陳劍平 馮廣朋 * 李新蒼 *

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹、大閘蟹, 是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖主要養(yǎng)殖對(duì)象之一。與其他無脊椎動(dòng)物類似, 中華絨螯蟹依靠先天免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的感染[1]。抗菌肽是無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)因子, 在清除宿主體內(nèi)病原微生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。甲殼動(dòng)物抗菌肽主要包括甲殼肽(Crustin)、抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor, ALF)、對(duì)蝦素(Penaeidin)及溶菌酶(Lysozyme)等家族[3]。

甲殼肽家族為富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽,分子量大小在7—14 kD, 序列N端含有信號(hào)肽序列,C端含有乳清酸性蛋白(Whey acidic protein, WAP)結(jié)構(gòu)域[4]。WAP結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有8個(gè)保守的半胱氨酸,可形成四對(duì)二硫鍵, 又稱為“4DSC”結(jié)構(gòu)域, 其在分子內(nèi)部形成1個(gè)疏水核心[5]。在不同甲殼肽信號(hào)肽序列和WAP結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域常存在序列和結(jié)構(gòu)差異, 根據(jù)該區(qū)域結(jié)構(gòu)模式不同, 將甲殼肽分為五種主要類型[6]。甲殼動(dòng)物中常見Ⅰ—Ⅳ型, Ⅴ型甲殼肽則主要存在于膜翅目昆蟲中[7]。1個(gè)物種通常含有多個(gè)甲殼肽分子, 呈現(xiàn)多樣的生物學(xué)功能。例如, 擬穴青蟹 (Scylla paramamosain)中已報(bào)道8個(gè)甲殼肽基因, 其中5個(gè)Ⅰ型甲殼肽[8—10], 3個(gè)屬于Ⅱ型甲殼肽[11—13], 它們大多數(shù)具有微生物結(jié)合活性, 并具有抗細(xì)菌、真菌和病毒的功能。中華絨螯蟹中也有2個(gè)Ⅱ型甲殼肽[14,15]和2個(gè)Ⅳ型甲殼肽[16,17]被報(bào)道, 參與不同免疫反應(yīng)。此外, 對(duì)蝦中也發(fā)現(xiàn)了大量具有抗微生物功能的甲殼肽分子[18—20]。

卵巢是雌性中華絨螯蟹的生殖器官, 對(duì)中華絨螯蟹的繁育和養(yǎng)殖具有重要意義。本研究將通過生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)分析、蛋白表達(dá)與純化、免疫學(xué)功能驗(yàn)證, 從中華絨螯蟹卵巢組織中鑒定2個(gè)Ⅰ型甲殼肽分子, 分析其免疫相關(guān)功能, 明確這2個(gè)抗菌肽的功能差異及作用, 豐富甲殼動(dòng)物生殖系統(tǒng)免疫理論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華絨螯蟹中華絨螯蟹親蟹, 購(gòu)于江蘇省高郵湖, 雌蟹(97.03±11.09) g, 雄蟹(125.03±10.38) g,于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)1周[溫度(20±3)℃, pH 8.1±0.4], 適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)前挑選附肢完整, 體表無損傷, 活力強(qiáng)的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

菌株和載體實(shí)驗(yàn)中所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏或購(gòu)買, 9種保藏菌株包括3種革蘭氏陽(yáng)性菌: 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium), 5種革蘭氏陰性菌: 大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 1種真菌: 白色念珠菌(Candida albicans)。大腸桿菌DH5α和DE3感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。所用pMD19-T載體購(gòu)于TaKaRa公司(中國(guó)大連), pET-32a表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司(德國(guó))。

主要試劑與設(shè)備RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LATaq酶、質(zhì)粒提取試劑盒、TB Green Premix ExTaq酶、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司; 膠回收試劑盒購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司; DNase I為Promega(美國(guó))公司產(chǎn)品; 氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)于上海生工生物工程有限公司; Ni-NTA His Bind Resin購(gòu)于Merck(美國(guó)); 胰蛋白胨、酵母提取物、兩種肽聚糖(PGN, 來自于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)、脂磷壁酸(LTA, 來自于枯草芽孢桿菌)、脂多糖(LPS, 來自于大腸桿菌0111:B4)、β-葡聚糖(來自于海帶)和3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)于Sigma(美國(guó)); 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器包括: 梯度PCR儀(Eppendorf, Mastercycler X50s)、熒光定量PCR儀(Thermo, ABI Quant-Studio 6 Flex)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN, SPARK10)、超微量紫外可見光分光光度計(jì)(Thermo, NanoDrop One)、多功能成像系統(tǒng)(Bio-rad, Doc XRS+)及微孔板全自動(dòng)洗板機(jī)(BioTek, 50TS)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品采集與總RNA提取將中華絨螯蟹置于冰中麻醉, 用含有預(yù)冷抗凝劑(0.14 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L葡萄糖、30 mmol/L檸檬酸三鈉、26 mmol/L 檸檬酸、10 mmol/L EDTA; pH 4.6)的無菌注射器從螯足基部抽取血淋巴, 在4℃時(shí)850×g離心15min收集血細(xì)胞, 隨后加入細(xì)胞裂解液吹打均勻, 進(jìn)行總RNA提取。取血后解剖中華絨螯蟹, 采集心臟、肝胰腺、鰓、胃、腸、卵巢、精巢和肌肉組織, PBS(140 mmol/L氯化鈉, 10 mmol/L磷酸二氫鈉; pH 7.4) 洗滌2—3次后, 加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行組織勻漿, 離心后進(jìn)行總RNA提取。總RNA提取步驟參考RNAiso Plus使用說明進(jìn)行。

cDNA合成將DNase Ⅰ添加到總RNA中以去除樣品中污染的DNA, 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性, 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度。總RNA質(zhì)量符合要求后, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)的使用說明合成cDNA。

甲殼肽基因cDNA克隆通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 獲得2個(gè)甲殼肽樣分子, 隨后使用Primer Premier 5.0軟件在基因序列兩端分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1), 通過PCR擴(kuò)增、測(cè)序驗(yàn)證基因序列。以中華絨螯蟹卵巢cDNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增目的基因, 反應(yīng)體系參照LATaqTMVersion 2.0 plus dye說明書配制: LATaq酶25 μL, 滅菌水20 μL, 上下游引物各2 μL(10 μmol/L),模板cDNA(200 ng/μL)1 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 53℃退火30s, 72℃延伸40s, 共35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10min。獲得的目的片段經(jīng)過膠回收試劑盒回收純化后, 連接至pMD19-T載體, 再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi), 送往上海生工測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab. 1 Sequence of primers used in this study

生物信息學(xué)分析利用軟件Expasy(http://web.expasy.org/translate/)預(yù)測(cè)EsCrus3和EsCrus4編碼的氨基酸序列; 軟件BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)分析EsCrus3和EsCrus4與其他物種甲殼肽蛋白的相似性。多重序列比對(duì)由DNAMAN軟件和GeneDoc軟件生成。蛋白理論分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)基于在線軟件Expasy(http://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算。在線軟件Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽[21]。MEGA 11軟件用于分析不同類型甲殼肽間的進(jìn)化關(guān)系。

甲殼肽基因組織分布分析以合成的中華絨螯蟹不同組織cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系參照試劑盒(TB Green?Premix ExTaqTMⅡ)說明書配制: TB Green Ⅱ 10 μL、ROX參比染料0.4 μL、上下游引物各0.8 μL (10 μmol/L)、無菌水6 μL、cDNA模板2 μL; 甲殼肽基因定量引物與內(nèi)參引物見表1。qRT-PCR程序設(shè)置如下:95℃ 3min; 95℃ 10s, 60℃ 40s, 40個(gè)循環(huán); 60—95℃熔解曲線分析。所有實(shí)驗(yàn)均使用單獨(dú)的模板并設(shè)置3次重復(fù)。利用公式2-?Ct分析EsCrus3和EsCrus4在不同組織的相對(duì)表達(dá)水平。

病原刺激后甲殼肽基因表達(dá)模式分析為分析EsCrus3和EsCrus4是否響應(yīng)病原菌刺激, 本研究首先通過注射病原菌的方式感染中華絨螯蟹, 隨后通過qRT-PCR分析它們的表達(dá)模式, 實(shí)驗(yàn)期間停止喂食。實(shí)驗(yàn)組分別注射200 μL的金黃色葡萄球菌 [2×108CFU(Colony-Forming Units)]或200 μL嗜水氣單胞菌(2×107CFU), 對(duì)照組注射相同體積的PBS。在細(xì)菌注射后0、2h、6h、12h、24h及48h,每組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)挑選3只蟹, 取卵巢組織提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測(cè), 通過公式2-ΔΔCt分析[22]EsCrus3和EsCrus4在不同細(xì)菌刺激后的表達(dá)模式。

甲殼肽原核重組表達(dá)根據(jù)EsCrus3和Es-Crus4序列, 設(shè)計(jì)含有特定酶切位點(diǎn)(BamH Ⅰ和Hind Ⅲ)的表達(dá)引物(表1), 隨后通過PCR擴(kuò)增目的片段, 目的片段酶切后與表達(dá)載體pET-32a連接; 將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 獲取表達(dá)菌株。陽(yáng)性菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)加入0.5 mmol/L的IPTG, 28℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h, 菌液離心后收集菌體, 加入PBS重懸菌體并進(jìn)行超聲破碎。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)情況, 隨后利用Ni-NTA His Bind Resin純化蛋白, 蛋白溶度通過Bradford法測(cè)定。

微生物結(jié)合活性檢測(cè)微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)EsCrus3和EsCrus4與不同類型微生物的結(jié)合活性, 實(shí)驗(yàn)步驟參照Z(yǔ)hu等[23]報(bào)道的方法。重組蛋白(150 μg/mL)分別與實(shí)驗(yàn)材料中的9種微生物(2×108CFU)于28℃振蕩孵育1h。離心后用TBS(50 mmol/L Tris-HCl和150 mmol/L氯化鈉; pH 7.5)洗滌沉淀3次, 并取最后1次洗滌液(Wash)制樣。隨后菌體中加入200 μL 7% SDS溫和振蕩10min,離心收集洗脫液(Elution)制樣。菌體沉淀(Pellet)經(jīng)TBS洗滌3次后制樣。重組蛋白EsCrus3和EsCrus4作為陽(yáng)性對(duì)照, 通過Western Blot檢測(cè)蛋白與微生物結(jié)合情況。依據(jù)洗滌液、洗脫液或沉淀中是否存在目的蛋白, 判斷蛋白與微生物的結(jié)合活性。

微生物多糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)用于評(píng)價(jià)EsCrus3和EsCrus4與5種不同來源的微生物多糖的結(jié)合活性。ELISA操作過程參照文獻(xiàn)[24]中方法。取100 μL多糖懸液(20 μg/mL)至96孔板中進(jìn)行包被, 陰性對(duì)照孔中加入等體積TBS。包被結(jié)束后加入200 μL BSA(5 mg/mL)于37℃封閉2h, 隨后加入TBST(0.05% Tween 20)洗滌4次。取100 μL梯度稀釋后的0—1 μmol/L重組蛋白EsCrus3、Es-Crus4或Trx (標(biāo)簽蛋白, 陰性對(duì)照), 分別加入洗滌后的96孔板中, 室溫孵育3h, TBST洗滌4次。每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的His標(biāo)簽抗體(1﹕5000稀釋), 于37℃孵育2h, TBST洗滌4次。加入100 μL現(xiàn)配的0.01% TMB發(fā)色液, 發(fā)色至顏色不再明顯變化, 加入50 μL H2SO4(2 mol/L)終止反應(yīng), 在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。所有實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

液體抑菌實(shí)驗(yàn)通過液體抑菌實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)Es-Crus3和EsCrus4抑菌活性, 具體操作參照文獻(xiàn)[25]所述方法。分別向96孔板中加入50 μL TBS梯度稀釋(0—1 μmol/L)的重組蛋白EsCrus3、EsCrus4或Trx, 再分別加入50 μL PB培養(yǎng)基(1% 胰蛋白胨,0.5% 氯化鈉; pH 7.5)稀釋的實(shí)驗(yàn)材料中所述的9種微生物(1×105CFU)。置于28℃孵育16h, 而后在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度, 檢測(cè)抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)最小生長(zhǎng)抑制濃度定義為與陰性對(duì)照相比獲得顯著生長(zhǎng)抑制的最低蛋白質(zhì)濃度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 兩個(gè)甲殼肽的序列特征

從中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的2條甲殼肽樣基因序列, 分別命名為EsCrus3和EsCrus4。經(jīng)基因克隆、測(cè)序后, 確認(rèn)EsCrus3全長(zhǎng)567 bp, 開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)為351 bp, 編碼116個(gè)氨基酸(Amino acid, aa), 包含N端信號(hào)肽21個(gè)aa, C端WAP結(jié)構(gòu)域50個(gè)aa(圖1A), 成熟肽的理論等電點(diǎn)為5.69, 理論分子量為10.63 kD;EsCrus4全長(zhǎng)743 bp, ORF為288 bp, 編碼95個(gè)aa, 包含N端信號(hào)肽20個(gè)aa, C端WAP結(jié)構(gòu)域50個(gè)aa (圖1B), 成熟肽的理論等電點(diǎn)為8.46, 理論分子量為8.19 kD; 兩個(gè)編碼蛋白都含有12個(gè)保守的半胱氨酸殘基, 8個(gè)位于WAP結(jié)構(gòu)域內(nèi), 4個(gè)位于信號(hào)肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間, 形成1個(gè)富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域(Cysteinerich region, CRR), 根據(jù)當(dāng)前甲殼肽分子的分類標(biāo)準(zhǔn)[6],EsCrus3和EsCrus4都屬于典型的Ⅰ型甲殼肽。

圖1 EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 cDNA and translated amino acid sequences of EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

2.2 相似性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

BLASTP分析結(jié)果顯示,EsCrus3與紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)StCrus(AFI56572)的一致性為68.89%, 與岸蟹(Carcinus maenas)CmCrus(CAH25399)的一致性為68.24%, 與鋸緣青蟹(Scylla serrata)Ss-Crus(ADW11096)的一致性為66.67%, 與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCrus(ACM89167)的一致性為58.88%;EsCrus4與三疣梭子蟹PtCrus2(AFU 61578)的一致性為47.30%, 與擬穴青蟹SpCrus4(AUV 47161)和SpCrus3(AUV47160)的一致性分別為44.68%和43.01%。同源比較顯示,EsCrus3和Es-Crus4與早期報(bào)道的EsCrus1和EsCrus2一致性為37.40%, 除半胱氨酸等少量氨基酸非常保守外, 其余氨基酸保守性很低(圖2)。此外,EsCrus3和Es-Crus4的一致性也僅有30.77%。

圖2 中華絨螯蟹中的四個(gè)甲殼肽的序列比對(duì)Fig. 2 The alignment of the four Crustin in the mitten crab

根據(jù)BLASTP搜索結(jié)果和已報(bào)道的甲殼動(dòng)物含WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白, 構(gòu)建了甲殼類WAP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。膜翅目昆蟲甲殼肽在文獻(xiàn)中常被歸為單獨(dú)類型[7], 本進(jìn)化樹未將此類分子列入分析。在構(gòu)建的進(jìn)化樹中, 含有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白被分為4組:Ⅰ組(Ⅰ型甲殼肽)、Ⅱ組(Ⅱ型甲殼肽)、Ⅲ組(Ⅲ型甲殼肽或SWD)和Ⅳ組(Ⅳ型甲殼肽或DWD)(圖3)。其中, Ⅰ組甲殼肽包含2個(gè)獨(dú)立的分支,EsCrus3和EsCrus4分別屬于兩個(gè)不同的分支?？紤]到這兩個(gè)分支的節(jié)點(diǎn)值均大于90, 表明這兩個(gè)分支都是具有分類意義的簇。雖然EsCrus3和EsCrus4均屬于Ⅰ型甲殼肽, 但兩者不在同一分類簇, 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn), 提示EsCrus3和EsCrus4可能具有不同的生物學(xué)功能。

圖3 EsCrus3、EsCrus4及其他甲殼動(dòng)物Crustin的系統(tǒng)分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of EsCrus3, EsCrus4 and other representative crustacean crustin

2.3 組織分布與表達(dá)模式

采用qRT-PCR方法分析了EsCrus3和EsCrus4的組織分布特征, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩者均在卵巢中高度表達(dá)(圖4)?？紤]到兩者都是以β-actin作為內(nèi)參基因分析相對(duì)表達(dá)水平, 通過比較可知, 這兩個(gè)基因在卵巢中的表達(dá)水平接近。除在卵巢中高度表達(dá)外,EsCrus3在心、精巢和肌肉中低水平表達(dá), 而EsCrus4也在心、鰓和腸組織中低水平表達(dá)。

圖4 EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的組織分布Fig. 4 Tissue distribution of EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

用金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌分別刺激中華絨螯蟹后, qRT-PCR分析EsCrus3和EsCrus4在卵巢中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示, 兩個(gè)基因都能在特定時(shí)間段響應(yīng)這兩種不同細(xì)菌的免疫刺激。Es-Crus3在2種不同細(xì)菌刺激后2h顯著表達(dá)(P＜0.05),而后逐漸回落至正常水平(圖5A和5B);EsCrus4在金黃色葡萄球菌刺激后12h時(shí)顯著表達(dá)(P＜0.05; 圖5C),在嗜水氣單胞菌刺激后24h時(shí)顯著表達(dá)(P＜0.05;圖5D), 推測(cè)EsCrus3和EsCrus4在抗菌過程中發(fā)揮不同的作用。EsCrus3響應(yīng)病原刺激更迅速, 發(fā)揮抗菌作用更早, 而EsCrus4很可能在細(xì)菌感染后期參與免疫反應(yīng)。

2.4 重組甲殼肽蛋白的制備

為進(jìn)一步探究EsCrus3和EsCrus4的生物學(xué)功能, 本研究通過原核表達(dá)體系表達(dá)了EsCrus3和Es-Crus4成熟肽序列, 隨后經(jīng)鎳柱純化獲得目的蛋白。SDS-PAGE電泳分析顯示, 在純化的重組蛋白EsCrus3和EsCrus4泳道中都存在1個(gè)特異的電泳條帶, 位置介于30—35 kD(圖6)。鑒于pET-32a載體本身含有1個(gè)Trx標(biāo)簽(-16 kD), 2個(gè)蛋白條帶位置與預(yù)期融合蛋白的大小基本相符, 表明觀察到的蛋白條帶為預(yù)期的重組蛋白EsCrus3和EsCrus4。

圖6 重組蛋白EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的 SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

2.5 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4的微生物結(jié)合活性

根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)中結(jié)合活性的定義[9], 可被SDS溶液洗脫但不能被TBS洗脫的蛋白,具有弱結(jié)合活性; 與菌體結(jié)合而不能被SDS洗脫的蛋白, 具有強(qiáng)結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白EsCrus3和EsCrus4主要存在于SDS洗脫液中, 且發(fā)色條帶深淺不一, 而TBS洗滌液(陰性對(duì)照) 和菌體沉淀樣品中除陽(yáng)性對(duì)照外均無目的蛋白條帶(圖7),表明兩種重組蛋白對(duì)9種微生物均屬弱結(jié)合, 并且結(jié)合力大小也存在差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示, 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4與9種不同的微生物均具有一定的結(jié)合活性。

圖7 EsCrus3 (A) 和 EsCrus4 (B) 對(duì)不同微生物的結(jié)合活性Fig. 7 Binding activities of recombinant EsCrus3 (A) and EsCrus4(B) to different microorganisms

2.6 重組蛋白的微生物多糖結(jié)合活性

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EsCrus3對(duì)PGN、LTA、LPS和β-葡聚糖都具有結(jié)合活性。其中,EsCrus3對(duì)PGN和LTA的結(jié)合活性較強(qiáng)(圖8A, 8B和8C), 對(duì)LPS和β-葡聚糖的結(jié)合活性較弱 (圖8D和8E);Es-Crus4僅對(duì)PGN具有結(jié)合活性 (圖8A和8B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EsCrus3對(duì)多糖的結(jié)合活性總體強(qiáng)于Es-Crus4。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了EsCrus3和EsCrus4與不同微生物具有結(jié)合活性, 很可能源于它們與不同來源微生物多糖的特異性結(jié)合。

圖8 EsCrus3和 EsCrus4 對(duì)不同微生物多糖的結(jié)合活性Fig. 8 Microbial polysaccharide-binding activity is shown by EsCrus3 or EsCrus4

2.7 重組蛋白液體抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

液體抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4在蛋白濃度范圍為0—1 μmol/L條件下, 對(duì)9種待檢測(cè)的微生物均未表現(xiàn)出抑制活性, 表明Es-Crus3和EsCrus4不具有抑制微生物生長(zhǎng)的能力。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不排除該蛋白在更高濃度下呈現(xiàn)抑菌效果, 文獻(xiàn)報(bào)道顯示甲殼肽通常抑制微生物能力較弱[9,26]。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道顯示, 甲殼肽主要表達(dá)于血細(xì)胞、鰓和胃等免疫相關(guān)組織[9,10,27,28]。本研究從中華絨螯蟹的生殖器官卵巢組織中鑒定了兩個(gè)甲殼肽同源分子。它們響應(yīng)金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的免疫刺激, 并且對(duì)多種病原微生物及多糖具有不同程度的結(jié)合活性, 提示這兩種甲殼肽在中華絨螯蟹卵巢免疫防御中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)Tassanakajon等[6]提出的分類標(biāo)準(zhǔn), 可以將甲殼肽分為5種主要類型, 不同類型甲殼肽的區(qū)分主要依據(jù)信號(hào)肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間序列差異。在Ⅰ型甲殼肽中, 信號(hào)肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間僅存在1個(gè)CRR結(jié)構(gòu)域; Ⅱ型甲殼肽在此區(qū)域有1個(gè)甘氨酸富集區(qū)(Glycine-rich region, GRR)和1個(gè)CRR結(jié)構(gòu)域;Ⅲ型甲殼肽在此區(qū)域則只有1個(gè)簡(jiǎn)短的富含脯氨酸和精氨酸的結(jié)構(gòu)域[4]; Ⅳ型甲殼肽無此區(qū)域, 但該類分子含有兩個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域[28]; Ⅴ型甲殼肽除CRR結(jié)構(gòu)域外, 還包含1個(gè)芳香族氨基酸富集區(qū)。中華絨螯蟹早期的研究已鑒定4個(gè)甲殼肽分子, 其中Es-Crus1和EsCrus2屬于Ⅱ型甲殼肽[14,15], 另外2個(gè)Ⅳ型甲殼肽被命名為Es-DWD和Es-DWD1[16,17]。本研究從中華絨螯蟹中鑒定了2個(gè)新型甲殼肽, 沿用一般命名規(guī)則, 將其分別命名為EsCrus3和EsCrus4,這兩個(gè)甲殼肽均具有WAP結(jié)構(gòu)域, 并且在信號(hào)肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間含1個(gè)由4個(gè)半胱氨酸形成的CRR結(jié)構(gòu)域; 進(jìn)化分析顯示這兩個(gè)新型抗菌肽與其他Ⅰ型甲殼肽具有更近的進(jìn)化關(guān)系(圖3), 這些結(jié)果表明EsCrus3和EsCrus4屬于典型的Ⅰ型甲殼肽?？紤]到EsCrus3和EsCrus4相似性較低, 并且進(jìn)化分析顯示兩者分別位于兩個(gè)不同的分支上, 提示兩者很可能具有不同的生物學(xué)功能。

中華絨螯蟹EsCrus1和EsCrus2均高表達(dá)于血細(xì)胞中, 并且它們對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有顯著的殺滅能力[14,15]。中華絨螯蟹作為一種節(jié)肢動(dòng)物, 其免疫系統(tǒng)與模式動(dòng)物果蠅具有很高的相似性, 半開放的體液循環(huán)體系確保了血淋巴可以覆蓋其機(jī)體實(shí)質(zhì)組織器官之外的所有部位。EsCrus1和EsCrus2具有信號(hào)肽, 提示它們屬于分泌性抗菌肽, 在中華絨螯蟹體液免疫中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)在卵巢組織中高度表達(dá)的甲殼肽分子, 它們有著相近的表達(dá)水平, 但兩個(gè)分子所發(fā)揮的功能可能存在較大差異。金黃色葡萄球菌[29]和嗜水氣單胞菌[30]分別為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原菌, 在病原刺激后,EsCrus3響應(yīng)迅速, 在刺激后2h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá), 而EsCrus4則在病原刺激后12—24h時(shí)才顯著上調(diào)表達(dá); 此外,EsCrus3結(jié)合微生物多糖的活性顯著高于EsCrus4, 推測(cè)EsCrus3的抗菌活性很可能要高于EsCrus4, 表明EsCrus3在病原微生物感染時(shí)發(fā)揮更加重要的作用。由此, 我們推測(cè), 除了免疫組織細(xì)胞分泌的免疫組分提供宿主免疫保護(hù)外, 非典型免疫組織如卵巢, 也可分泌抗菌肽等免疫組分, 在宿主免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用, 表明中華絨螯蟹體內(nèi)的多種不同來源的甲殼肽很可能存在協(xié)同抗微生物感染作用, 維持機(jī)體健康。

早期研究顯示Ⅰ型甲殼肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)出抗菌活性。例如, 從岸蟹血細(xì)胞中分離的第一個(gè)甲殼動(dòng)物甲殼肽, 只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑菌活性[27]; 擬穴青蟹中首個(gè)甲殼肽 (SpCrus) 可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌, 但不能抑制革蘭氏陰性菌[8]。后來的研究顯示, 部分Ⅰ型甲殼肽也具有微弱的抗革蘭氏陰性菌活性。例如, 蜘蛛蟹 (Hyas araneus) 的HaCru1和HaCru2除對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)出活性外, 對(duì)革蘭氏陰性菌和酵母菌也具有較低抑制活性[31]?；谏鲜鰣?bào)道我們推測(cè),EsCrus3和EsCrus4作為典型的Ⅰ型甲殼肽, 很可能也具有類似的抑菌譜?？咕目梢酝ㄟ^多種機(jī)制抑制或殺滅病原微生物, 而與病原微生物特異性結(jié)合則是抗菌肽執(zhí)行其抑菌功能的前提條件[32,33], 與病原微生物表面多糖的互作是抗菌肽與病原微生物結(jié)合的重要形式[34], 多糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)可說明抗菌肽與微生物結(jié)合的分子機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白EsCrus3和EsCrus4均具有結(jié)合革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌的能力, 推測(cè)這兩種抗菌肽可能具有廣譜抗菌活性。EsCrus3對(duì)多種微生物表面多糖具有特異性結(jié)合能力, 這很可能是其與多種微生物結(jié)合并具有廣譜抗菌潛力的內(nèi)在原因。相比之下,EsCrus4只結(jié)合來自革蘭氏陽(yáng)性菌的PGN?？紤]到EsCrus4能結(jié)合多種微生物, 推測(cè)EsCrus4除結(jié)合PGN外很可能還與微生物表面其他組分結(jié)合, 這需要更多實(shí)驗(yàn)來闡明。此外, 我們還發(fā)現(xiàn)EsCrus3和EsCrus4對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌來源的多糖結(jié)合活性更強(qiáng), 這很可能是兩者對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑制活性更強(qiáng)的內(nèi)在原因, 也解釋了大多數(shù)Ⅰ型甲殼肽可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的內(nèi)在分子機(jī)制。

盡管EsCrus3和EsCrus4都具有結(jié)合微生物的能力, 但在本研究中兩者預(yù)期的抑菌活性卻未獲得驗(yàn)證, 這可能是因?yàn)檫@兩個(gè)重組蛋白是通過原核表達(dá)獲得, 重組蛋白本身并未能獲得正確的三維結(jié)構(gòu),從而影響了抗菌肽的活性。此外, 據(jù)報(bào)道, 甲殼肽抗菌活性相對(duì)較弱[9,26], 本研究使用的最高蛋白濃度也僅為1 μmol/L, 很可能未達(dá)到抑菌活性的下限。因此, 要探明這兩種蛋白的抑菌性, 還需要借助其他實(shí)驗(yàn)手段, 比如利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備相應(yīng)的重組蛋白, 來探明其真實(shí)的抑菌活性。

總之, 本研究從中華絨螯蟹卵巢中鑒定了2個(gè)Ⅰ型甲殼肽基因, 它們均響應(yīng)細(xì)菌的免疫刺激, 并且它們的重組蛋白均具有廣譜的微生物結(jié)合活性。但相比之下EsCrus3響應(yīng)病原刺激更迅速、與病原多糖結(jié)合能力更強(qiáng), 表明EsCrus3在卵巢的免疫防御體系中發(fā)揮更重要的作用。本研究進(jìn)一步豐富了無脊椎動(dòng)物生殖系統(tǒng)免疫防御體系的理論,EsCrus3和EsCrus4序列和功能的差異為新型藥物的挖掘提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。