楊子祥，李金夢(mèng)，宋琨燕，葛風(fēng)茹，鄢烽，黃冰冰，張夢(mèng)巖，巫小丹，劉玉環(huán)，鄭洪立（南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047）

海洋占地球總面積約71%，海洋占地球全部水資源的97%，海洋中生物資源豐富，種類繁多。海洋多糖是海洋生物資源中最主要的組成成分之一。由于海洋高鹽、高滲透壓、低溫、低光照、寡營(yíng)養(yǎng)、氧脅迫的特殊環(huán)境，形成了結(jié)構(gòu)新穎和功能獨(dú)特的海洋多糖[1]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)海洋資源的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)海洋多糖具有調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性，這使其越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[2]。然而，由于海洋多糖分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致了海洋多糖溶解性能差，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用[3]。

海洋寡糖，也叫海洋低聚糖，是海洋多糖經(jīng)過(guò)各種方法（物理法、化學(xué)法、酶法等）降解得到的直鏈或支鏈低度聚合糖，通常由2～10 個(gè)單糖單元組成。較海洋多糖，海洋寡糖具有溶解性能好、生理活性高、更具多樣性等優(yōu)勢(shì)，是二十一世紀(jì)糖類研究的熱點(diǎn)。由于海洋寡糖原料海洋多糖結(jié)構(gòu)和組成的多樣性，外加海洋寡糖有不同的制備方法，故海洋寡糖結(jié)構(gòu)和生理活性更具多樣性[4]。海洋寡糖具有抑制腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，安全無(wú)毒，溶解性能好，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5]。海洋寡糖具有糖醇類似的功能性甜味，且熱量較低，可用作食品甜味劑。此外，海洋寡糖難以被人體消化，可滿足糖尿病患者的需要。海洋寡糖是一種新型益生元，具有改善腸道微環(huán)境的作用[6]。海洋寡糖因具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆性、防治病害等作用，被廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。海洋寡糖可以通過(guò)刺激和激活宿主細(xì)胞的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用[7]。

海洋寡糖的生物活性主要與其分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，分子結(jié)構(gòu)主要受海洋多糖的種類、海洋寡糖制備方法、制備海洋寡糖的酶等因素影響，而制備結(jié)構(gòu)新穎、聚合度明確的海洋寡糖，對(duì)于海洋寡糖的應(yīng)用具有重要意義。本文綜述了海洋多糖、海洋多糖酶法制備海洋寡糖和酶的催化機(jī)制，介紹了褐藻膠、殼聚糖和黃原膠三種主要的海洋多糖及褐藻膠裂解酶、殼聚糖酶和黃原膠降解酶的作用機(jī)制，并指出其存在的問(wèn)題及今后的研究重點(diǎn)，以期為海洋寡糖制備及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 海洋多糖

海洋多糖種類繁多（表1），包括海藻多糖、海洋動(dòng)物多糖和海洋微生物多糖等[8]。海藻多糖是廣泛存在于海帶、馬尾藻、昆布等植物中的天然活性多糖，多具有高粘度或凝固能力。海洋動(dòng)物多糖是指海洋動(dòng)物（蝦、貝類、螃蟹、鯊魚、海參等）中的多聚糖及酸性粘多糖，主要包括殼聚糖、糖胺聚糖、硫酸軟骨素等。海洋微生物多糖是指海洋中的微生物代謝的多糖，分為胞外多糖、胞壁多糖和胞內(nèi)多糖。我國(guó)海洋多糖資源豐富，已廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，如褐藻膠作為增稠劑、分散劑、乳化劑等應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[9]。隨著越來(lái)越多海洋多糖資源的發(fā)掘以及海洋生物技術(shù)的發(fā)展，如利用工程細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)海洋多糖，將不斷豐富海洋多糖資源。眾多的海洋多糖為海洋寡糖的制備提供了豐富的原料資源[10]。生產(chǎn)寡糖較多的海洋多糖原料有黃原膠、殼聚糖、瓊脂、卡拉膠、褐藻膠、巖藻聚糖等。我國(guó)是世界最大的褐藻膠（海藻酸鈉）生產(chǎn)國(guó)[11]，殼聚糖是地球上年產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的天然高分子化合物[12]，黃原膠是目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的微生物多糖[13]，故本文選取褐藻膠、殼聚糖和黃原膠為代表性海藻多糖、海洋動(dòng)物多糖和海洋微生物多糖進(jìn)行研究。

表1 海洋多糖Table 1 Marine polysaccharides

1.1 褐藻膠

褐藻膠又叫褐藻酸，分子量介于20～250 kDa 之間[20]。褐藻膠是廣泛存在于海帶、巨藻、馬尾藻等褐藻細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)間的一種海藻多糖，在天然狀態(tài)下主要以游離酸、一價(jià)鹽和二價(jià)鹽的形式存在。β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）以1→4 糖苷鍵構(gòu)成線性多糖即為褐藻膠[20]。以上線性多糖有均聚甘露糖醛酸（PM）、均聚古羅糖醛酸（PG）和雜聚物（PMG）三種排列方式[21]（圖1）。這兩種糖醛酸的比例因褐藻種類的不同而有很大差異，這種結(jié)構(gòu)的多樣性可能是由于褐藻對(duì)環(huán)境或生理?xiàng)l件的功能適應(yīng)性[23]。早在1881 年，英國(guó)的化學(xué)家Stanford 首次在褐藻中發(fā)現(xiàn)并成功分離出褐藻膠[24]。目前市售的褐藻酸鈉（又叫海藻酸鈉）是以海帶等為原料，采用稀堿溶液提取法制備得到。褐藻酸鈉具有抗氧化性、抑菌性、抗腫瘤、降膽固醇等生理活性，用作食品添加劑、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的支架材料、農(nóng)藥化肥增效劑等[25-27]。褐藻中褐藻膠的含量最高可達(dá)藻體干重的40%[28]。褐藻膠為親水性分子，褐藻酸與堿金屬離子生成褐藻酸鹽，易溶于水。褐藻膠的溶解性受PM、PG 和PMG的排列方式、M/G 的比例、溶液離子強(qiáng)度、pH 等的影響[21,23]。褐藻膠為酸不溶性，在pH 低于3 時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楹衷逅岫龀鯷23]。

圖1 褐藻膠的結(jié)構(gòu)式[22]Fig.1 Structural formula of alginate[22]

1.2 殼聚糖

殼聚糖是一種廣泛存在于蝦、螃蟹、貝殼等海洋節(jié)肢動(dòng)物的甲殼以及海洋軟體動(dòng)物的殼和骨骼中的海洋動(dòng)物多糖，純天然有機(jī)大分子，是甲殼素脫去乙?；?。殼聚糖也是目前大自然中發(fā)現(xiàn)的獨(dú)一無(wú)二帶正電荷的大分子堿性多糖[29]。它的基本糖單元為氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖（圖2），起連接作用的鍵為β-1,4-糖苷鍵。殼聚糖的單體為β-（1→4）-2-氨基-2-脫氧b-d-葡聚糖和β-（1→4）-2-乙酰氨基-2-脫氧-b-d-葡聚糖，分子量介于10～1 000 kDa 之間；殼聚糖溶于稀酸，不溶于水和有機(jī)溶劑；殼聚糖在稀酸中的溶解性與其脫乙酰度呈正相關(guān)[30]。它的表面含有大量的氨基、羥基等活性基團(tuán)，可以發(fā)生烷基化、?；?、羧基化等多種化學(xué)反應(yīng)，能與碳水化合物等陰離子或高分子化合物形成具有不同性能的殼聚糖衍生物。殼聚糖有免疫調(diào)節(jié)[31]、防治高血壓[32]、抗腫瘤[33]等生理活性，可自然降解，已在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

圖2 殼聚糖的結(jié)構(gòu)式[30]Fig.2 Structural formula of chitosan[30]

1.3 黃原膠

黃原膠，又稱為黃膠、漢生膠。它是海洋微生物代謝的一種水溶性胞外多糖。黃原膠分子（圖3）是由D-葡萄糖、D-甘露糖和D-葡糖醛酸組成。以上三種成分按2:2:1 組成相對(duì)分子量在1000 kDa 以上的天然有機(jī)高分子化合物[19]。黃原膠一級(jí)結(jié)構(gòu)含葡糖基主鏈和三糖單位的側(cè)鏈，葡糖基主鏈與纖維素主鏈結(jié)構(gòu)相同，即β-1，4-糖苷鍵連接兩分子D-葡萄糖；1 分子D-葡糖醛酸和2 分子D-甘露糖在側(cè)鏈中交替排列，與主鏈相連的甘露糖在C-6 處被乙?；?，丙酮酸部分替代側(cè)鏈末端的甘露糖，并以縮醛形式連接在4-和6-位置；其二級(jí)結(jié)構(gòu)為雙螺旋結(jié)構(gòu)，在氫鍵作用下，側(cè)鏈反向纏繞主鏈而形成；其三級(jí)結(jié)構(gòu)為螺旋復(fù)合體，在共價(jià)鍵的作用下，由二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成，正因這種特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使黃原膠溶液具有良好的耐鹽性、耐酸耐堿性、協(xié)同凝膠特性、獨(dú)特的流變性等[13]。因此，黃原膠作為增稠劑、穩(wěn)定劑等在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等大范圍使用。黃原膠是目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的微生物多糖[13]。

2 酶法制備海洋寡糖

海洋寡糖的制備方法主要有化學(xué)法、物理法和生物酶法（表2）?；瘜W(xué)法是通過(guò)化學(xué)催化劑如草酸、過(guò)氧化氫、氫氧化鈉等催化海洋多糖生成寡糖的方法，化學(xué)法應(yīng)用廣泛，操作簡(jiǎn)便，是一種成熟的方法。但它存在化學(xué)催化劑污染環(huán)境、反應(yīng)條件劇烈、副產(chǎn)物量大等缺點(diǎn)[34-36]。物理法（微波輻射、紫外線照射、高溫高壓等）操作簡(jiǎn)便、不需要催化劑，但存在降解效率低下、海洋寡糖得率低等問(wèn)題[37-39]。生物酶法條件溫和、酶專一性強(qiáng)、海洋寡糖得率高、不產(chǎn)生副產(chǎn)物、環(huán)境友好，是制備海洋寡糖的有效方法[40-42]。早期生物酶法制備海洋寡糖以游離酶法為主，目前生物酶法制備海洋寡糖主要采用固定化酶法。游離酶法和固定化酶法通常均采用單一酶，而不是復(fù)合酶[40-46]。當(dāng)前酶法制備得到的海洋寡糖主要有：殼寡糖[6]、褐藻膠寡糖[7,9,35]、卡拉膠寡糖、黃原膠寡糖、瓊膠寡糖等[42]。

表2 海洋寡糖制備方法Table 2 The preparation methods of marine oligosaccharides

2.1 游離酶法制備海洋寡糖

游離酶法制備海洋寡糖是以海洋多糖為原料。海洋多糖種類眾多，而酶催化具有高度專一性，故制備海洋寡糖的酶種類眾多；包括一類是降解特定的海洋多糖如褐藻膠裂解酶、殼聚糖酶、黃原膠降解酶、卡拉膠酶、瓊膠酶等，另一類降解非特定的海洋多糖，如：淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、甘露糖酶等，以上酶主要來(lái)自微生物。酶法制備海洋寡糖始于上世紀(jì)50 年代中后期，其目的主要是為了研究海洋寡糖的結(jié)構(gòu)與構(gòu)效關(guān)系以開發(fā)藥物和功能性制品。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，利用游離酶制備海洋寡糖已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展；特別在新酶的發(fā)現(xiàn)、酶結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的解析、酶的改造、酶催化條件的優(yōu)化等方面做了大量的研究[40-41,47]。

不同酶作用于不同的海洋多糖，其反應(yīng)條件和產(chǎn)物不同。Falkeborg 等[27]利用β-褐藻膠裂解酶催化5%褐藻酸鈉，反應(yīng)條件：酶用量5%、溫度35 ℃、pH7.0、酶解時(shí)間48 h，產(chǎn)物為聚合度不大于4 的寡糖。季珂等[48]以殼聚糖酶催化1%殼聚糖，反應(yīng)條件：酶用量120 U/g、溫度50 ℃、pH6.0、酶解時(shí)間4 h，制備得到的寡糖聚合度不大于4。谷金蕓等[49]以黃原膠降解酶催化2 mg/mL 的黃原膠，酶解條件：酶用量1 mg/mL、溫度45 ℃、pH8.0、酶解時(shí)間2 min，得到了黃原膠寡糖聚合度為7～18。同一酶，但不同類型，催化產(chǎn)物也不相同。β-褐藻膠裂解酶和雙功能褐藻膠裂解酶AlySY08 制備得到的寡糖聚合度不同。Li 等[50]利用雙功能褐藻膠裂解酶AlySY08 催化0.3%褐藻膠，酶解條件：酶用量21.5 U/mg、溫度40 ℃、pH7.6、酶解時(shí)間8 h，所制備的寡糖聚合度不大于5，寡糖得率超過(guò)80%。

游離酶法雖然降解效率高、可制得低分子量的海洋寡糖，但存在酶無(wú)法重復(fù)利用、易失活以及在均相催化中與底物/產(chǎn)物難以分離等缺點(diǎn)，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本提高，使游離酶法制備海洋寡糖在工業(yè)生產(chǎn)中嚴(yán)重受到限制[40-43]。

2.2 固定化酶法制備海洋寡糖

固定化酶技術(shù)是指使用物理或化學(xué)方法將游離酶限定在一定空間內(nèi)或完全束縛在某種特定的載體上，但仍能保持酶活性的一種生物技術(shù)[51]。與游離酶相比，固定化酶對(duì)不良環(huán)境耐受性更強(qiáng)，同時(shí)具有重復(fù)利用性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[46,52]。酶的固定化方法多種多樣，主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法（表3）。吸附法是指將酶分子吸附在纖維素、二氧化硅、活性炭、氧化鋁等載體表面從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法；吸附法成本低、操作簡(jiǎn)便，但固定化效率低[53]。包埋法是指將酶分子包裹在載體材料中從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法，常以海藻酸鈉、瓊脂等為載體材料[54]。酶通過(guò)戊二醛、京尼平等試劑交聯(lián)載體，從而達(dá)到固定化的方法稱為交聯(lián)法，交聯(lián)法常與吸附法聯(lián)用，提高酶的固定化效率及穩(wěn)定性，但在交聯(lián)過(guò)程中反應(yīng)劇烈，使得酶的活性降低，需要不斷探索更加溫和的固定化工藝來(lái)減少酶活損失[55]。共價(jià)結(jié)合法是指酶分子中的非必需側(cè)鏈基團(tuán)（氨基、羧基和巰基等）與載體中的功能基團(tuán)（環(huán)氧基、羥基、羧基等）通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，使酶分子固定在載體上的方法[56]。

表3 固定化酶制備方法Table 3 The preparation methods of immobilized enzyme

與游離酶相比，通過(guò)與其他載體材料結(jié)合，提高了固定化酶的穩(wěn)定性，且易與底物/產(chǎn)物分離，實(shí)現(xiàn)了酶的重復(fù)利用，極大地降低了生產(chǎn)成本，因此，固定化酶技術(shù)在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用前景廣闊，從而引發(fā)了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多糖降解酶固定化的探討。Jiang 等[57]用四氧化三鐵納米磁性材料為載體，固定化了褐藻膠裂解酶AlgL17，此固定化酶重復(fù)使用5 次后，仍能保持最大酶活的70%；利用其催化5 mg/mL 的褐藻膠，得到了聚合度不大于4 的褐藻寡糖。研究人員以戊二醛-瓊脂糖固定化了殼聚糖酶，固定化酶重復(fù)使用25 次后，仍能保持最大酶活的40%；利用該固定化酶催化20 mg/mL 的殼聚糖，得到的寡糖聚合度不大于20[58]。我國(guó)科學(xué)家已成功實(shí)現(xiàn)了納米SiO2材料固定化幾丁質(zhì)酶，固定化酶的活力是未固定化酶的70%；該固定化酶可用于催化真菌多糖幾丁質(zhì)產(chǎn)生幾丁寡糖[59]。但固定化往往存在降低酶活力，固定化酶只適用于小分子底物等問(wèn)題；這些問(wèn)題極大地限制了固定化酶的應(yīng)用。

固定化酶法展現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。反應(yīng)器是固定化酶法制備海洋寡糖的重要載體。反應(yīng)器可以為固定化酶法制備海洋寡糖提供其所需的最佳催化條件。反應(yīng)器的設(shè)計(jì)需要考慮溫度、pH、攪拌等參數(shù)的控制，還需要考慮物質(zhì)和能量傳遞、能耗等因素[62]。目前反應(yīng)器的運(yùn)行模式主要有批式、分批補(bǔ)料及連續(xù)式。反應(yīng)器主要有攪拌罐式反應(yīng)器、膜式反應(yīng)器、固定床式反應(yīng)器和流動(dòng)床式反應(yīng)器[63]。反應(yīng)器已經(jīng)成為固定化酶法制備海洋寡糖效率的關(guān)鍵設(shè)備，已受到越來(lái)越多的關(guān)注。

3 多糖降解酶及其催化機(jī)制

目前，酶法制備海洋寡糖的關(guān)鍵是高效多糖降解酶的發(fā)掘。近年來(lái)，研究者們已經(jīng)從海洋軟體動(dòng)物、海洋細(xì)菌和真菌、土壤細(xì)菌和真菌等微生物中分離純化出多種多糖降解酶，用于海洋寡糖的制備[64]。同時(shí)利用色譜法、結(jié)晶法、X 射線衍射法、生物信息學(xué)方法等，結(jié)合突變技術(shù)、共結(jié)晶技術(shù)、基因工程技術(shù)等[23,27-28]，解析了多糖降解酶結(jié)構(gòu)和功能，初步揭示其催化機(jī)制。由于不同海洋多糖其結(jié)構(gòu)和組成存在較大差異，需要采用不同多糖降解酶；此外，由于多糖降解酶來(lái)源、酶的組成、酶的分子量、酶的結(jié)構(gòu)等相差很大，故不同多糖降解酶的催化機(jī)制差異顯著。在多糖降解酶的活性中心、酶的分子修飾、海洋多糖降解模式與產(chǎn)物生成特點(diǎn)之間規(guī)律等方面缺乏深入研究，多糖降解酶的催化機(jī)制目前尚未完全闡明，需要進(jìn)一步研究。本文綜述了三種多糖降解酶來(lái)源、分類及其催化機(jī)制。

3.1 褐藻膠裂解酶及其催化機(jī)制

褐藻膠裂解酶是特異性降解褐藻膠的一類酶的總稱，其種類繁多、分布廣泛。自1984 年Hensen 從土壤和海洋中分離出的枯草芽孢桿菌JBH2 中發(fā)現(xiàn)褐藻膠裂解酶以來(lái)，50 多種褐藻膠裂解酶已經(jīng)被分離出來(lái)，它們主要來(lái)源于腐爛的褐藻、海洋軟體動(dòng)物消化液、海洋和土壤微生物中[65]。褐藻膠裂解酶分子量一般不大于1000 kDa[66]。Wang 等[67]從腐爛海帶中分離得到海洋弧菌Vibriosp. YWA，通過(guò)硫酸銨沉淀、柱層析等組合方法從該菌發(fā)酵液中分離純化得到特異性水解1,4-β-D-聚甘露糖醛酸的褐藻膠裂解酶，其分子量約為62.5 kDa；最適pH 和溫度分別為7.0 和 25 ℃；EDTA 和Zn2+增強(qiáng)該酶的活性，而Ba2+抑制它的活性。褐藻膠裂解酶可以分成不同類型，按酶作用底物來(lái)劃分，可以分成三類：1,4-β-D-聚甘露糖醛酸（Poly M）裂解酶（EC 42.2.3）；1,4-α-L-聚古羅糖醛酸（Poly G）裂解酶（EC 4.2.2.11）以及Poly M 和Poly G 均可降解的雙功能酶。按酶作用位點(diǎn)來(lái)劃分，可以分成內(nèi)切酶和外切酶。大部分褐藻膠裂解酶為內(nèi)切酶[66]，其酶切位點(diǎn)如圖4 所示。

褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制目前認(rèn)為主要是在酶β-消除作用下，使褐藻膠中起連接作用的糖苷鍵斷裂，生成寡糖。酶使兩個(gè)殘基之間1,4-O-糖苷鍵斷裂，同時(shí)在C4 和C5 之間產(chǎn)生雙鍵，在產(chǎn)物的非還原性末端形成不飽和糖醛酸，得到一連串各種長(zhǎng)度的寡糖[68]。Gacesa[69]認(rèn)為褐藻膠裂解酶降解過(guò)程分三步進(jìn)行：首先，底物上的羧基通過(guò)形成鹽橋被中和；其次，C5 位的質(zhì)子被提取，形成穩(wěn)定的烯醇陰離子中間體；最后，C4 和C5 之間從羧基得到電子，并形成不飽和雙鍵，從而使1,4-O-糖苷鍵斷裂，完成β消除反應(yīng)。綜上，盡管對(duì)部分褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制進(jìn)行了研究，由于不同來(lái)源的褐藻膠裂解酶降解褐藻膠的機(jī)制和制備寡糖的結(jié)構(gòu)不同，仍然有大部分的酶作用機(jī)制需要進(jìn)一步去研究。

3.2 殼聚糖酶及其催化機(jī)制

殼聚糖酶是催化殼聚糖的酶。它主要存在于真菌和細(xì)菌細(xì)胞中，此外，殼聚糖酶也存在一些植物中，分子量介于20～60 kDa 之間[70]。1973 年，Monaghan等[71]首次從土壤微生物中發(fā)現(xiàn)了殼聚糖酶，并提出：殼聚糖酶是一種特異性降解殼聚糖的新型酶，對(duì)于膠態(tài)幾丁質(zhì)基本不能水解，但可催化幾丁質(zhì)生成殼聚糖。根據(jù)殼聚糖酶的作用位點(diǎn)的不同，可以分為內(nèi)切型殼聚糖酶和外切型殼聚糖酶[72]。目前所發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶大多為內(nèi)切型殼聚糖酶，而對(duì)于外切型殼聚糖酶的報(bào)道相對(duì)較少。

基于氨基酸序列的不同，殼聚糖酶可以分為GH3、GH5、GH7、GH8、GH46、GH75 和GH80 七種[73]。其中，已經(jīng)破解GH46、GH75、G8 和GH80殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)。GH46 殼聚糖酶主要分離自桿菌屬和鏈霉菌屬的細(xì)菌，其催化機(jī)制和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已被廣泛研究。GH75 殼聚糖酶主要來(lái)源于真菌。殼聚糖酶GH46、GH75 和GH80 只能水解殼聚糖，是殼聚糖的專一性水解酶，而其他家族的殼聚糖酶往往具有其他酶活性如纖維素酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等[74]。根據(jù)酶底物特異性的不同，可以將殼聚糖酶分為四個(gè)不同的類型：Ⅰ類殼聚糖酶（切割GlcN-GlcN 和GlcNACGlcN 糖苷鍵）、Ⅱ類殼聚糖酶（水解GlcN-GlcN 糖苷鍵）、Ⅲ類殼聚糖酶（切割GlcN-GlcN 和GlcNGlcNAC 糖苷鍵）以及Ⅳ類殼聚糖酶（裂解以上三種糖苷鍵）[75]。

催化機(jī)制因不同殼聚糖酶而異，基于酶解產(chǎn)物還原端異頭碳結(jié)構(gòu)的差異，通常有保持異頭構(gòu)型的“retaining”機(jī)制（圖5a）和形成倒立異頭構(gòu)型“inverting”機(jī)制（圖5b）；“retaining”通過(guò)兩步置換機(jī)制催化水解，有兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基參與反應(yīng)，其中一個(gè)氨基酸殘基作為親核基團(tuán)，另一個(gè)作為廣義酸/堿；相反，“inverting”遵循一步、單一的置換機(jī)制，也有兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸參與反應(yīng)，其中一個(gè)作為廣義堿使水分子極化以產(chǎn)生更強(qiáng)的親核基團(tuán)來(lái)攻擊異頭碳，而另一個(gè)則作為廣義酸使糖苷氧質(zhì)子化以加速反應(yīng)[70]。x 射線結(jié)構(gòu)表明：在殼聚糖酶的催化過(guò)程中，Glu22 和Asp40 有著重要作用?？傊M管近幾年在個(gè)別家族的殼聚糖酶催化機(jī)制方面取得了一定的研究成果，但殼聚糖酶屬于多個(gè)糖苷水解酶家族，大部分家族的殼聚糖酶結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制研究甚少。

圖5 殼聚糖酶催化機(jī)制[70]Fig.5 Catalytic mechanism of chitosanase[70]

3.3 黃原膠降解酶及其催化機(jī)制

黃原膠降解酶是指能夠降解黃原膠的酶的統(tǒng)稱。由于黃原膠獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)產(chǎn)生的位阻，其不易被酶降解，需要在多種酶的協(xié)同下才能被徹底水解，因此，黃原膠降解酶是由多種酶組成的混合酶系，分子量介于10～100 kDa 之間；黃原膠降解酶由黃原膠主鏈修飾酶和黃原膠側(cè)鏈修飾酶組成[76]。黃原膠主鏈修飾酶作用于其主鏈，主要有β-D-葡聚糖酶和β-D-葡聚糖苷酶；黃原膠側(cè)鏈修飾酶是可以攻擊黃原膠分子中所有側(cè)鏈連接的混合酶系，包括黃原膠裂解酶、α-D-甘露糖苷酶和不飽和葡糖醛酸水解酶；其中，β-D-葡聚糖酶和黃原膠裂解酶屬于胞外酶，β-D-葡聚糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶和不飽和葡糖醛酸水解酶屬于胞內(nèi)酶[77]。

黃原膠在上述五種酶的參與下才能徹底水解，Nankai 等[78]詳細(xì)報(bào)道了由芽孢桿菌Bacillussp. strain GL 1 產(chǎn)生的這五種酶降解黃原膠的過(guò)程（圖6）。首先，芽孢桿菌細(xì)胞外的黃原膠裂解酶攻擊黃原膠側(cè)鏈分子中丙酮酸化的甘露糖基和葡糖醛酸殘基之間的糖苷鍵，從而除去丙酮酸化的甘露糖；其次，無(wú)末端的黃原膠主鏈在胞外酶β-D-葡聚糖酶的催化下生成四元糖，后經(jīng)糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)被β-D-葡聚糖苷酶轉(zhuǎn)化為三元糖（不飽和葡萄糖醛酸-乙酰甘露糖-葡萄糖）；再次，不飽和葡糖醛酸水解酶水解三元糖，生成葡萄糖醛酸和雙糖甘露糖-葡萄糖；最后，雙糖被α-D-甘露糖苷酶分解成葡萄糖和甘露糖[78]。總之，利用黃原膠降解酶催化黃原膠制備寡糖的作用機(jī)制研究仍然十分匱乏，同時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)黃原膠相關(guān)降解酶的獲取，且生成寡糖的含量有限，很難實(shí)現(xiàn)黃原膠寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖6 黃原膠降解途徑[78]Fig.6 Degradation pathway of xanthan gum[78]

4 總結(jié)與展望

海洋寡糖種類繁多、來(lái)源廣泛，具有抗腫瘤、抗氧化、抗凝血和抗炎等生理活性，在醫(yī)藥、化妝品、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，有著廣闊的發(fā)展前景。目前，海洋寡糖生物酶法制備具有反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保、降解率高等優(yōu)勢(shì)，因此，高效優(yōu)質(zhì)的海洋寡糖酶法制備工藝開發(fā)是當(dāng)前的主流發(fā)展方向。隨著科學(xué)技術(shù)和酶工程的不斷發(fā)展，很多新型酶進(jìn)入人們的視野。其中，納米酶是有催化作用的納米材料。納米酶很穩(wěn)定、價(jià)格低廉和易于工業(yè)化放大等優(yōu)點(diǎn)，引起了人們的廣泛關(guān)注[79]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)具有氧化還原酶、水解酶、裂合酶和異構(gòu)酶四種催化類型的納米酶[80]。納米酶的發(fā)現(xiàn)成為未來(lái)酶法制備海洋寡糖的發(fā)展方向。

隨著酶工程和基因工程的不斷發(fā)展，酶法制備海洋寡糖未來(lái)發(fā)展方向有如下四個(gè)方面：不斷發(fā)掘催化效率高的酶資源，包括新技術(shù)得以應(yīng)用于酶的分子修飾和改造，獲得高效的酶資源。通過(guò)基因工程獲得更多優(yōu)質(zhì)的酶，并實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)酶的產(chǎn)業(yè)化。從自然界中發(fā)現(xiàn)新的酶；完善酶促反應(yīng)的技術(shù)路線，實(shí)現(xiàn)高濃度底物的高效降解，提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本；構(gòu)建基于固定化酶的高效反應(yīng)器，包括攪拌罐式反應(yīng)器、固定床式反應(yīng)器、流動(dòng)床式反應(yīng)器和膜式反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)海洋寡糖的連續(xù)化生產(chǎn)。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)新型固定化酶技術(shù)及載體的探討，提高固定化酶活性，降低生產(chǎn)成本；闡明海洋寡糖制備過(guò)程中酶的作用和調(diào)控機(jī)制，提升酶的催化效率，強(qiáng)化酶的調(diào)控。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和研究人員的不斷探索，將會(huì)促進(jìn)海洋多糖資源的集約開發(fā)和海洋寡糖的商業(yè)化生產(chǎn)。