石 倩 丁 苗 汪 洋 周 莉 王忠衛(wèi) 張曉娟李 志 李熙銀 * 桂建芳 *

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)品種創(chuàng)制與高效養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北洪山實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院, 武漢 430072;3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

超數(shù)染色體(又叫超數(shù)B染色體、B染色體或者額外染色體), 是指除了常規(guī)染色體(又叫常規(guī)A染色體或A染色體: 包含常染色體和性染色體)之外的非必須染色體[1]。超數(shù)染色體最早于1907年在半翅目昆蟲(chóng)中被記載[2], 且預(yù)計(jì)存在于約15%的真核生物中[3]。由于超數(shù)染色體不遵循孟德?tīng)栠z傳定律,所以其數(shù)量在同一群體不同個(gè)體之間也會(huì)存在差異[4]。超數(shù)染色體通常被認(rèn)為起源于常規(guī)染色體,并且能夠積累細(xì)胞器來(lái)源的DNA序列[4]。超數(shù)染色體發(fā)現(xiàn)之初, 被認(rèn)為不含有關(guān)鍵基因且沒(méi)有功能,然而, 隨著測(cè)序技術(shù)和基因功能研究手段的迅速發(fā)展, 越來(lái)越多的證據(jù)顯示超數(shù)染色體上的活性基因能夠發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[5,6], 且為物種的演化提供了額外的基因組材料[7], 例如: 在小麥病原真菌(Zymoseptoria tritici)中, 超數(shù)染色體能增強(qiáng)其對(duì)小麥的致病性[8]; 在黑麥(Secale cereale)中, 超數(shù)染色體能夠增加常規(guī)染色體的重組率并增強(qiáng)其對(duì)逆境條件的適應(yīng)性[9,10]; 在玉米(Zea maysL.)中, 超數(shù)染色體能夠增強(qiáng)其對(duì)壞死病的抵抗能力[11]; 在洞穴魚(yú)(Astyanax mexicanus)中, 超數(shù)染色體含有性別決定基因, 具有雄性決定作用[5]。

多倍體鯽復(fù)合種包括有性生殖四倍體鯽(Carassius auratus)和單性雌核生殖六倍體銀鯽(Carassius gibelio), 廣泛分布于亞歐大陸及鄰近島嶼的淡水水系[12,13]。全基因組解析揭示四倍體鯽是雙二倍體(AABB,n=100), 包含兩套二倍體基因組, 每套二倍體基因組源于不同祖先; 六倍體銀鯽是雙三倍體(AAABBB,n≈150), 包含兩套三倍體基因組, 每套三倍體基因組源自不同祖先[14—16]。約82—96萬(wàn)年前, 雙三倍體銀鯽由祖先雙二倍體鯽經(jīng)同源三倍化而形成, 多倍化后的雙三倍體銀鯽通過(guò)雌核生殖克服三個(gè)同源染色體不能正常配對(duì)和均等分離的生殖障礙[14]。雌核生殖是指母本產(chǎn)生不減數(shù)卵子, 不減數(shù)的卵子在同域有性生殖物種精子的刺激下進(jìn)行胚胎發(fā)育, 最終產(chǎn)生與母本遺傳背景一致的全雌子代[17,18]。雙三倍體銀鯽通過(guò)抑制減數(shù)第一次分裂, 從而產(chǎn)生不減數(shù)的卵子[14], 并利用同水域的雙二倍體鯽或其他物種的精子進(jìn)行雌核生殖[17,18]。有意思的是, 雌核生殖銀鯽不同于其他單性脊椎動(dòng)物, 在自然群體中含有少部分雄性個(gè)體[19]。

雙二倍體鯽含有100條常規(guī)染色體, 不含有超數(shù)染色體; 而雙三倍體銀鯽含有約150條染色體,除了常規(guī)染色體之外還有一些超數(shù)染色體, 由于銀鯽的超數(shù)染色體大小比常規(guī)染色體偏小, 我們將其稱為超數(shù)微小染色體。銀鯽雌性個(gè)體含有約9個(gè)超數(shù)微小染色體, 而雄性個(gè)體比雌性個(gè)體多出了額外的3—4個(gè)雄性特異超數(shù)微小染色體, 且這些雄性特異的超數(shù)微小染色體具有遺傳雄性決定作用[20,21]。隨后, 我們通過(guò)熒光顯微切割、體外擴(kuò)增和測(cè)序, 對(duì)這些雄性特異超數(shù)微小染色體進(jìn)行了解析, 并篩選到具有雄性特異或者雄性偏向表達(dá)的基因片段[20]。然而, 銀鯽雌性中超數(shù)微小染色體的基因組特征及其在單性雌核生殖方式演化中的作用仍不清楚。

在本研究中, 我們利用銀鯽超數(shù)微小染色體富集的重復(fù)序列和染色體熒光原位雜交, 鑒定了銀鯽雌性基因組中的潛在超數(shù)微小染色體序列。我們發(fā)現(xiàn)銀鯽超數(shù)微小染色體含有所有常染色體的同源序列、大量重復(fù)序列以及完整活性基因。此外,大部分銀鯽中擴(kuò)張的減數(shù)分裂相關(guān)基因家族在超數(shù)微小染色體上存在擴(kuò)增拷貝。這些結(jié)果不僅解析了雙三倍體銀鯽的超數(shù)微小染色體基因組特征,也為超數(shù)染色體在單性生殖演化中的作用提供了創(chuàng)新見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所使用的雙二倍體鯽(C. auratus)和雙三倍體銀鯽(C. gibelio)來(lái)自于國(guó)家水生生物種質(zhì)資源庫(kù)(National Aquatic Biological Resource Center,NABRC), 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 中期染色體制備

雙三倍體銀鯽和雙二倍體鯽有絲分裂中期染色體的制備采用植物血球凝集素體內(nèi)誘導(dǎo)腎細(xì)胞制片技術(shù), 具體參考朱華平等[22]描述的方法進(jìn)行。

1.3 染色體熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)

FISH實(shí)驗(yàn)參照丁苗等[20]描述的方法進(jìn)行, 但方法有略微改動(dòng)。FISH探針為超數(shù)微小染色體探針[20]和酵母人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC)質(zhì)粒探針。BAC質(zhì)粒的接種和提取參考彭金霞等[23]描述的方法進(jìn)行。其中, BAC質(zhì)粒探針的制備按照DIG-Nick Translation Mix試劑盒(Roche公司)的說(shuō)明書進(jìn)行。染色體玻片于65℃放置3h后,移至70℃變性液(35 mL去離子甲酰胺, 10 mL滅菌水和5 mL 2×SSC)中變性3min。將玻片放入預(yù)冷的70%、90%和100%的乙醇中依次脫水5min, 自然晾干玻片。與此同時(shí), 將探針混合液(50%去離子甲酰胺, 20×SSC, 10% SDS, 0.25 mg/mL 鮭精子DNA,50%硫酸葡聚糖, 100 ng BAC質(zhì)粒探針和5 ng超數(shù)微小染色體探針), 于100℃的水中變性10min, 而后將探針混合液立即置于冰上; 將探針變性混合液孵育染色體玻片, 37℃避光雜交24h。

在雜交完畢后, 玻片放置于20%去離子甲酰胺(35 mL滅菌水, 10 mL去離子甲酰胺和5 mL 20×SSC)中洗10min。隨后于2×SSC(含1% Tween)中洗5min, 之后放于1×PBST中洗3次, 每次5min; 1×PBS中洗3次, 每次5min。接著于每張玻片中加200 μL羊抗Dig稀釋液(羊抗Dig﹕1×PBS =1﹕100), 37℃濕盒中避光孵育1h。然后將玻片于1×PBS中洗3次, 每次5min, 自然晾干后, 在每張玻片用150 μL(2 μg/mL)的DAPI染色, 蓋上蓋玻片, 37℃濕盒避光染色1h。最后將玻片放于1×PBS中洗3次, 每次5min, 加30 μL的抗淬滅劑封片, 借助共聚焦顯微鏡鏡檢。

1.4 DNA提取和PCR

剪取適量大小的尾鰭, 用干凈濾紙擦干鰭條表面黏液后, 將樣品放于1.5 mL的EP管中, 然后加入500 μL 核酸裂解液和10 μL(10 mg/mL)蛋白酶K, 放于55℃水浴鍋中1h; 待樣品裂解充分后, 14000 r/min離心5min, 將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL EP管中, 加入200 μL 蛋白沉淀劑, 上下顛倒混勻, 置于冰上10min;待樣品充分沉淀后, 14000 r/min離心5min, 吸取上清液于新的1.5 mL EP管中, 加入500 μL預(yù)冷的異丙醇, 上下顛倒混勻(可見(jiàn)白色絮狀物); 14000 r/min離心5min, 棄上清, 加入500 μL 80%乙醇混勻; 14000 r/min離心5min, 棄上清, 室溫放置待白色沉淀變?yōu)橥该魑? 加入100 μL滅菌水, 混勻以便充分溶解DNA。采用NanoDrop測(cè)濃度, 將樣品DNA濃度調(diào)為100 ng/μL,調(diào)整好濃度的樣品存于4℃待用。

PCR模板為雙三倍銀鯽和雙二倍體鯽基因組DNA, 反應(yīng)體系為20 μL, 包括10 μL的Taqreaction Mix, 0.5 μL的上下游引物, 1 μL的模板和8 μL的滅菌水。擴(kuò)增Cg-Ca-CL1、bmb-CgB、ccna2-CgB和nusap1-CgB,這些序列的引物在表1中, PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95℃ 3min; 95℃ 15s, 60℃ 20s, 72℃ 20s,35個(gè)循環(huán); 72℃ 5min, 12℃ 5min。待PCR程序結(jié)束后, PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè), 檢測(cè)時(shí)采用的Marker為TaKaRa DL2000。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 共線性分析

以已發(fā)表的銀鯽基因組及基因組BAC序列為參考數(shù)據(jù)庫(kù),Cg-Ca-CL1為查詢序列, 借助 BLAST軟件[24], 使用默認(rèn)參數(shù)比對(duì), 獲取超數(shù)微小染色體基因組序列, 再將鑒定到的超數(shù)微小染色體序列分別和已發(fā)表的雙三倍體銀鯽常規(guī)A染色體序列(GenBank ID: PRJNA546443)及雙二倍體鯽基因組(GenBank ID: PRJNA546444)通過(guò)Minimap2[25]進(jìn)行

基因組共線性分析, 結(jié)果借助Circos[26]展示。

1.6 重復(fù)序列注釋和基因通路分析

使用Repeatmask[27]軟件進(jìn)行重復(fù)序列分析。對(duì)超數(shù)染色體序列上的注釋基因進(jìn)行KEGG通路分析和GO通路分析(https://david.ncifcrf.gov/)。

1.7 熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)

qPCR采用SYBR Green染料法根據(jù)操作說(shuō)明進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系為20 μL, 包括10 μL的 SYBR Mix, 0.5 μL的上下游引物(表1),1 μL的模板和8 μL的滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性, 95℃ 15s, 60℃ 20s, 72℃ 20s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù), 采用2-ΔΔCt計(jì)算獲得基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體序列鑒定

在前期研究中篩選到雙三倍體銀鯽中含量最高的重復(fù)序列Cg-Ca-CL1, 利用該重復(fù)序列為探針,通過(guò)染色體FISH能夠特異性標(biāo)記銀鯽的超數(shù)微小染色體[20]。雙三倍體銀鯽由祖先雙二倍體鯽經(jīng)同源三倍化而形成[14], 利用Cg-Ca-CL1探針在雙二倍體鯽中進(jìn)行染色體FISH分析, 發(fā)現(xiàn)雙二倍體鯽不含有超數(shù)微小染色體, 且常染色體和性染色體上也沒(méi)有明顯熒光信號(hào)(圖1A)。由于Cg-Ca-CL1在雙二倍體鯽中的含量低, 通過(guò)FISH在雙二倍體鯽中檢測(cè)不到Cg-Ca-CL1信號(hào), 但是利用PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物序列測(cè)定, 能夠在雙二倍體鯽中檢測(cè)到Cg-Ca-CL1(圖1B)。在雙二倍體鯽中,Cg-Ca-CL1擴(kuò)增條帶單一, 說(shuō)明該序列不是以串聯(lián)重復(fù)形式存在; 而在Cg-Ca-CL1在雙三倍體銀鯽中PCR擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度條帶, 說(shuō)明Cg-Ca-CL1發(fā)生了擴(kuò)增且以串聯(lián)重復(fù)的形式存在(圖1B)。這些結(jié)果揭示同源三倍化之后,Cg-Ca-CL1在雙三倍體銀鯽的超數(shù)微小染色體上發(fā)生了擴(kuò)增和富集。因此, 我們擬通過(guò)該重復(fù)序列并結(jié)合染色體熒光原位雜交來(lái)篩選雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體序列。

圖1 重復(fù)序列Cg-Ca-CL1分析Fig. 1 Analysis of repetitive sequence Cg-Ca-CL1

對(duì)雙三倍體銀鯽雌性基因組(GenBank: PRJNA 546443)進(jìn)行了重復(fù)序列Cg-Ca-CL1搜尋, 總共發(fā)現(xiàn)18個(gè)未組裝的scaffold和12個(gè)組裝好的染色體含有該重復(fù)序列, 包含Cg-Ca-CL1的拷貝數(shù)從5到3157不等(圖1C)。這18個(gè)scaffold由于未能組裝到染色體, 可能是潛在超數(shù)微小染色體序列。隨后, 在這尾測(cè)序個(gè)體構(gòu)建的酵母人工染色體文庫(kù)中, 篩選到500個(gè) BAC質(zhì)粒含有Cg-Ca-CL1。拿這些BAC質(zhì)粒序列與上述的18個(gè)scaffold進(jìn)行序列比對(duì), 最終鑒定出85個(gè)BAC質(zhì)粒序列能比對(duì)上其中的15個(gè)scaffold(序列相似度大于95%)。在15個(gè)scaffold中, 分別選擇一個(gè)能匹配的BAC質(zhì)粒為探針(表2), 通過(guò)FISH進(jìn)行染色體定位分析。FISH結(jié)果顯示, 這15個(gè)BAC質(zhì)粒的信號(hào)均位于超數(shù)微小染色體上, 而在常規(guī)染色體上沒(méi)有明顯信號(hào), 因此, 可以推測(cè)這些BAC質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的scaffold序列是超數(shù)微小染色體序列(圖2)。

圖2 BAC質(zhì)粒的染色體定位Fig. 2 Chromosomal localization of BAC plasmids

表2 超數(shù)微小染色體序列概況Tab. 2 Summary of sequences from supernumerary microchromosomes

2.2 超數(shù)微小染色體含有常規(guī)染色體同源序列

由于雙三倍體銀鯽由祖先雙二倍體鯽經(jīng)同源三倍化而形成[14], 同時(shí)選取了雙三倍體銀鯽及雙二倍體鯽為對(duì)照, 通過(guò)序列比對(duì)來(lái)揭示雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體的序列特征。雙三倍體銀鯽中未組裝的序列不能確定是常規(guī)染色體還是超數(shù)微小染色體序列, 所以我們舍棄了這部分未組裝的序列,只用組裝到染色體的50條常規(guī)染色體序列來(lái)做超數(shù)微小染色體同源性分析。雙二倍體鯽中由于不含有超數(shù)微小染色體(圖1A), 其未組裝的序列都是來(lái)源于常規(guī)染色體, 所以雙二倍體鯽所有序列都用來(lái)做超數(shù)微小染色體同源性分析。我們發(fā)現(xiàn)銀鯽5.48%的超數(shù)微小染色體序列與銀鯽組裝的常規(guī)染色體具有同源性, 且同源序列在每個(gè)常規(guī)染色體上都有分布, 其中含有超數(shù)微小染色體同源序列最多的常規(guī)染色體依次是chr1B、chr4A和chr16A(圖3A)。同時(shí), 與雙二倍體鯽基因組進(jìn)行比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn), 22.28%的超數(shù)微小染色體序列在雙二倍體鯽基因組中能找到同源序列, 其中含有超數(shù)微小染色體同源序列最多的是未組裝的序列及chr25B、chr21B和chr22B號(hào)染色體(圖3B)。由于雙三倍體銀鯽中部分屬于常規(guī)染色體但是又未能組裝到染色體的序列沒(méi)有用來(lái)做同源分析, 所以導(dǎo)致銀鯽常規(guī)染色體上同源序列比例(5.48%)遠(yuǎn)低于鯽常規(guī)染色體(22.28%)。從上述的結(jié)果來(lái)看, 銀鯽超數(shù)微小染色體含有常規(guī)染色體同源序列, 暗示著銀鯽的超數(shù)微小染色體可能起源于常規(guī)染色體。

圖3 超數(shù)微小染色體同源序列特征Fig. 3 Homologous sequence characterization of supernumerary microchromosomes

2.3 超數(shù)微小染色體重復(fù)序列擴(kuò)增

雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體、雙三倍體銀鯽組裝的常規(guī)染色體及雙二倍體鯽常規(guī)染色體的GC含量分別為38.06%、37.61%和37.63%, 三者沒(méi)有顯著差異(圖4A)。隨后通過(guò)重復(fù)序列鑒定發(fā)現(xiàn)超數(shù)微小染色體的重復(fù)序列占所有序列的比重為78.29%, 比雙三倍體銀鯽組裝的常規(guī)染色體(47.93%)和雙二倍體鯽常規(guī)染色體(47.56%)的重復(fù)序列占比明顯偏高(圖4A)。相比雙三倍體銀鯽組裝的常規(guī)染色體(衛(wèi)星序列: 8.20%; TE: 69.45%)及雙二倍體鯽常規(guī)染色體(衛(wèi)星序列: 7.59%; TE: 72.53%), 超數(shù)微小染色體重復(fù)序列中衛(wèi)星序列(21.61%)的占比有所增加而TE的占比有所下降(50.67%; 圖4B)。此外, 超數(shù)微小染色體衛(wèi)星序列中Y染色體類型占比增加到52.05%(圖4C), TE中DNA類型占比減少到42.20%(圖4D)。 這些結(jié)果說(shuō)明重復(fù)序列尤其是衛(wèi)星序列在雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體上發(fā)生了大量擴(kuò)增。

圖4 重復(fù)序列分析Fig. 4 Analysis of repetitive elements

2.4 超數(shù)微小染色體注釋基因通路分析

超數(shù)微小染色體序列上總共注釋到了318個(gè)完整基因, 其中包含141個(gè)已知基因和177個(gè)未知基因(圖5A)。本研究使用已知基因進(jìn)行了KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GO(Gene Ontology)通路分析。在KEGG分析中, 213個(gè)基因能夠匹配到6個(gè)主要類別中的31個(gè)通路。包含最多基因數(shù)的通路是癌癥: 概述(16個(gè)基因); 膜運(yùn)輸(14個(gè)基因); 癌癥: 特定類型以及全局和總覽圖(13個(gè)基因) (圖5B)。此外, 在GO分析中, 分別有401個(gè)、266個(gè)和235個(gè)基因能夠匹配到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞學(xué)組分及分子生物學(xué)功能這3個(gè)主要類別中的47個(gè)通路。其中, 含有注釋基因組最多的通路依次是結(jié)合通路(83個(gè)基因), 細(xì)胞通路(72個(gè)基因)和細(xì)胞部分通路(53個(gè)基因; 圖5C)。

圖5 超數(shù)微小染色體注釋基因通路分析Fig. 5 Pathway analysis of annotated genes from supernumerary microchromosomes

2.5 超數(shù)微小染色體上減數(shù)分裂相關(guān)基因的鑒定及表達(dá)分析

前期的研究通過(guò)多個(gè)品系的比較基因組解析發(fā)現(xiàn)與雙二倍體鯽相比, 雙三倍體銀鯽中有13個(gè)基因家族發(fā)生了擴(kuò)張, 其中有8個(gè)是減數(shù)分裂相關(guān)基因家族, 這些基因的擴(kuò)張可能與銀鯽進(jìn)行雌核生殖特殊的卵子發(fā)生方式有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)在這8個(gè)擴(kuò)增的減數(shù)分裂相關(guān)基因家族中, 有6個(gè)在超數(shù)微小染色體序列中都能檢測(cè)到擴(kuò)增拷貝。紡錘體組成相關(guān)基因incenp在HiC_sacffold_51和HiC_sacffold_53分別有1個(gè)拷貝; 細(xì)胞周期相關(guān)基因fbxo5在HiC_sacffold_57上有2個(gè)拷貝; 核膜組裝相關(guān)基因lap2在HiC_sacffold_56和HiC_sacffold_204上分別有1個(gè)拷貝;bmb在HiC_sacffold_64上有1個(gè)拷貝;ccna2在HiC_sacffold_53上有2個(gè)拷貝;nusap1在HiC_sacffold_166上有1個(gè)拷貝。其中,incenp、fbxo5和lap2這3個(gè)基因除了在雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體序列上存在拷貝, 還分別在雙三倍體銀鯽的染色體chr3B、chr18B和chr9A上存在1個(gè)擴(kuò)增拷貝; 而bmb、ccna2和nusap1這三個(gè)基因則只在雙三倍體銀鯽超數(shù)染色體序列上存在擴(kuò)增拷貝。

本研究針對(duì)這6個(gè)基因在雙三倍體銀鯽中擴(kuò)增的拷貝[incenp-Cg(B+chr3B)、fbxo5-Cg(B+chr18B)、lap2-Cg(B+chr9A)、bmb-CgB、ccna2-CgB和nusap1-CgB]設(shè)計(jì)了特異的PCR引物(表1), 分別在雙三倍體銀鯽出膜后30d、70d、160d、200d和1y(性成熟時(shí)期)的雌性性腺中進(jìn)行了qPCR檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)這些基因拷貝在銀鯽卵子發(fā)生過(guò)程中幾乎均有轉(zhuǎn)錄表達(dá)(圖6), 暗示著超數(shù)微小染色體上擴(kuò)增的這些基因具有活性, 可能在銀鯽特殊的卵子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖6 雙三倍體銀鯽特異擴(kuò)增減數(shù)分裂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)Fig. 6 Transcriptional activity detection of meiosis-related genes that are specifically expanded in amphitriploid C. gibelio

2.6 超數(shù)微小染色體減數(shù)分裂相關(guān)基因SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)

此外,bmb-CgB、ccna2-CgB和nusap1-CgB這些超數(shù)微小染色體特異拷貝引物還可以用來(lái)開(kāi)發(fā)超數(shù)微小染色體特異的SCAR(sequence characterized amplified regions)標(biāo)記。我們?cè)诓缓瑪?shù)微小染色體的雙二倍體鯽和含有超數(shù)微小染色體的雙三倍體銀鯽中進(jìn)行了PCR檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)這3對(duì)引物在雙三倍體銀鯽雌性和雄性個(gè)體中均能擴(kuò)增出特異條帶, 而在雙二倍體鯽雌性和雄性個(gè)體中均擴(kuò)增不出條帶(圖7)。因此, 這些SCAR標(biāo)記還可以作為區(qū)分雙二倍體鯽和雙三倍體銀鯽的分子標(biāo)記。

3 討論

性別在自然界中普遍存在, 廣義的有性生殖是指發(fā)生減數(shù)分裂以及隨后核子融合[28]。越來(lái)越多的證據(jù)表明有性生殖是真核生物的共源性狀[29,30]。然而在自然界中的確存在少數(shù)的生物類群進(jìn)行單性生殖, 其中脊椎動(dòng)物約有100種[31]。我們通常所說(shuō)的單性生殖包括孤雌生殖、雌核生殖和雜種生殖[32]。孤雌生殖是雌性親本產(chǎn)生未減數(shù)的卵子, 這些卵子獨(dú)自發(fā)育成與母本遺傳背景一致的個(gè)體, 不需要雄性[33]。雌核生殖同樣也是雌性親本產(chǎn)生不減數(shù)的卵子, 但是卵子須要外源精子刺激胚胎發(fā)育,形成與母本遺傳背景一致的個(gè)體[17,18]。行雜種生殖的生物, 雌性產(chǎn)生減數(shù)的卵子, 但是卵子只含有母本的單倍體基因組, 父本的基因組在形成卵子的時(shí)候被排除[34]。單性生殖沒(méi)有減數(shù)分裂同源重組,導(dǎo)致有害突變積累及阻礙遺傳多樣性產(chǎn)生, 通常被認(rèn)為是演化的死胡同。值得注意的是, 有些單性生殖生物類群存在的時(shí)間已經(jīng)遠(yuǎn)超出其預(yù)測(cè)的滅絕時(shí)間, 且展示出很高的遺傳多樣性和很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性[13,35,36]。因此, 單性動(dòng)物對(duì)于回答生態(tài)學(xué)和演化生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題具有重要意義。

超數(shù)染色體由于其非必需的特質(zhì), 最初被認(rèn)為是沒(méi)有或者很少有生物學(xué)功能的。隨著研究的拓展和深入, 逐漸發(fā)現(xiàn)超數(shù)染色體對(duì)于所在的生物類群能夠發(fā)揮重要的生物學(xué)功能和演化適應(yīng)性[37]: 比如在真菌中, 超數(shù)染色體發(fā)現(xiàn)與致病性有關(guān)[38]; 在植物中, 超數(shù)染色體能夠增強(qiáng)植物的耐受性[39]; 在許多動(dòng)物中, 超數(shù)染色體具有性別決定功能[40,41],近期在洞穴魚(yú)的超數(shù)染色體上還鑒定了性別決定基因[5]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn), 在銀鯽雄性中, 雄性特異的超數(shù)微小染色體上含有在性別決定關(guān)鍵時(shí)期雄性特異或者雄性偏向表達(dá)的基因[20], 且與銀鯽的雄性發(fā)生緊密相關(guān)[21]。在本文的研究中, 發(fā)現(xiàn)銀鯽中擴(kuò)張的8個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因, 有6個(gè)在超數(shù)微小染色體上存在擴(kuò)增拷貝。其中incenp、fbxo5和lap2這3個(gè)基因在常規(guī)染色體和超數(shù)微小染色體上都存在擴(kuò)增拷貝, 且熒光定量檢測(cè)引物沒(méi)有辦法區(qū)分常規(guī)染色體和超數(shù)微小染色體上的擴(kuò)增拷貝,因此這3個(gè)基因在卵巢發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是常規(guī)染色體和超數(shù)微小染色體擴(kuò)增拷貝共同表達(dá)的結(jié)果。另外3個(gè)基因(bmb、ccna2和nusap1)則只在超數(shù)微小染色體上存在擴(kuò)增拷貝, 且這3個(gè)基因在卵巢發(fā)育的不同階段都具有轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些結(jié)果暗示著超數(shù)微小染色體在雙三倍體銀鯽特殊的單性雌核生殖過(guò)程中可能發(fā)揮作用。

此外, 雙二倍體鯽和雙三倍體銀鯽共同組成了鯽復(fù)合種, 雙三倍體銀鯽是由祖先雙二倍體鯽經(jīng)同源三倍化而形成, 他們廣泛的分布于亞歐大陸及附近島嶼的淡水水系, 有著部分重疊的生態(tài)分布[12,13]。雙二倍體鯽和雙三倍體銀鯽是我國(guó)重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚(yú)類, 在外觀和形態(tài)上沒(méi)有明顯差異, 通常我們是通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)其血細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行測(cè)定來(lái)對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分[42]。通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行區(qū)分的流程比較繁瑣, 樣品處理不當(dāng)還容易造成結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究中開(kāi)發(fā)的超數(shù)微小染色體特異SCAR標(biāo)記, 能夠很好地區(qū)分雙二倍體鯽和雙三倍體銀鯽, 為兩者的快速鑒定提供了一條快捷和準(zhǔn)確的途徑。

總之, 本研究鑒定了雙三倍體銀鯽超數(shù)微小染色體序列, 揭示了銀鯽超數(shù)微小染色體含有常規(guī)染色體同源序列且積累了大量重復(fù)序列, 發(fā)現(xiàn)超數(shù)微小染色體上含有活性基因, 證明減數(shù)分裂相關(guān)基因通過(guò)超數(shù)微小染色體發(fā)生擴(kuò)張, 開(kāi)發(fā)了超數(shù)微小染色體特異的SCAR標(biāo)記。本研究不僅解析了銀鯽超數(shù)微小染色體的基因組特征, 也為超數(shù)染色體在單性生物演化中的作用提供了創(chuàng)新見(jiàn)解。