周 迪,蔣桂榮,歐 仁,謝 艷,李 波,王 燕,楊 蓉,李 俊,沈 銀,敖 葉,王昌毅

(1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心,貴陽 550018,2.貴州省畜禽遺傳資源管理站,貴陽 550000)

【研究意義】赤水烏骨雞是貴州省地方優(yōu)良品種資源之一,主產(chǎn)于貴州省赤水市,是赤水市獨有的地方特色家禽,貴州省極具特色的小型肉蛋兼用型雞種,其具有體型大,單冠、平頭,胸寬、體深、腹部大、豐滿,腳長短適中,羽毛疏松均勻,黑色為主,耳垂紫黑色,喙、腿、爪為黑色的外貌特點[1]。赤水烏骨雞肉質(zhì)鮮嫩,富含人體所需氨基酸、微量元素、礦物質(zhì)和黑色素,具有耐粗飼、耗料少、適應性強、肉質(zhì)優(yōu)良、耐熱性好、抗潮濕、抗疲勞及覓食能力強等優(yōu)良特性。2010年,農(nóng)業(yè)部批準對赤水烏骨雞實施農(nóng)產(chǎn)品地理標志登記保護,加大了對赤水烏骨雞的保種,至此展開了赤水烏骨雞分子遺傳的相關(guān)研究。但目前,關(guān)于赤水烏骨雞主要經(jīng)濟性狀的主效分子遺傳機制尚不清楚,通過候選基因研究赤水烏骨雞生長性狀,揭示相關(guān)性狀基因的遺傳效應,對赤水烏骨雞遺傳改良、分子育種及保種等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蛋白磷酸酶3(Protein phosphatase 3,PPP3)又稱鈣調(diào)磷酸酶(CalcineurinCaN)是受Ca2+/鈣調(diào)素(Calmodulin,CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶,共有3種催化亞基,分別為PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC[2],其中PPP3CA是蛋白磷酸酶3(PPP3)的催化亞基A,廣泛存在于真核生物的多種細胞中[3-4]。在骨骼肌生長發(fā)育中,PPP3主要參與成肌細胞分化、成熟肌纖維肥大、鈣的信號傳導以及細胞內(nèi)鈣濃度變化的調(diào)節(jié)[5]。然而PPP3CA又是一種去磷酸化的絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶,在動物發(fā)育過程中至關(guān)重要,尤其是骨骼肌的生長發(fā)育[6]。研究表明,PPP3CA基因還在調(diào)控肌纖維中起關(guān)鍵作用,在不同肌肉組織中均有表達,并能夠抑制成纖維細胞生長因子23(FGF23)的表達,與IGFⅠ共同參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)節(jié)[7-9]。Shao等[10]研究發(fā)現(xiàn),侏儒癥白旗魚的脊椎較短且骨骼發(fā)育不良,其PPP3CA基因的表達量顯著低于骨骼發(fā)育正常的白旗魚,表明PPP3CA基因低表達能引起骨骼發(fā)育不良。同時,Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn),PPP3CA基因不僅與肌肉生長有關(guān),還與脂肪沉積有關(guān),主要參與肌肉細胞增殖、脂質(zhì)代謝和脂肪酸降解等過程。此外,PPP3CA基因還參與了動物繁殖調(diào)控,PPP3CA基因?qū)π栽缡臁⒋萍に匦盘栟D(zhuǎn)導通路和卵母細胞減數(shù)分裂具有重要影響,并在精原干細胞減數(shù)分裂和精子發(fā)生過程中具有去磷酸化作用[12-13]。在卵母細胞發(fā)育過程中PPP3CA亞基表達量增加,而在卵母細胞受精時PPP3CB亞基的表達量顯著增加,表明PPP3的Aβ亞基可作為輔助生殖技術(shù)程序中卵母細胞選擇的標志基因[14]。另有研究發(fā)現(xiàn),PPP3CA基因能調(diào)控雞的橫紋肌細胞及成肌細胞的分化,并參與骨骼肌纖維成分組成,涉及能量代謝和肌肉生長發(fā)育[15-16]?！颈狙芯壳腥朦c】有關(guān)PPP3CA基因在家禽(如赤水烏骨雞)及其生長相關(guān)性狀方面的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以赤水烏骨雞為研究對象,PPP3CA基因為候選基因,采用PCR擴增和直接測序技術(shù)對其PPP3CA基因全部外顯子進行多態(tài)位點篩選,運用RNAfold WebServer和Structural Bioinformatics Group在線軟件預測PPP3CA蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu),計算其基因頻率、基因型頻率、純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量,并對Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)進行分析;采用SPSS探討PPP3CA基因多態(tài)性與雞生長性狀的相關(guān)性,明確其SNP位點的具體遺傳效應,以期為赤水烏骨雞開發(fā)利用提供分子理論基礎(chǔ),并對進一步加快其遺傳改良和分子育種提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 赤水烏骨雞 試驗用赤水烏骨雞由貴州綠源禽業(yè)有限公司提供。在相同飼養(yǎng)管理水平下進行分籠飼養(yǎng),自由采食和飲水,選取具有生長記錄、體況健康、200日齡的赤水烏骨雞159羽。翅靜脈采集血液,EDTA抗凝,-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 E.Z.N.A.TMNRBC Blood DNA Kit試劑盒由Omega有限公司生產(chǎn);2×Taq Master Mix(Dye Plus)由Vazyme有限公司生產(chǎn);DL2 000 Marker由北京Solarbio(索萊寶)科技有限公司生產(chǎn);瓊脂糖由Hispanagar S A有限公司生產(chǎn);無水乙醇由貴州塞蘭博科技有限公司提供。

1.1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank已公布的雞PPP3CA基因(登錄號:NC_052535.1)序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1),引物由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 血液DNA提取 根據(jù)E.Z.N.A.TMNRBC Blood DNA Kit試劑盒提取血液中DNA,取1 μL于紫外分光光度儀上檢測DNA濃度和純度,將合格的DNA于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR反應及基因分型檢測 每個樣本取1 μL DNA進行混池,PCR體系(30 μL):2×TaqMaster Mix 15 μL;Forward Primer 2 μL;Reverse Primer 2 μL;混池DNA/DNA 2 μL;ddH2O 9 μL。PCR程序:95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,退火30 s(表1),72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃終延伸7 min,4 ℃保存;將PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖檢測,符合預期片段的PCR產(chǎn)物送安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進行測序,測序結(jié)果采用DNAStar的Seq Man進行比對分析,篩選SNP位點。

表1 PPP3CA基因各外顯子引物

1.2.3PPP3CA基因二級和三級結(jié)構(gòu)預測 采用RNAfold WebServer (http://rna.tbi.univie.ac.at/ cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)預測PPP3CA蛋白突變前后的二級結(jié)構(gòu);通過Structural Bioinformatics Group(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/ html/page.cgi?id=index)對PPP3CA蛋白在外顯子7 處C29T、T50C和T63G位點的CC、TT、AA型和TT、CC、GG型序列,以及外顯子16處 G720A位點的GG和AA型序列的三級結(jié)構(gòu)進行預測。

1.2.4PPP3CA基因型頻率、等位基因頻率及遺傳多樣性 采用POPGEN(Version 1.31)計算基因型頻率、等位基因頻率、卡方值(χ2)、雜合度(He)、群體純合度(Ho)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息量(PIC)。

基因型頻率=該基因個體數(shù)/該群體總數(shù)

等位基因頻率=群體中該基因總數(shù)/群體中該對等位基因總數(shù)

He=2×該對等位基因頻率的乘積

Ho=1-He

式中,Oi為i水平觀測頻數(shù),Ei為i水平期望頻數(shù),n為總頻數(shù),pi為i水平期望頻率,k為單元格數(shù),∑為總和;Pi、Pj表示群體中第i個和第j個等位基因頻率,m為等位基因數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

從圖1看出,PPP3CA基因外顯子擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,采用標準型DNA marker 2000條帶,分別在368、305、359、302、448及475 bp處均有清晰條帶,表明擴增效果較好,結(jié)果與預期片段的大小一致,且無引物二聚體。

M,DNA marker 2000;1～3,PPP3CA-Exon7-C29T/T50C/T63G;4～6,PPP3CA-Exon16-G720A;7～9,PPP3CA-Exon8;10～12,PPP3CA-Exon11;13～15,PPP3CA-Exon13;16～18,PPP3CA-Exon15。

2.2 測序結(jié)果

從圖2看出,在PPP3CA基因外顯子7處發(fā)現(xiàn)3個SNP位點,外顯子16處發(fā)現(xiàn)1個SNP位點,分別命名(均以各外顯子第1個堿基計數(shù))為C29T、T50C、T63G和G720A,均為錯義突變。其中,C29T位點堿基突變,導致第10位氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)榈鞍彼?有3種基因型,分別為CC、CT和TT;T50C位點堿基突變,第17位氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸,有2種基因型,分別為TT和CC;T63G位點堿基突變,導致第21位氨基酸由組氨酸突變?yōu)楣劝滨０?有2種基因型,分別為TT和GG;G720A位點堿基突變,第231位氨基酸由甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸,有3種基因型,分別為GG、GA和AA。

2.3 PPP3CA基因的二級和三級結(jié)構(gòu)預測

2.3.1 二級結(jié)構(gòu) 對比PPP3CA蛋白突變前后的二級結(jié)構(gòu)(圖3)可以看出,突變前PPP3CA蛋白在外顯子7處C29T、T50C、T63G位點的CC、TT、TT型自由能為-29.75 kcal/mol,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生突變表現(xiàn)為C29T、T50C、T63G位點堿基突變,突變后TT、CC、GG型的自由能為-33.33 kcal/mol,自由能降低,穩(wěn)定性升高;而在外顯子16處G720A位點的GG型自由能為-200.52 kcal/mol、AA型自由能為-198.85 kcal/mol,自由能升高,其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。

圖3 PPP3CA蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測圖譜

圖4 PPP3CA蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測圖譜

表2 PPP3CA基因外顯子7和外顯子16多態(tài)位點的等位基因頻率及基因型頻率

2.3.2 三級結(jié)構(gòu) 從圖4看出,PPP3CA蛋白在外顯子7處C29T、T50C和T63G位點突變,編碼的氨基酸發(fā)生突變,導致其三級結(jié)構(gòu)中折疊、轉(zhuǎn)折、螺旋等方式發(fā)生改變,因此其三級結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變;而外顯子16處G720A位點突變,其231位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸,但其三級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變,表明甘氨酸和絲氨酸在該段三級結(jié)構(gòu)中的作用相似。

2.4 PPP3CA基因的基因型頻率、等位基因頻率及遺傳多樣性

測序結(jié)果對比發(fā)現(xiàn),僅在赤水烏骨雞PPP3CA基因外顯子7和外顯子16發(fā)現(xiàn)4個SNPs,分別為C29T、T50C、T63G和G720A,其余外顯子均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點,將4個SNPs對應的純合子和雜合子基因型分別定義為CC、CT、TT、TC、TG、GG、GA和AA,分別對幾個位點對應的基因型頻率、等位基因頻率等分析(表2)可知,在C29T突變位點,CC型頻率為0.0377、CT型頻率為0.1272、TT型頻率為0.8050,其中等位基因C在群體中頻率為0.1163、T在群體中頻率為0.8837,群體純合度(Ho)為0.7945,雜合度(He)為0.2055,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.26,多態(tài)信息含量(PIC)為0.18(PIC<0.25),屬于低度多態(tài);在G720A突變位點,GG型頻率為0.1950、GA型頻率為0.2013、AA型頻率為0.6037,其中等位基因G在群體中頻率為0.2957、A在群體中頻率為0.7043,群體純合度(Ho)為0.5835、雜合度(He)為0.4165,有效等位基因數(shù)(Ne)為1.71,多態(tài)性信息含量(PIC)為0.3298(0.25<0.3298<0.50),屬于中度多態(tài);而在T50C、T63G突變位點中出現(xiàn)2種基因型,為T50C位點TT、CC型,T63G位點TT、GG型,其基因型頻率、等位基因T、C、T、G頻率分別為0.3082、0.6918、0.4591、0.5409;χ2檢驗結(jié)果表明,CC、CT、TT和GG基因座均偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.5 PPP3CA基因多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性

由表3可知,赤水烏骨雞PPP3CA基因在外顯子7和外顯子16處發(fā)生堿基突變,與生長性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),外顯子7的C29T位點突變,分別有CC、CT和TT共3種基因型,CC型個體的體重和骨盆寬顯著高于CT和TT型個體,CC型個體的胸圍顯著高于TT型個體;外顯子7的T50C位點突變,分別有TT和CC 2種基因型,CC型個體的體重、脛長和龍骨長顯著高于TT型個體;外顯子7的T63G位點突變,分別有TT和GG 2種基因型,TT型個體的脛長和龍骨長顯著高于GG型個體;外顯子16的G720A位點突變,分別有GG、GA和AA基因型,AA型個體的脛長和龍骨長極顯著高于GA型個體,AA型個體的體斜長顯著高于GA型個體。表明,外顯子7的C29T位點的TT型、T50C位點的CC型、T63G位點的TT型和外顯子16 G720A位點的AA型均為優(yōu)勢基因型,能夠提高赤水烏骨雞的生長性狀。

表3 PPP3CA基因多態(tài)位點與赤水烏骨雞生長性狀關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

骨骼肌在動物生長中有著不可替代的作用。PPP3CA基因能夠抑制成纖維細胞生長因子23的表達,與IGFⅠ共同參與骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)節(jié),骨骼肌的層次從上到下依次為肌肉、纖維束、纖維、肌原纖維和肌節(jié)[17]。骨骼肌是橫紋肌中附著在骨骼上的肌肉,而肌節(jié)是含有肌球蛋白II細絲(粗)和肌動蛋白細絲(細),其均參與調(diào)節(jié)骨骼肌的收縮[8-9]。同時,骨骼肌在生理過程中也發(fā)揮重要作用,骨骼肌干細胞具有再生功能,對骨骼肌的發(fā)育、生長、維持和修復至關(guān)重要[20]。PPP3CA基因在控制骨骼肌纖維類型中起關(guān)鍵作用,其調(diào)節(jié)骨骼肌的生長發(fā)育,與生長因子VEGF和FGF2共同調(diào)節(jié)細胞的增殖和信號傳導[9];在成肌細胞中,PPP3CA基因與PPARGC1A基因共同正向調(diào)節(jié)成肌細胞生長發(fā)育,當抑制PPARGC1A基因的表達時,PPP3CA基因的表達受到顯著抑制,將抑制肌肉的生長發(fā)育,表明PPP3CA和PPARGC1A基因?qū)Τ杉〖毎L發(fā)育具有協(xié)同作用[21]。單艷菊等[22]研究發(fā)現(xiàn),在清遠麻雞1周齡時趾長伸肌和3周齡時腓腸肌外側(cè)頭、比目魚肌出現(xiàn)急速上升,且清遠麻雞3種類型骨骼肌中PPP3CA基因mRNA的表達量均高于隱性白羽肉雞,在3周齡時呈極顯著差異。近年來的文獻報道表明,PPP3CA基因?qū)游锏纳L發(fā)育和肉質(zhì)具有重要影響,如PPP3CA基因已被證實參與牛肌肉前脂肪細胞的分化[23]。王興群等[24]發(fā)現(xiàn),江口蘿卜豬PPP3CA基因G316451A位點突變,且GG和GA型的大理石紋評分顯著高于AA型,表明PPP3CA基因?qū)谔}卜豬肉質(zhì)存在明顯影響。Chen等[11]研究表明,PPP3CA基因?qū)ωi肌肉的生長有重要影響。包艷波[25]研究發(fā)現(xiàn),PPP3CA基因的AA型對大骨雞母雞肌肉的鎖水率、腿肌熟肉率、胸腿肌pH及胸肌灰分含量影響顯著,提示該基因型有可能作為篩選優(yōu)良肉質(zhì)性狀的候選型。本試驗通過對赤水烏骨雞PPP3CA基因外顯子多態(tài)性篩選,在外顯子7處發(fā)現(xiàn)的3個錯義突變位點C29T、T50C和T63G,在外顯子16處發(fā)現(xiàn)1個錯義突變位點G720A?；蚍中筒⑴c生長性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),外顯子7 處C29T位點突變的CC型顯著提高個體的體重、骨盆寬和胸圍;T50C位點突變的CC型顯著提高個體的體重、脛長和龍骨長;T63G位點突變的TT型顯著提高個體的脛長和龍骨長;外顯子16處G720A位點突變的AA型極顯著提高個體的脛長和龍骨長,GG型顯著提高個體的體斜長。由此看出,C29T的CC型、T50C的CC型、T63G的TT型和G720A的AA型均為優(yōu)勢基因型,但C29T和T50C位點堿基突變?yōu)椴焕蛔?而T63G和G720A位點的堿基突變?yōu)橛欣蛔?且G720A位點更有利于赤水烏骨雞生長。說明,PPP3CA基因?qū)Τ嗨疄豕请u的生長發(fā)育具有一定的影響。

4 結(jié) 論

在PPP3CA基因外顯于7和外顯子16處其發(fā)現(xiàn)4個錯義突變位點,其中,T63G和G720A位點的堿基突變?yōu)橛欣蛔?且G720A位點更有利于赤水烏骨雞生長,可作為赤水烏骨雞分子標記輔助選育參考位點。本研究首次探討PPP3CA基因與雞生長性狀的相關(guān)性,并在家雞的PPP3CA基因外顯子中發(fā)現(xiàn)對赤水烏骨雞生長性狀具有一定影響的多態(tài)位點,可作為赤水烏骨雞分子標記輔助選育參考位點。研究結(jié)果可為今后赤水烏骨雞的育種目標提供參考依據(jù),并為進一步研究雞PPP3CA基因奠定基礎(chǔ)。