郭晨浩,孟 科,榮 軒,強 浩,聶 瑋,陶毛孩,馮登偵

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021)

【研究意義】綿羊是人類社會最主要的經(jīng)濟動物,也是人類社會羊肉、羊奶、羊毛和毛皮的重要來源[1]。由于羊肉肉質(zhì)鮮嫩,營養(yǎng)豐富,因此深受廣大人民的歡迎。當(dāng)前,如何改善肉制品的產(chǎn)量與品質(zhì),以滿足人們對健康飲食的需要,已成為改良育種的重要依據(jù)[2]。灘羊是我國著名綿羊品種之一,其脂質(zhì)均勻、風(fēng)味獨特、肉質(zhì)優(yōu)良[3]。杜泊羊原產(chǎn)于南非,是世界著名的肉羊品種,由于其生長速度快、瘦肉比例高,是雜交羊肉生產(chǎn)的優(yōu)良終端父系[4]。小尾寒羊是我國本地品種,以早熟、高產(chǎn)而聞名,并對各種氣候條件具有良好的適應(yīng)性,是中國優(yōu)良的綿羊選育母本[5]。選用杜泊羊、灘羊和小尾寒羊開展三元雜交,使雜交后代獲得超越親本的雜交優(yōu)勢[6]。隨著分子育種技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展,直接或間接地對綿羊肉用性狀的遺傳改良起重要作用[7]。而分子標(biāo)記輔助選擇是一種能夠精確評估、預(yù)測動物育種與生產(chǎn)品質(zhì)、節(jié)約成本、加快育種進程的新途徑[8]?！厩叭搜芯窟M展】RFXANK(Regulatory factor X associated ankyrin containing protein)又被稱為ANKRA1、BLS、F14150_1和RFX-B,是調(diào)節(jié)因子X (RFX)的亞基。其突變可能引起淋巴細胞綜合癥及MHC II分子變異[9]。目前,RFXANK基因的研究主要針對人體免疫學(xué),而關(guān)于綿羊肉用性狀的相關(guān)性研究則相對較少。Zhang等[10]應(yīng)用Ovine SNP50芯片對329只綿羊的體重性狀進行分析,檢測到RFXANK基因?qū)d羊斷奶后宰前活重的增加具有顯著影響。RIPK2基因是調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要基因,而RFXANK基因則通過調(diào)節(jié)蛋白的生成過程來控制MHC基因的活性[11]。褚敏[12]通過對牦牛脂肪組織microRNA的功能分析發(fā)現(xiàn),RFXANK基因可以富集到與脂肪沉積相關(guān)的通路中,說明RFXANK基因可能參與脂肪沉積的調(diào)節(jié)。本研究利用DAVID(https: //david.ncifcrf.gov/)對RFXNAK基因進行功能分析,發(fā)現(xiàn)該基因作用在組蛋白脫乙酰酶和Rs蛋白信號傳導(dǎo)通路上。組蛋白脫乙酰酶(Histone deacetylase,HDAC)是一種極為重要的胰蛋白酶,能修飾染色體結(jié)構(gòu),調(diào)控基因表達[13]。Feng等[14]研究發(fā)現(xiàn)Rev-erbα對HDAC3的基因組募集指導(dǎo)了正常肝脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)所需的組蛋白乙酰化和基因表達的晝夜節(jié)律,組蛋白乙?；氖д{(diào)會嚴重干擾正常代謝,當(dāng)HDAC3或Rev-erbα的含量在小鼠肝臟中徹底消耗,會導(dǎo)致小鼠肝脂肪變性。前人研究充分說明,RFXANK基因?qū)θ庥眯誀罹哂姓{(diào)控作用?！颈狙芯壳腥朦c】以往有關(guān)RFXANK基因的研究多以人體免疫學(xué)為主,但RFXANK基因?qū)d羊肉用性狀的影響則鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以杜泊羊、小尾寒羊和灘羊、杜灘寒三元雜交羊為研究對象,利用Squenom Mass ARRAY?SNP技術(shù),分別檢測3個RFXANK基因位點,并探討RFXANK基因的多態(tài)性與肉用性狀之間的關(guān)系,以期為綿羊肉用性狀的分子標(biāo)記提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

杜泊羊(30只)、灘羊(30只)和小尾寒羊(31只)共91只健康成年羊來自寧夏石嘴山威震肉羊繁育場(106.51038,38.97912)。

1.2 試驗試劑

抗凝采血管購自宇力醫(yī)療器械(江蘇)有限公司;動物基因組DNA提取試劑盒購自天根技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 用抗凝采血管頸靜脈采集91只試驗羊的血樣5 mL;隨機采集杜灘寒三元雜交羊和灘羊(各8只,公母各半)、杜泊羊和小尾寒羊(各7只,3公4母),共30只綿羊的耳組織。置于75%酒精中,-20 ℃下保存。

1.3.2 基因DNA提取 采用動物血液基因組DNA提取試劑盒對綿羊血液樣本DNA進行提取,利用超微量分光光度計和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳測定91只綿羊DNA的純度和濃度。

1.3.3 液相捕獲測序技術(shù) 通過Ensembl基因庫(http://asia.ensembl.org/index.html)和NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)確定RFXANK基因的序列ID號。將91份樣本交由康普森農(nóng)業(yè)科技(北京)有限公司進行。

1.3.4 飛行質(zhì)譜檢測 飛行質(zhì)譜檢測交由康普森農(nóng)業(yè)科技(北京)有限公司完成。試驗步驟為:引物設(shè)計,引物信息詳見表1;DNA質(zhì)量檢測;PCR擴增。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 屠宰性能測定 對飛行質(zhì)譜檢測的8月齡(30只)試驗羊進行稱重,稱重后進行屠宰,按照頸動脈放血進行屠宰。宰前活重為宰前禁食12 h、禁水2 h測得,其余屠宰性能測定指標(biāo)分別為胸圍、胴體重、凈肉重、GR值、背膘厚、屠宰率和凈肉率。清除內(nèi)臟周圍的脂肪,用電子秤稱重心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、全骨[15-16]。

1.4.2 肉品質(zhì)測定 屠宰后,采集第3肋骨到第12肋骨間的背最長肌,剪切力由嫩度儀測定;系水力由壓力法測定;熟肉率測定由蒸煮法測定;pH選用普及型pH計測定;肌纖維直徑、肌纖維密度由石蠟切片法觀察測定。

表1 RFXANK基因3個SNP位點引物信息

1.4.3 肌肉營養(yǎng)物質(zhì)測定 肌肉中氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》測定;脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》測定;蛋白質(zhì)參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》測定;膽固醇參照GB 5009.128—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膽固醇的測定》測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

綿羊RFXANK基因3個位點的基因型頻率、等位基因頻率及多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)由Microsoft Excel統(tǒng)計分析。用χ2進行哈代-溫伯格平衡檢驗。用SPSS 26.0 軟件對試驗羊群基因型與肉用性狀表型數(shù)據(jù)聯(lián)合進行方差分析,所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

采用的分析模型為一般線性模型:

Y=μ+G+m+e

式中,Y為性狀測定值,μ為群體均值,G為基因型效應(yīng),m為性別效應(yīng),e為隨機殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測結(jié)果

經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)可知,DNA條帶清晰完整無拖帶。

2.2 液相捕獲測序結(jié)果與分析

在杜泊羊(D)、灘羊(T)和小尾寒羊(XH)共91只綿羊中,共檢測到11個RFXANK基因突變位點,幾乎全部試驗羊均在rs160009883、rs420498050和rs405773959這3個位點發(fā)生了突變,與參考基因組(Oar_rambouillet_v1.0)存在較大偏差(表2)。

M:DL 2000 DNA Marker;1～8:試驗羊群部分基因組DNA。

表2 RFXANK基因的突變區(qū)域和位點數(shù)

2.3 RFXANK基因多態(tài)性分析

根據(jù)測序結(jié)果計算基因型頻率、基因頻率和各項群體遺傳指標(biāo)(表3～4)?？ǚ姜毩⑿詸z驗顯示,3個位點品種間差異極顯著;3個位點在D群體表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.250.05)。

2.4 RFXANK基因分型分析

通過采用Sequenom Mass ARRAY?SNP技術(shù)檢測30只綿羊的基因分型,由圖2可知,RFXANK基因的rs160009883位點檢測出3種基因型為:AA(4)、CA(7)和CC(19);RFXANK基因的rs420498050和rs405773959位點檢測出3種基因型為:AA(3)、GA(7)和GG(20)。

2.5 RFXANK基因與綿羊肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.5.1RFXANK基因與屠宰性能的關(guān)聯(lián)分析 對RFXANK基因3個位點的不同基因型與綿羊的屠宰性能進行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果(表5)表明,rs160009883位點AA、CA基因型宰前活重、胴體重極顯著高于CC基因型(P<0.01),AA基因型凈肉重極顯著高于CC基因型,AA基因型凈肉率顯著高于CC基因型(P<0.05),CA基因型凈肉重顯著高于CC基因型,AA、CA基因型與CC基因型全骨重差異分別為顯著和極顯著;rs420498050和rs405773959位點AA基因型宰前活重、屠宰率、凈肉率和全骨重極顯著高于GG基因型,AA基因型背膘厚顯著高于GG基因型,AA、GA基因型胴體重、凈肉重極顯著高于GG基因型,AA基因型胴體重、凈肉重、屠宰率和凈肉率顯著高于GA基因型。

表3 RFXANK基因3個位點基因型頻率及基因頻率

表4 RFXANK基因3個位點群體遺傳多樣性分析

圖2 RFXANK基因3位點分型結(jié)果

表5 RFXANK基因3個位點不同基因型與綿羊屠宰性能的關(guān)聯(lián)分析

2.5.2RFXANK基因與內(nèi)臟器官重量和胸圍的關(guān)聯(lián)分析 由表6可知,rs160009883位點AA、CA基因型心臟重顯著高于CC基因型(P<0.05),AA、CA基因型肝臟重、腎臟重極顯著高于CC基因型(P<0.01),AA基因型與CA、CC基因型脾臟重的差異分別為顯著和極顯著,AA基因型胸圍顯著高于CC基因型,CA基因型脾臟重顯著高于CC基因型,AA、CA基因型與CC基因型肺臟重差異分別為極顯著和顯著;rs420498050和rs405773959位點AA、GA基因型與GG基因型心臟重差異分別為極顯著和顯著,AA、GA基因型肝臟重、肺臟重和腎臟重極顯著高于GG基因型,AA基因型胸圍顯著高于GG基因型,AA、GA基因型脾臟重極顯著高于GG基因型,AA基因型脾臟重顯著高于GA基因型。

2.5.3RFXANK基因與肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析 由表7可知,3個位點不同基因型間的pH、剪切力、熟肉率、失水率無顯著差異;rs160009883位點AA基因型GR值顯著高于CC基因型(P<0.05),CA基因型肌纖維直徑顯著高于CC基因型;CC基因型肌纖維密度極顯著高于CA基因型(P<0.01);rs420498050和rs405773959位點AA基因型GR值顯著高于GG基因型,GA基因型肌纖維直徑顯著高于GG基因型;GG基因型肌纖維密度極顯著高于GA基因。

2.5.4RFXANK基因與肌肉養(yǎng)分的關(guān)聯(lián)分析 由表8可知,rs160009883位點AA基因型蛋白質(zhì)極顯著高于CC基因型(P<0.01),CC基因型肌苷酸顯著高于AA基因型(P<0.05),CA基因型丙氨酸、纈氨酸顯著高于CC基因型;rs420498050和rs405773959位點AA基因型蛋白質(zhì)極顯著高于GG基因型,GG基因型肌苷酸顯著高于GA基因型,GA基因型丙氨酸、纈氨酸顯著高于GG基因型。

表6 RFXANK基因3個位點不同基因型與綿羊內(nèi)臟器官重量和胸圍的關(guān)聯(lián)分析

表7 RFXANK基因3個位點不同基因型與綿羊肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

表8 RFXANK基因3個位點不同基因型與肌肉養(yǎng)分的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量高說明群體遺傳變異程度高、群體遺傳多樣性豐富,而群體遺傳多樣性豐富,表明該群體存在一定的遺傳變異潛力[17]。本研究發(fā)現(xiàn),RFXANK基因的rs160009883、rs420498050和rs405773959位點在杜泊羊群體呈中度多態(tài)(0.25

屠宰性能是評價肉用性狀和經(jīng)濟效益的重要指標(biāo),肉品質(zhì)是衡量肉用性狀的關(guān)鍵[18]。肌纖維直徑能反映動物的生長速度,從而對宰前活重產(chǎn)生影響,導(dǎo)致胴體性狀差異[19]。本研究發(fā)現(xiàn)RFXANK基因CA、GA型的綿羊GR值、各項屠宰指標(biāo)均高于CC、GG型的綿羊,表明C→A、G→A的突變對肉羊的生長發(fā)育有促進作用。目前,國內(nèi)外有關(guān)RFXANK基因的研究主要集中于免疫缺陷病、肝細胞癌相關(guān)病理學(xué)和MHC II類分子的調(diào)控作用上[20-22]。然而,有關(guān)RFXANK基因多態(tài)性與綿羊肉用性狀的相關(guān)性研究很少。Rade等[23]通過基因表達試驗分析,在人類的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了RFXANK基因大量表達。骨骼肌是一種橫肌肉,它是一種附著在骨骼上的肌肉,骨骼肌的發(fā)育與機體的生長和體重密切相關(guān)[24]。上述研究表明,RFXANK基因可能通過影響骨骼肌的發(fā)育對綿羊體重產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn),RFXANK基因3個位點的不同基因型對綿羊胴體重和宰前活重的差異有顯著性,這與Zhang等[10]的研究結(jié)果相吻合。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在綿羊基因組中存在著對生長性狀和肉用性狀有顯著關(guān)聯(lián)性的候選基因[25-26],其中MEF2B、RFXANK、RIPK2和GRM1等是綿羊生長性狀和肉用性狀的重要候選基因[27]。Trukhachev等[28]發(fā)現(xiàn),外顯子基因RFXANK高度保守,非編碼區(qū)具有顯著變異性,SNP位于外顯子中,對動物肉用性狀和免疫反應(yīng)參數(shù)有顯著影響,且在牛和小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的突變。在家禽研究中,Li等[29]研究發(fā)現(xiàn),在雞胸肌8935個基因的篩選中,REXANK基因?qū)θ怆u的生長有重要影響。本研究中,RFXANK基因3個位點的不同基因型對綿羊凈肉重、背膘厚、屠宰率和凈肉率均有不同程度的顯著差異,進一步表明RFXANK基因?qū)d羊肉用性狀有重要影響。劉賢等[30]通過對母牛胸圍、管圍和體重聯(lián)合研究分析,發(fā)現(xiàn)隨著母牛體重的逐漸增加,其胸圍和管圍的也隨之發(fā)生明顯增長,本研究結(jié)果與其相吻合。內(nèi)臟器官在動物整個機體生長發(fā)育和對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收代謝中起著重要作用[31]。據(jù)報道,RFXANK基因?qū)π∈笾w和子宮形成發(fā)育起表達調(diào)控作用[32]。Lin等[33]發(fā)現(xiàn),RFXANK基因在動物的胸腺細胞、肺臟和睪丸中均有表達。殷雨洋等[34]研究表明,隨著湖羊體重的逐漸增長,湖羊心臟重量隨之顯著增加,其機體所需營養(yǎng)代謝也隨之逐漸增加,從而心臟的增重與體增重處于平衡狀態(tài)。黃帥等[35]研究發(fā)現(xiàn)羊體內(nèi)臟發(fā)育與整個機體的上下生長發(fā)育相適應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),RFXANK基因3個位點的不同基因型對綿羊各內(nèi)臟器官重量和宰前活重均有顯著差異,說明該基因?qū)d羊的生長發(fā)育具有重要影響,與上述研究結(jié)果相一致。

肉品質(zhì)是評價肉質(zhì)特性的主要依據(jù),主要包括pH、剪切力、熟肉率、失水率和肌肉養(yǎng)分等。目前,有關(guān)綿羊RFXANK基因與肉品質(zhì)相關(guān)性研究尚屬空白。本研究通過GO功能分析發(fā)現(xiàn)RFXANK在組蛋白脫乙酰酶通路上起作用。組蛋白脫乙酰酶能在一定程度上調(diào)控組蛋白和非組蛋白乙?；?從而影響脂肪組織的代謝和肥胖的發(fā)生發(fā)展趨勢[36]。吳佳玉等[37]發(fā)現(xiàn)Rev-erb能夠募集HDAC3并與之結(jié)合,從而使骨骼肌細胞在代謝過程提高葡萄糖的利用率,并能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)或脂肪。蛋白質(zhì)的含量對畜禽的肉產(chǎn)量、肉品質(zhì)和營養(yǎng)價值等性能有重要影響[38]。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的重要物質(zhì),其成分及含量對肉的風(fēng)味、營養(yǎng)價值及蛋白代謝有重要影響[39]。本研究發(fā)現(xiàn),RFXANK基因3個位點不同基因型對蛋白質(zhì)、丙氨酸和纈氨酸存在顯著差異。因此推測,RFXANK基因可能對肌肉中蛋白質(zhì)和脂肪含量產(chǎn)生影響,從而影響肉品質(zhì)。肌纖維密度和肌纖維直徑是肌纖維組織學(xué)特性的主要參考依據(jù),對影響肉品質(zhì)因素中十分重要[40]。本研究結(jié)果顯示,RFXANK基因3個位點不同基因型對肌纖維直徑和密度存在顯著差異,進一步表明RFXANK基因?qū)d羊肉品質(zhì)有重要影響。綜上表明,RFXANK基因與綿羊肉品質(zhì)有相關(guān)性,這些研究結(jié)果對綿羊肉品質(zhì)研究具有參考價值。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)RFXANK基因的rs160009883、rs420498050和rs4057739593位點不同基因型在綿羊肉用性狀上有不同程度的顯著差異。說明RFXNAK基因可作為肉羊生長發(fā)育和肉用性狀方面的候選基因。此外,RFXANK基因3個位點可以作為優(yōu)質(zhì)肉羊培育中肉用性狀的潛在分子標(biāo)記,為分子雜交育種提供理論參考,進一步促進肉羊品質(zhì)改良。