鄢陸琪，譚明輝, ，李昆太,

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034）

黃瓜作為具有獨(dú)特清香味的葫蘆科草本植物，2020 年世界總產(chǎn)值已達(dá)到56900214 美元，是世界各地極為重要的商業(yè)栽培作物之一[1-2]。研究表明，新鮮黃瓜含水量高達(dá)90%以上，富含蛋白質(zhì)、糖類、酚類、葫蘆素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)對(duì)衰老、氧化、腫瘤等有一定抵抗作用[3]。然而，黃瓜屬于典型不耐貯藏蔬菜，常因失水蔫黃或腐爛變質(zhì)而失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為此，將黃瓜加工成果蔬汁可提高其利用率并減少損失，是解決該問(wèn)題的有效途徑。

鮮榨果蔬汁是一類營(yíng)養(yǎng)、方便、低熱量的純天然飲品，已逐漸趨于大眾化[4]。這類飲品以新鮮果蔬為原料，經(jīng)清洗、切塊、榨汁等一系列加工程序完成。通常情況下，病原微生物是否入侵與果蔬清潔力度、生產(chǎn)加工條件等直接相關(guān)。有研究表明，鮮切果蔬由于組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，其侵染腐敗菌和病原菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于未處理果蔬[5-6]。目前，以鮮切加工為基礎(chǔ)的果蔬汁中微生物污染問(wèn)題嚴(yán)重。這些微生物包括沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）等數(shù)量多、繁殖快、危害大的食源性病原菌，極易引發(fā)相關(guān)疾病[7-8]。其中，由沙門氏菌引發(fā)的中毒事件在我國(guó)食源性疾病中居首位，占比70%～80%，死亡人數(shù)高達(dá)5.9～15.5萬(wàn)人[9]。因此，減少果蔬汁中微生物污染問(wèn)題特別是沙門氏菌顯得尤為重要。

為延長(zhǎng)果蔬及相關(guān)產(chǎn)品的貨架期，抑制病原菌生長(zhǎng)與增殖，人們往往選擇添加化學(xué)保鮮劑或天然保鮮劑。前者如山梨酸鉀、硝酸鉀及亞硝酸鹽等易對(duì)人體產(chǎn)生副作用，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致蕁麻疹、結(jié)腸癌等疾病[10-11]。后者主要來(lái)源于自然界，其中微生物來(lái)源的如乳酸鏈球菌素（Nisin）、納他霉素（Natamycin）及ε-聚賴氨酸（ε-PL）等天然抗菌肽，因安全無(wú)毒、作用高效等優(yōu)點(diǎn)在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12-13]。王大平等[14]通過(guò)濃度為0.1～0.5 g/L 的Nisin 溶液浸泡獼猴桃果實(shí)1 min，發(fā)現(xiàn)各濃度均可顯著延緩果實(shí)貯藏后期可滴定酸、VC含量等指標(biāo)的下降，對(duì)于改善果實(shí)衰老具有良好效果。Wen 等[15]的研究表明，若在桑葚貯藏期內(nèi)使用納他霉素，果實(shí)的腐爛率、丙二醛含量及多酚氧化酶活性均降低，而總酸含量、表面顏色、硬度則在一定程度上得到保持。Jiao 等[16]以不同濃度ε-聚賴氨酸處理已接種灰霉菌的草莓、葡萄、青椒等果蔬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸抑制灰霉菌的效果隨其濃度升高而逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，Oliveira 等[17]也曾證明Nisin 在桃子、芒果、番石榴等果汁中可維持穩(wěn)定至少30 d，同時(shí)還可顯著緩解各果汁維生素C含量的下降。隨著微生物源抗菌肽在食品工業(yè)中的迅速發(fā)展，枯草芽孢桿菌因抗菌活性物質(zhì)豐富、芽孢耐逆抗熱而成為該領(lǐng)域的重要資源[18]。然而，針對(duì)枯草芽孢桿菌抗菌肽應(yīng)用于黃瓜汁的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究采用感官評(píng)價(jià)、理化分析及電子鼻技術(shù)，探究不同濃度海洋源枯草芽孢桿菌抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁貯藏期的影響，以期為鮮榨黃瓜汁的保鮮與加工提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

新鮮黃瓜、布丁瓶 廣東省湛江市湖光市場(chǎng)；枯草芽孢桿菌（B. subtilisBBW 1542；NCBI 登錄號(hào)：OP 508726） 中國(guó)南海北部灣海域湛江港分離所得；乙型副傷寒沙門氏菌（SalmonellaParatyphiβ；編號(hào)：CICC 10437） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、酵母浸粉 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；蛋白胨 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖、蔗糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、山梨酸鉀 上海麥克林生化科技有限公司；苯酚、硫酸

國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

YXQ-100 A 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BPMJ-150 F 生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)有限公司；ZWYR-2102 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；KDC-160 HR 高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Alpha Clean 1300 潔凈工作臺(tái) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；MJ-PB80 Easy 210 B 破壁料理機(jī)廣東美的生活電器制造有限公司；UV-5800 P 紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；RE-5800 PC 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HI 2210 哈納臺(tái)式pH-溫度測(cè)定儀 北京嘉華眾信科技有限公司；Portable Electronic Nose Pen 3 電子鼻 德國(guó)Aisense科學(xué)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌肽的制備 按蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鎂2.1 g/L、硫酸鎂4.2 g/L、氯化鉀0.9 g/L、氯化鈣1.2 g/L、氯化鈉36.5 g/L、pH7.0～7.2，配制種子培養(yǎng)液，121 ℃滅菌20 min，冷卻。在無(wú)菌條件下，使用1 μL 接種環(huán)刮取一環(huán)枯草芽孢桿菌BBW 1542 菌苔接入50 mL/250 mL 上述培養(yǎng)液中，170 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h 即得種子液。按葡萄糖30 g/L、蔗糖30 g/L、蛋白胨20 g/L、硫酸銨2 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂1 g/L、硫酸錳0.01 g/L、硫酸鋅0.01 g/L、pH7.0～7.2，配制發(fā)酵培養(yǎng)液，121 ℃滅菌20 min，冷卻。種子液以2%（v/v）接種量接入40 mL/250 mL 的發(fā)酵培養(yǎng)液中，170 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 即得發(fā)酵液。取1 L 發(fā)酵液10000 r/min、4 ℃離心10 min，棄除菌體，所得上清液70 r/min、50 ℃恒溫旋蒸，直至濃縮物與原上清液體積比為1：6。設(shè)定濃縮后體積為初始抑菌濃度100%（濃縮物/無(wú)菌水：v/v），采用二倍稀釋法連續(xù)稀釋，測(cè)得該抗菌肽對(duì)Salmonellaparatyphi β的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為3.125%（v/v）[19]。

1.2.2 鮮榨黃瓜汁的制備 將布丁瓶洗凈，121 ℃滅菌，編號(hào)備用。挑選大小、成熟度一致、無(wú)明顯物理?yè)p傷和無(wú)病害的新鮮黃瓜，洗凈去皮、去蒂，切成小塊，1 min 榨汁處理。參考王瀟棟、康蘇等[20-21]的方法，黃瓜形成勻漿液后滅菌雙層紗布連續(xù)過(guò)濾2 次，除去殘?jiān)?5 ℃水浴30 min，立即轉(zhuǎn)至4 ℃冰浴，取上清濾液分裝至無(wú)菌布丁瓶。每支布丁瓶額外添加0.5 mL 相同濃度的乙型副傷寒沙門氏菌懸液（OD600=0.015），并以5 種不同方式處理（如表1），每種處理3 個(gè)平行。單支布丁瓶液體總體積為45 mL，處理結(jié)束后封蓋，均勻混合，室溫25±2 ℃下保藏。貯藏周期為5 d，每隔24 h 取樣測(cè)定。

表1 鮮榨黃瓜汁的五種不同處理方式Table 1 Five different treatments of freshly squeezed cucumber juice

1.2.3 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)是研究食品品質(zhì)的常用手段，可評(píng)定果汁在貯藏期間的品質(zhì)變化。參考唐曉姝等[22]方法并稍作修改，挑選10 位具感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人員組成參評(píng)小組，針對(duì)不同處理組黃瓜汁貯藏第5 d 的色澤（3 分）、澄清度（3 分）、香氣（3 分）依次打分，滿分為9 分，收集各項(xiàng)評(píng)分結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析。鮮榨黃瓜汁的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。

表2 鮮榨黃瓜汁感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards for freshly squeezed cucumber juice

1.2.4 穩(wěn)定系數(shù)測(cè)定 穩(wěn)定系數(shù)測(cè)定參照白鳳岐[23]、韓冬屏等[24]方法并稍作修改。穩(wěn)定系數(shù)為離心后濁度與離心前濁度的比值，并與果汁品質(zhì)成正比，即穩(wěn)定系數(shù)越接近1，果汁體系越穩(wěn)定[25]。每隔24 h分別從五個(gè)處理組吸取4 mL 黃瓜汁，稀釋兩倍，混勻，于650 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；另從五個(gè)處理組分別吸取40 mL 黃瓜汁樣品，4000 r/min、4 ℃離心5 min，上清液稀釋兩倍，混勻，于650 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。每組試驗(yàn)重復(fù)三次，按如下公式計(jì)算穩(wěn)定系數(shù)。

式中：Sc（Stability coefficient）為穩(wěn)定系數(shù)；Abs650后為離心后樣品的吸光度；Abs650前為離心前樣品的吸光度。

1.2.5 總糖含量測(cè)定 總糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[26]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出葡萄糖的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）與吸光度（Y）的線性關(guān)系為：Y=31.19X+0.0151，R2=0.9925。每隔24 h 分別從五個(gè)處理組取樣測(cè)定，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 pH 測(cè)定 pH 測(cè)定參考NY 82.7—1988《果汁測(cè)定方法：pH 值的測(cè)定》[27]進(jìn)行，測(cè)定前使用pH4.0與pH7.0 的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液將pH 計(jì)校準(zhǔn)[28]。每隔24 h分別從五個(gè)處理組取樣測(cè)定，每組試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.7 菌落總數(shù)測(cè)定 果蔬汁中菌落總數(shù)的多少反映出其被細(xì)菌污染的程度。每隔24 h 分別從五個(gè)處理組吸取0.1 mL 樣品，經(jīng)梯度稀釋至一定濃度，取100 μL 稀釋液涂布于LB 固體培養(yǎng)基，37±1 ℃靜置培養(yǎng)12 h 后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每組試驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.2.8 揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定 揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定參考Zhu 等[29]的方法進(jìn)行。在第0 d 與第5 d 分別從五個(gè)處理組吸取10 mL 黃瓜汁樣品于50 mL 測(cè)量瓶?jī)?nèi)，使用3 層塑料膜密封，室溫靜置15 min，根據(jù)頂空抽樣法用電子鼻探頭吸取頂端氣體，測(cè)定五組鮮榨黃瓜汁風(fēng)味組分。試驗(yàn)參數(shù)：采樣間隔1 s，沖洗時(shí)間60 s，調(diào)零時(shí)間10 s，預(yù)采樣時(shí)間5 s，檢測(cè)時(shí)間180 s，載氣流速250 mL/min，進(jìn)樣流速250 mL/min。檢測(cè)時(shí)傳感器于120 s 后趨于穩(wěn)定，選取120～125 s為信號(hào)采集時(shí)間，環(huán)境溫度26±1 ℃，每組重復(fù)測(cè)定5 次。PEN 3 電子鼻共有10 個(gè)不同的金屬氧化物傳感器，各傳感器的相應(yīng)特性見表3。

表3 PEN 3 型傳感器陣列及性能描述Table 3 PEN 3 sensor array and performance description

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 采集數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果。通過(guò)SPSS 21.0 程序軟件統(tǒng)計(jì)分析，在置信區(qū)間（P＜0.05）內(nèi)，根據(jù)單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。組間差異用a/b 表示，通過(guò)電子鼻中Win Muster 軟件完成PCA 分析，利用Origin 2019 b 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁的感官評(píng)價(jià)

五組鮮榨黃瓜汁貯藏第5 d 的感官評(píng)價(jià)得分如表4 所示。整體來(lái)看，黃瓜汁中添加微生物源抗菌肽或化學(xué)保鮮劑的總分均顯著高于對(duì)照組總分（P＜0.05），其中組織狀態(tài)和香氣得分與抗菌肽濃度呈正相關(guān)。當(dāng)抗菌肽濃度為2×MIC 時(shí)，鮮榨黃瓜汁的組織狀態(tài)評(píng)分最高，為2.70±0.08，同時(shí)保持特有的清香風(fēng)味，兩者與其他處理組均存在顯著性差異（P＜0.05）。就色澤來(lái)說(shuō)，2×MIC 濃度抗菌肽的單項(xiàng)得分較低，這可能是添加過(guò)高濃度抗菌肽時(shí)，其本身顏色對(duì)黃瓜汁體系存在一定影響。根據(jù)不同處理方式對(duì)鮮榨黃瓜汁開展感官評(píng)價(jià)，得出2×MIC 抗菌肽處理組總分最高，但較難以添加抗菌肽對(duì)黃瓜汁品質(zhì)直接判別，仍需從具體理化指標(biāo)深入論證分析。

表4 鮮榨黃瓜汁的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of freshly squeezed cucumber juice

2.2 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁pH 的影響

pH 變化決定果蔬汁貯藏期內(nèi)的酸敗程度，進(jìn)而影響本身口感[30]。從圖1 可知，五組黃瓜汁貯藏期內(nèi)（0～5 d）的變化趨勢(shì)基本一致，即pH 隨著貯藏時(shí)間增加而逐漸下降。其中，組一（對(duì)照組）的pH 值由5.5 降至4.0，下降幅度最大，為26.14%。一般情況下，果蔬汁酸敗變質(zhì)由微生物所導(dǎo)致，推測(cè)未處理黃瓜汁中存在微生物大量生長(zhǎng)繁殖現(xiàn)象，酸性代謝產(chǎn)物不斷累積，從而引起貯藏過(guò)程中pH 持續(xù)下降[31]。組二（1/2×MIC）pH 在貯藏期第1 d 略微降低，最終pH4.15 與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05），這表明1/2×MIC 濃度抗菌肽對(duì)黃瓜汁中微生物的抑制作用相對(duì)較弱，貨架期延長(zhǎng)時(shí)間有限。貯藏中后期（3～5 d），組三（1×MIC）、組四（2×MIC）的pH 區(qū)間與組一、組二逐漸分開，呈現(xiàn)出相對(duì)平緩的下降趨勢(shì)，最終pH分別為4.75、4.97，下降幅度分別為13.16%、9.3%。比對(duì)化學(xué)保鮮劑處理組（山梨酸鉀），整個(gè)貯藏期間pH 的下降幅度為15.81%，這與抗菌肽濃度為1×MIC的作用效果相似。結(jié)果表明，高濃度抗菌肽（≥1×MIC）對(duì)黃瓜汁中微生物抑制作用較強(qiáng)，更有利于延緩鮮榨黃瓜汁酸敗，其中1×MIC 抗菌肽與0.05%（w/v）山梨酸鉀具有延緩黃瓜汁酸敗的同等效果。根據(jù)顧晨濤的研究，在鮮榨黃瓜汁中添加濃度為0.05～0.5%（w/v）的魚鱗抗菌肽粗提物，其常溫貯藏期間pH 下降幅度隨魚鱗抗菌肽濃度的升高而降低，此規(guī)律與本試驗(yàn)現(xiàn)象相一致[32]。

圖1 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁pH 的影響Fig.1 Effect of the antibacterial peptide from B. subtilis BBW1542 on pH of freshly squeezed cucumber juice

2.3 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁穩(wěn)定系數(shù)的影響

混濁或體系不穩(wěn)定現(xiàn)象是導(dǎo)致鮮榨果蔬汁出現(xiàn)質(zhì)量缺陷的主要原因，它影響著消費(fèi)者可接受性，同時(shí)也是目前飲品規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵難題[33]。圖2 結(jié)果表明，各組黃瓜汁穩(wěn)定系數(shù)隨著貯藏時(shí)間增加而逐漸下降。貯藏第1 d，五組黃瓜汁穩(wěn)定系數(shù)在52%～58%內(nèi)。貯藏第5 d，組一（對(duì)照組）穩(wěn)定系數(shù)急劇下降至低水平，僅有10.05%，下降幅度達(dá)到80.71%。這可能是由于鮮榨黃瓜汁經(jīng)微生物污染后，菌體與果汁中果膠、纖維素等其他懸浮顆粒產(chǎn)生碰撞出現(xiàn)聚集下沉現(xiàn)象，果汁穩(wěn)定體系被破壞，從而造成穩(wěn)定系數(shù)下降[34]。相比之下，組二（1/2×MIC）、組三（1×MIC）、組五（山梨酸鉀）的穩(wěn)定系數(shù)在貯藏第5 d 分別保留17.09%、21.94%、13.82%，下降幅度依次為69.02%、59.68%、73.35%。根據(jù)上述變化可看出，無(wú)論添加抗菌肽或山梨酸鉀在一定程度上均能維持鮮榨黃瓜汁的懸浮穩(wěn)定性。當(dāng)抗菌肽濃度升高至2×MIC 時(shí)，黃瓜汁在貯藏第5 d 的穩(wěn)定系數(shù)仍保持32.86%，下降幅度縮小至44.56%。以上結(jié)果表明，與山梨酸鉀（0.05% w/v）相比，添加海洋微生物源抗菌肽（1/2～2×MIC）更有利于維持鮮榨黃瓜汁的體系穩(wěn)定，隨著抗菌肽濃度在一定范圍內(nèi)增加，穩(wěn)定效果也不斷增強(qiáng)。

圖2 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁穩(wěn)定系數(shù)的影響Fig.2 Effect of the antibacterial peptide from B. subtilis BBW1542 on stability coefficient of freshly squeezed cucumber juice

2.4 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁總糖含量的影響

鮮榨黃瓜汁中大量的營(yíng)養(yǎng)成分有助于微生物生長(zhǎng)，其中糖類作為一種必要呈味物質(zhì)，可同時(shí)衡量果蔬汁品質(zhì)與口感。由圖3 可知，整個(gè)貯藏期內(nèi)各組鮮榨黃瓜汁的總糖含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。貯藏第5 d，組一（對(duì)照組）的總糖濃度由17.40 mg/mL降至0.52 mg/mL，下降幅度為97.01%，這說(shuō)明微生物滋生導(dǎo)致黃瓜汁中糖類被大量消耗而迅速降低[35]。與對(duì)照組相比，添加山梨酸鉀或抗菌肽均能在一定程度上緩解此現(xiàn)象。當(dāng)以山梨酸鉀處理，5 d 后鮮榨黃瓜汁的總糖含量為2.76 mg/mL，下降幅度81.65%。當(dāng)以1×MIC 抗菌肽濃度處理，黃瓜汁總糖含量最終為3.78 mg/mL，下降幅度78.02%，該含量顯著高于（P＜0.05）對(duì)照組（0.52 mg/mL）與1/2×MIC 抗菌肽處理組（2.49 mg/mL），同時(shí)下降幅度與山梨酸鉀處理的作用效果相似（下降幅度81.65%）。將抗菌肽濃度升高至2×MIC 時(shí)，總糖含量最終為5.11 mg/mL，下降幅度僅為70.62%，由此發(fā)現(xiàn)，升高抗菌肽濃度有利于延緩黃瓜汁總糖含量的下降趨勢(shì)。通常情況下，果蔬汁中添加抗菌肽是降低其微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的有效措施之一。根據(jù)何成霞[36]研究，橙汁65 ℃水浴后滴加1 mL 大腸桿菌菌懸液，并以天蠶素抗菌肽Cecropin A 處理，120 h 貯藏期后發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的總糖含量迅速下降至低水平，同時(shí)抗菌肽處理組的總糖含量顯著高于（P＜0.05）對(duì)照組，這與本研究結(jié)果相一致。以上結(jié)果表明，將抗菌肽應(yīng)用于果蔬汁中可通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)與繁殖而降低微生物對(duì)糖的利用率，最終緩解果蔬汁的營(yíng)養(yǎng)損失。

圖3 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁總糖含量的影響Fig.3 Effect of the antibacterial peptide from B. subtilis BBW1542 on total sugars content of freshly squeezed cucumber juice

2.5 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，可反應(yīng)果汁的新鮮程度。圖4 結(jié)果表明，各組鮮榨黃瓜汁中菌落總數(shù)呈現(xiàn)先上升（前3 d）后下降（后2 d）的波動(dòng)趨勢(shì)。貯藏期第1 d，四個(gè)處理組的菌落總數(shù)低于組一（對(duì)照組），其中組三（1×MIC）與組四（2×MIC）并無(wú)顯著差異（P＞0.05），這表明此時(shí)兩種濃度對(duì)黃瓜汁中病原菌的抑制效果相似。第2 d，對(duì)照組黃瓜汁中菌落總數(shù)達(dá)到7.36 lg CFU/mL，2×MIC抗菌肽處理組的菌落總數(shù)僅為6.48 和0.88 lg CFU/mL 的微生物被抑制生長(zhǎng)。貯藏至第3 d，對(duì)照組黃瓜汁中菌落總數(shù)達(dá)到最大生長(zhǎng)濃度8.46 lg CFU/mL，2×MIC 抗菌肽處理組黃瓜汁中菌落總數(shù)為7.75 和0.71 lg CFU/mL 的微生物被抑制生長(zhǎng)。對(duì)比化學(xué)保鮮劑處理組（山梨酸鉀），其菌落總數(shù)在第2 d 與第3 d 分別為6.29 和7.90 lg CFU/mL，分別產(chǎn)生1.07 和0.56 lg CFU/mL 的抑制作用，與同時(shí)期組四（2×MIC）的抑制效果無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)已有研究，Liang 等[37]在無(wú)果肉橘子汁、含果肉橘子汁及經(jīng)巴氏消毒的橘子汁中各添加0.1μg/mL Nisin，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)其中微生物菌落總數(shù)分別降低0.1、0.1 和1.5 log CFU/mL。Nguyen 等[38]在經(jīng)巴氏殺菌的番茄汁中添加4 μg/mL Nisin，發(fā)現(xiàn)原有微生物數(shù)量降低了0.85 lg CFU/mL。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)中抑菌效果相似。綜上，添加不同濃度抗菌肽或山梨酸鉀皆可降低微生物生長(zhǎng)量而延長(zhǎng)黃瓜汁的貯藏期，當(dāng)抗菌肽濃度升高，其抑制作用也逐漸增強(qiáng)，其中濃度為2×MIC 的抗菌肽抑制效果最佳。結(jié)合圖1，各組鮮榨黃瓜汁的初始pH 由5.5 左右隨貯藏時(shí)間不斷下降，而絕大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的最適pH 為5～9。在低pH 或底物不足的情況下，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及相關(guān)代謝活動(dòng)會(huì)受到抑制或失活，這可能是貯藏期后2 d 各組黃瓜汁中菌落總數(shù)出現(xiàn)下降波動(dòng)趨勢(shì)的原因之一[39-40]。

圖4 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁菌落總數(shù)的影響Fig.4 Effect of the antibacterial peptide from B. subtilis BBW1542 on bacterial colony number of freshly squeezed cucumber juice

2.6 枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用電子鼻技術(shù)對(duì)五組鮮榨黃瓜汁的揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5～圖7 所示。由主成分分析（圖5）可知，第1 主成分貢獻(xiàn)率為98.57%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為0.91%，兩者累積貢獻(xiàn)率占99.48%，這表明數(shù)據(jù)覆蓋了五組黃瓜汁樣品的絕大部分信息，可有效代表黃瓜汁中揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。圖5 中橢圓形表示各組黃瓜汁貯藏至第5 d 時(shí)的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)，數(shù)據(jù)點(diǎn)分散程度越大，組間區(qū)分越明顯，表明不同處理方式對(duì)五組鮮榨黃瓜汁揮發(fā)性成分產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.05）。根據(jù)數(shù)據(jù)點(diǎn)在圖中的分布距離分析，五組黃瓜汁樣品差異主要在PC1 方向，其中對(duì)照組與山梨酸鉀處理組距離相近，貢獻(xiàn)率低，說(shuō)明兩者風(fēng)味特征較相似；2×MIC、1×MIC、1/2×MIC 抗菌肽處理組采集點(diǎn)分布以高濃度從左依次往右，貢獻(xiàn)率均大于40%，推測(cè)三者存在規(guī)律性的風(fēng)味特征。

圖5 鮮榨黃瓜汁的主成分分析（第5 d）Fig.5 Principal component analysis of freshly squeezed cucumber juice (the 5th day)

圖6（a）為五組鮮榨黃瓜汁第0 d 風(fēng)味化合物的電子鼻雷達(dá)圖，各組黃瓜汁的風(fēng)味輪廓相似，特征氣味高度重合，信號(hào)傳感器中最敏感組分是R7（硫化物）與R2（氮氧化物），推測(cè)貯藏前期黃瓜汁的主要風(fēng)味物質(zhì)為硫化物和氨氧化物。圖6（b）為五組鮮榨黃瓜汁第5 d 風(fēng)味化合物的電子鼻雷達(dá)圖，相比貯藏前期，對(duì)照組與山梨酸鉀處理組的風(fēng)味物質(zhì)基本不變，抗菌肽處理組的風(fēng)味物質(zhì)更為豐富。具體表現(xiàn)為，芳香成分（R1）、氮氧化物（R2）、氫氣（R4）、甲烷（R6）、硫化物（R7）、醇類、醛酮類及部分芳香成分（R8）6 個(gè)傳感器的響應(yīng)值產(chǎn)生明顯變化，其中R1 和R8 屬于對(duì)風(fēng)味影響較好的芳香化合物，R7 則可能對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響[41]。

圖6 鮮榨黃瓜汁的風(fēng)味變化（第0 d 與第5 d）Fig.6 Flavor changes of freshly squeezed cucumber juice (the 0th day and the 5th day)

香氣成分的保留與果蔬汁新鮮度密切相關(guān)，不良的風(fēng)味物質(zhì)則導(dǎo)致其品質(zhì)下降[42]。為明確抗菌肽濃度對(duì)鮮榨黃瓜汁風(fēng)味保真的影響，針對(duì)各組的主要風(fēng)味成分與相對(duì)響應(yīng)值進(jìn)一步比較。如圖7，貯藏后期各組傳感器累積響應(yīng)值從大到小依次為：組二（1/2×MIC）＞組三（1×MIC）＞組四（2×MIC）＞組一（對(duì)照組）＞組五（山梨酸鉀）。根據(jù)已有研究，黃瓜汁經(jīng)貯藏5 d 后產(chǎn)生明顯變化的揮發(fā)性成分為酯類、萜類、醇類及硫化物，氫氣和甲烷很少檢出[43]。對(duì)應(yīng)本試驗(yàn)中傳感器R4（對(duì)氫氣有選擇性）與R6（對(duì)甲烷靈敏），發(fā)現(xiàn)兩者的變化主要出現(xiàn)在抗菌肽處理組，推測(cè)可能是抗菌肽濃縮物本身存在的氣味，因此對(duì)其他4 類相對(duì)響應(yīng)值深入分析。就R1（芳香成分）與R8（醇類、醛酮類及部分芳香成分）響應(yīng)值而言，貯藏至第5 d，1/2×MIC 抗菌肽處理組的響應(yīng)值分別為7.33、25.82，是貯藏第0 d 的3.23、5.75 倍；1×MIC 組的為6.44、19.79，是貯藏第0 d 的2.41、2.93 倍。同樣第5 d，2×MIC 抗菌肽處理組的響應(yīng)值為4.92、9.55，對(duì)照組的為3.45、8.96，而山梨酸鉀組僅有2.52、4.97，三組相對(duì)響應(yīng)值較貯藏第0 d 均只增加1 倍左右。研究表明，眾多源于黃瓜的風(fēng)味物質(zhì)只起輔助或調(diào)和作用，僅有反,順-2, 6-壬二烯醛與反，順-2, 6-壬二烯醇具有黃瓜香氣[44]。其中，反,順-2, 6-壬二烯醛是公認(rèn)的特征香氣物質(zhì)，可對(duì)黃瓜清香風(fēng)味形成有重要作用[45]。結(jié)合電子鼻性能描述（表3），推斷傳感器R8（醇類、醛酮類及部分芳香成分）對(duì)應(yīng)風(fēng)味成分與這類香氣物質(zhì)密切相關(guān)。同時(shí)，R1 對(duì)應(yīng)化合物可對(duì)風(fēng)味產(chǎn)生積極影響[41]。綜合比較各組的R1、R8相對(duì)響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)1/2×MIC 濃度抗菌肽的相對(duì)響應(yīng)值較貯藏前期增加倍數(shù)最高，說(shuō)明該濃度對(duì)黃瓜汁的香氣醇厚最有利，其次是1×MIC 抗菌肽、2×MIC 抗菌肽，而山梨酸鉀則對(duì)該作用甚微。

圖7 鮮榨黃瓜汁的主要風(fēng)味成分響應(yīng)值比較（第0 d 與第5 d）Fig.7 Comparison of the response values of principal components of freshly squeezed cucumber juice(the 0th day and the 5th day)

就R2（氮氧化物）與R7（硫化物）的相對(duì)響應(yīng)值而言，貯藏至第5 d，1/2×MIC 抗菌肽處理組的分別為36.28、56.16，是貯藏第0 d 的6 倍、1.8 倍；1×MIC組的分別為26.87、38.46，是貯藏第0 d 的3.02 倍、0.86 倍。相比之下，第5 d 時(shí)2×MIC 組的為23.96、38.56，對(duì)照組的為6.23、18.9，而山梨酸鉀組的僅有4.24、10.52，這三組的R7 響應(yīng)值均低于貯藏第0 d。已有報(bào)道，與傳感器R7 相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)食物存在負(fù)面影響[41]。綜合以上結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生了一定的影響，既會(huì)產(chǎn)生對(duì)黃瓜汁風(fēng)味有利的芳香成分如反,順-2, 6-壬二烯醛等，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一定的氮氧化物、硫化物等不利于黃瓜汁風(fēng)味的成分。

3 結(jié)論

本研究表明，在鮮榨黃瓜汁常溫貯藏過(guò)程中添加海洋微生物源抗菌肽可有效改善黃瓜汁酸敗、體系不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失等問(wèn)題。與對(duì)照組相比，抗菌肽處理組可有效延緩鮮榨黃瓜汁pH、穩(wěn)定系數(shù)、總糖含量的下降，并可有效抑制微生物的生長(zhǎng)，其中2×MIC 濃度抗菌肽的作用效果最為顯著。同時(shí)，抗菌肽對(duì)鮮榨黃瓜汁中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生了一定的影響，既會(huì)產(chǎn)生對(duì)黃瓜汁風(fēng)味有利的芳香成分如反,順-2,6-壬二烯醛等，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一定的氮氧化物、硫化物等不利于黃瓜汁風(fēng)味的成分。綜合比較不同濃度海洋微生物源抗菌肽與化學(xué)保鮮劑（0.05%w/v 山梨酸鉀），發(fā)現(xiàn)該類抗菌肽的作用效果優(yōu)于山梨酸鉀，尤其在風(fēng)味保真方面更佳。由此可見，枯草芽孢桿菌BBW1542 抗菌肽具有良好的應(yīng)用前景，有望替代傳統(tǒng)化學(xué)保鮮劑為果蔬汁短期貯藏品質(zhì)提供保障，同時(shí)為天然保鮮劑開發(fā)應(yīng)用與活性肽挖掘鑒定提供理論依據(jù)與價(jià)值參考。然而，目前該抗菌肽所產(chǎn)活性物質(zhì)的種類結(jié)構(gòu)及其相關(guān)抑菌機(jī)理尚不清晰，有待進(jìn)一步深入研究。