié)同參與抗NSCLC的作用。這些化合物共同發(fā)揮增強(qiáng)抗炎、抗癌細(xì)胞增殖等作用來達(dá)到治療NSCLC的功效，但是其藥效成分和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。KEGG通路富集結(jié)果顯示，MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT信號通路（node·15）可能是復(fù)方菝葜治療NSCLC網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號通路。研究表明，上述通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能通過影響下游眾多效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生及細(xì)胞周期的調(diào)控[23-25]。下調(diào)JAK/STAT或PI3K/Akt被證實(shí)可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移[26-27]。這為后續(xù)基于信號通路從分子生物水平研究復(fù)方菝葜治療NSCLC提供了方向。

綜上所述，復(fù)方菝葜中槲皮素、花旗松素、落新婦苷、山奈酚、腺苷、千金藤堿和光千金藤堿等核心成分，可能通過MYC、TP53、EGFR、AKT1 和CTNNB1 等 關(guān) 鍵 靶 點(diǎn) 及MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、TNF等信號通路來控制NSCLC的發(fā)生發(fā)展。復(fù)方菝葜可通過“多成分、多靶標(biāo)、多途徑”協(xié)同治療NSCLC，為復(fù)方菝葜后續(xù)治療NSCLC的臨床應(yīng)用及開發(fā)利用提供了參考和依據(jù)。