吳 植，吳 雙，袁慧莎，張 聰，朱善元，范紅結(jié)

（1.南京農(nóng)業(yè)大學，南京 200241；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室江蘇現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心，泰州 225300）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV），又稱Rous相關病毒[1]（Rous associated viruses,RAVs），屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正逆轉(zhuǎn)錄病毒科α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬成員[2]，其基因組結(jié)構(gòu)為5'LTR-5'UTRgag-pol-env-3'UTR-3'LTR，主要引起淋巴白血病、骨硬化病、骨髓成細胞增多癥、血管瘤等多種腫瘤性疾病[3-4]，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，目前尚無有效藥物和疫苗可供使用，控制該病最有效的措施是對種雞核心群開展凈化[5-6]。根據(jù)獨特的感染宿主細胞的受體不同，將ALV分為11個亞群（A-K），其中A～E、J和K亞群均可自然感染雞群，而F、G、H和I等亞群多見于野生鳥類[7]。感染雞群的ALV-E亞群通常認為屬于內(nèi)源性病毒，它能夠?qū)⒆陨淼幕蚱握现了拗骷毎娜旧w中，以前病毒的形式存在[8]。

盡管我國自2008年起已在雞群中實施了嚴格的ALV根除計劃，但是由于我國雞群種類繁雜，A、B、E、J和K等亞群ALV在中國仍然流行且非常嚴重[9-11]，呈現(xiàn)出多個亞群混合感染、極易發(fā)生變異或重組、有效逃避宿主免疫防御、感染宿主不斷擴大和致病性更為復雜等特點[12-13]，給禽白血病的防控帶來了巨大挑戰(zhàn)，因此不斷開展ALV的分離鑒定對研究該病的流行情況，基因組變異趨勢及種群凈化具有重要意義。本研究是在對江蘇某地方品種種雞場進行白血病凈化過程中，從無明顯臨床癥狀病死雞組織樣品中分離鑒定獲得的1株ALV-E，并對其進行了全基因組測序和遺傳演變趨勢分析，為我國ALV-E分子流行病學調(diào)查提供了參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pMD-19T、PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）、DL2000購自TaKaRa公司；Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA提取試劑盒、2×Taqplus MasterMix凝膠回收試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；E.coliDH5α購自Promega公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；ALV p27單克隆抗體由揚州大學獸醫(yī)學院惠贈；山羊抗小鼠FITC-IgG購自Sigma公司；ALV抗原檢測試劑盒購自IDEXX公司；山羊抗小鼠FITC-IgG購自Sigma公司。

1.2 病料與細胞 無明顯癥狀病死雞的心臟、肝臟、肺臟、腎臟和法氏囊等來源于江蘇某一地方品種種雞場；CEF細胞由SPF級雞胚按照常規(guī)方法制備獲得；DF-1細胞由本實驗室保存。

1.3 病料的檢測 將采集的心臟、肝臟、肺臟、腎臟和法氏囊進行研磨處理，參照Viral DNA/RNA Kit DNA/RNA提取試劑盒說明書進行核酸提取，參照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，參照GenBank上所公布的序列，設計特異性檢測引物用于檢測雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia Virus,CIAV）、傳染性喉氣管炎病毒（laryngotracheitis virus,ILTV）、馬立克氏病病毒（Marek's disease virus,MDV）、傳染性支氣管炎病毒（Influenza B viruses,IBV）、H9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus H9 subtype,H9 AIV）、禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）和禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV），引物序列見表1，上述引物均由英濰捷基（上海）有限公司合成。

表1 雞常見傳染性病毒病的檢測引物Table 1 Primers for detection of common infectious viruses in chicken

1.4 病毒的分離培養(yǎng) 參考文獻[14]建立的方法，將PCR初步鑒定為ALV陽性病料研磨上清液分別接種于已將狀態(tài)調(diào)整至最佳且生長密度達70%的CEF細胞和DF-1細胞中，吸附作用3 h后補加含1%血清的DMEM維持液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后反復凍融2次，離心去除細胞碎片并收集上清液，采用p27抗原檢測試劑盒（IDEXX）檢測，按照上述方法盲傳6代，病毒液于-80℃保存。

1.5 病毒的間接免疫熒光 將P3代CEF細胞培養(yǎng)上清接種到經(jīng)抗原檢測陰性的已長成單層的雞胚成纖維細胞上，維持7 d后，以ALV p27單克隆抗體為一抗，以山羊抗小鼠FITC-IgG為二抗，利用間接免疫熒光檢測病毒在CEF的增殖情況，并設立陽性對照組和陰性對照組。

1.6 前病毒全基因克隆與測序 根據(jù)文獻[15]合成7對引物擴增禽白血病病毒的全基因組，擴增引物見表2。各段PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物連入pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)宿主菌，篩選的陽性克隆送至南京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

表2 ALV全基因組擴增引物Table 2 Amplification primer of ALV whole genome sequence

1.7 前病毒全基因組序列分析 用DNAStar 7.0/SeqMan軟件對分離株各片段序列進行全長拼接；用BioEdit 7.2.6.1軟件將分離株與GenBank登錄的各亞群ALV參考株進行多序列比對，確定ALV分離株各基因序列；gp85氨基酸序列用MEGA X軟件繪制遺傳進化樹，確定分離株亞群類型。

2 結(jié)果

2.1 病料的檢測 PCR/RT-PCR檢測的結(jié)果顯示，CAV、ILTV、MDV、IBV、H9 AIV、FAdV、REV均為陰性，ALV擴增結(jié)果顯示獲得了約720 bp的特異性條帶，與預期的大小相符（圖1），將PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，結(jié)果正確，說明成功擴增目的基因。

圖1 病死雞病料的PCR/RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 The identification results of sick materials of dead chickens by PCR/RT-PCR

2.2 p27抗原的檢測 盲傳6代的DF-1細胞上清液用p27抗原檢測試劑盒檢測p27抗原，檢測結(jié)果為陰性，而CEF傳代的細胞上清液PCR檢測結(jié)果為陽性，證實具有傳染性病毒粒子存在，且ELISA檢測S/P值隨著代次增加呈下降趨勢，以上結(jié)果初步表明該分離毒株為ALV-E，且該病毒在CEF培養(yǎng)中復制能力很弱，將毒株命名為JY202106。

2.3 病毒的IFA鑒定 IFA結(jié)果顯示，ALV p27單克隆抗體與病毒感染細胞呈陽性反應，被感染細胞的細胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光，而空白對照組并不能激發(fā)綠色熒光，表明JY202106株能有效感染CEF細胞（圖2）。

圖2 JY202106株的IFA檢測結(jié)果（200×）Fig.2 The IFA results of JY202106 isolate (200×)

2.4 前病毒全基因組序列分析 該分離株分7段擴增了禽白血病病毒的基因組，片段長度分別為2545、1069、808、1202、1106、1075、402 bp（圖3）。JY202106分離株經(jīng)測序之后，用SeqMan軟件對測序結(jié)果進行拼接，獲得該分離株全基因組核苷酸序列。通過拼接之后，結(jié)果顯示JY202106分離株全病毒基因組全長為7529 bp，與參考株的同源性為84.3%～98.7%。將JY202106分離株與GenBank上已發(fā)表的各亞群ALV參考株基因組各片段進行同源性分析。由結(jié)果可知，gag和pol基因相對保守，與各亞群ALV參考株同源性95.5%～99.7%，gp37基因亦相對保守，除了ALV-J之外，同源性達91.9%～99.3%，JY202106分離株gp85基因與ev-1分離株同源性最高（99.2%）。位于病毒基因組兩端的末端重復序列5'LTR和3'LTR長274 bp，與ALV-E參考株ev-1同源性最高，一致性達99.6%。同時與其他ALV-K參考株（GD14LZ、km-5845）、ALV-A參考株（PDRC-1039）亦有較高的同源性，一致性達97.0%～98.7%（表3）。

圖3 JY202106分離株全基因組擴增Fig.3 Whole genome amplification of JY202106 isolate

表3 分離株與各亞群ALV參考株基因組各片段核苷酸同源性比較Table 3 Comparison of homology between the whole genome sequence of JY202106 isolate and the reference strains of ALV subgroup

2.5gp85基因序列分析 分離株JY202106的gp85基因為978 bp，編碼326個氨基酸，氨基酸同源性結(jié)果分析顯示，該分離株與ALV-A參考株同源性為86.1%～86.7%，與ALV-B參考株同源性為85.7%～86.0%，與ALV-C參考株同源性為86.9%～90%，與ALV-D參考株同源性為87.3%，與ALV-K參考株同源性為85.3%～87.4%，與ALV-J參考株同源性僅為49.2%～50.5%，而與ALV-E參考株同源性為98.2%～99.2%，同源性顯著高于其他亞群ALV，根據(jù)ALV-gp85氨基酸序列亞群鑒定方法，JY202106分離株屬于ALV-E。對JY202106分離株與GenBank上的各亞群ALV參考株gp85氨基酸序列進行比對并繪制遺傳進化樹可知，JY202106分離株與ev-1、ev-3、RAV-0、SDO5O1等歸類為ALV-E的參考株屬于同一分支，而有別于其他亞群參考株，進一步驗證了其亞群分類屬于ALV-E，其與SDO5O1株gp85氨基酸序列遺傳關系最為密切（圖4）。

圖4 JY202106分離株與ALV各亞群參考株gp85序列進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of gp85 sequence of JY202106 isolates and reference strains of ALV subgroups

3 討論

ALV可以引起一定比例雞群產(chǎn)生不同程度的腫瘤，但是大多數(shù)感染雞僅表現(xiàn)亞臨床感染，出現(xiàn)一定程度的免疫抑制、產(chǎn)蛋下降。20世紀90年代以來，國內(nèi)的白羽肉雞、黃玉肉雞蛋雞先后遭受了白血病危害，造成巨大損失，此病還具有向中國其他品系雞蔓延的趨勢[16]。ALV從雞群中分離到的只有A、B、C、D、E和J 6個亞群。其中E亞群是內(nèi)源性的，即其前病毒cDNA存在于大多數(shù)雞群的染色體基因組中，有的能從染色體基因組產(chǎn)生完整的病毒粒子或者僅表達某些蛋白質(zhì)，通常內(nèi)源性白血病沒有致病性或者致病性很低，但是會干擾外源性ALV的檢測。

本研究對江蘇某雞場送檢病料進行了白血病病毒檢測，分離鑒定出1株內(nèi)源性ALV，命名為JY202106。經(jīng)過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其具有完整的基因組，對其進行了系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明，該分離株全長7529 bp，gag、pol基因保守性較高，二者與ALV其他亞群間核苷酸同源性均在95.5%以上，而gp85基因與E亞群參考毒株的同源性顯著高于其他亞群，在遺傳進化分析上與E亞群參考株隸屬于同一分支，進一步表明該分離株為E亞群ALV。分離株JY202106 5'LTR基因核苷酸序列與K亞群分離株TW-3593、GD14LZ同源性高達98.2%，猜測此分離株有可能與ALV-K分離株TW-3593、GD14LZ有共同祖先。LTR啟動活性的強弱與ALV致瘤的強弱密切相關，而內(nèi)源性病毒的致瘤作用很弱，JY202106分離株與ALV內(nèi)源性毒株ev-1、SDO5O1、AF227株的LTR核苷酸序列同源性達98%以上，而與其他亞群的同源性相對較小，據(jù)此推測，本研究分離株的致瘤作用可能也很弱。

眾所周知，內(nèi)源性ALV-E既會影響外源性ALV感染，同時也能影響疾病進程及宿主正常的生理活動。據(jù)報道，具有轉(zhuǎn)錄活性的ALV-E能夠?qū)е履承┲匾?jīng)濟特征的降低，例如產(chǎn)蛋量和蛋重。本研究通過將病料研磨液接種DF-1及SPF雞胚來源的CEF，結(jié)果顯示在對內(nèi)源性病毒有抵抗的DF-1細胞無病毒復制，而能在ALV各亞群均能生長的CEF上p27檢測陽性，顯示有病毒感染CEF，且該病毒攜帶具有傳染性的病毒粒子，但僅僅是內(nèi)源性的ALV-E。本研究不足以證明該毒株能誘導雞群腫瘤的產(chǎn)生，這可能與雞群體內(nèi)載毒量有關，當病毒復制到一定水平時，動物就會發(fā)病。ALV凈化對養(yǎng)殖場來說是非常必要的，臨床上ALV-E分離越來越常見，因此在生產(chǎn)中應引起足夠的重視。本研究通過RT-PCR檢測和序列比對，確定送檢病雞中存在ALV-E亞型感染，表明江蘇某雞場內(nèi)存在內(nèi)源性ALV感染，內(nèi)源性ALV對雞來說不是必須的，能否通過某些技術(shù)（基因編輯）培育出無內(nèi)源性ALV基因的雞品種還需要進一步來驗證。