張 寧，劉 偉，吳銘潔，夏霖亞，王 蕾，殷玉和，石 晶，吳叢梅

（1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春 130000；2.長春西諾生物科技有限公司，長春 130000）

弓形蟲是一種胞內(nèi)的原生動物寄生蟲，感染幾乎所有溫血動物，全世界大約有30%的人口感染弓形蟲[1-2]。在沒有弓形蟲疫苗上市的情況下，弓形蟲給人類和畜牧業(yè)造成了嚴重的威脅。因此，弓形蟲抗體的檢測對于弓形蟲病的早期診斷和治療具有重要意義。

目前，王釗哲等[3]利用大腸桿菌對弓形蟲表面抗原SAG1-SAG2重組抗原進行表達并純化，將此蛋白作為檢測抗原制備了膠體金試紙。朱傳剛等[4]利用大腸桿菌BL21將GRA1-GRA7蛋白進行表達及純化，并將GRA1-GRA7蛋白為標記抗原制備膠體金試紙檢測豬弓形蟲抗體。研究表明，弓形蟲多種蛋白均可刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以篩選出敏感高、特異性強的抗原是研制弓形蟲檢測試劑的關(guān)鍵[5]。因此，本研究擬采用大腸桿菌表達GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2三種蛋白，通過ELISA方法進行檢測比較，選擇具有較強敏感性的蛋白制備成膠體金免疫層析試紙，以期制備出敏感性高和特異性強的檢測貓弓形蟲抗體的試紙，為弓形蟲病的早期治療提供切實可行的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物 感受態(tài)細胞ER2566由吉林大學(xué)艾滋病疫苗國家工程實驗室提供和保存；DNA marker購自TaKaRa公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ購自TaKaRa公司；氯金酸購自生工生物工程（上海）技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購自德國賽多利斯公司；HRP標記羊抗貓IgG抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）、BSA購自Sigma公司；弓形蟲間接血凝試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。貓弓形蟲陽性血清由事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所提供。貓細小病毒陽性血清、貓杯狀病毒陽性血清和貓皰疹病毒陽性血清由長春西諾生物科技有限公司提供。

1.2 表達載體的鑒定 為了在大腸桿菌中表達和純化GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白，利用GeneOptimizer軟件對弓形蟲RH蟲株的GRA1（GenBank登錄號：HM067753.1）、GRA7（GenBank登錄號：DQ459443.2）、SAG1（GenBank登錄號：X14080）、GRA6（GenBank登錄號：MH675993.1）和GRA2（GenBank登錄號：HM014012.1）基因序列進行了密碼子優(yōu)化，由南京金斯瑞生物有限公司合成后連入載體pET-28a中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切鑒定以及測序分析確認。

1.3 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白的表達和純化 將重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞ER2566中，將重組質(zhì)粒菌液分別接種于5 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm搖菌過夜。以1∶100比例接種于500 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下220 rpm至OD600值為0.7左右。加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)25℃、220 rpm培養(yǎng)16 h。10 000 ×g離心10 min，收集上清液和沉淀，采用His親和層析柱對表達的重組蛋白進行純化，最后進行SDS-PAGE電泳分析和Western blot鑒定。

1.4 ELISA檢測蛋白敏感性 每孔加入3 μg/mL的目的蛋白100 μL，4℃包被過夜；PBST洗板3次，5 min/次，加入5%BSA封閉2 h；洗板后將貓弓形蟲陽性血清作分別按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048進行稀釋，每孔加樣100 μL，37℃孵育2 h；二抗選用HRP標記羊抗貓IgG抗體，最后檢測三種蛋白敏感性，分別設(shè)置空白對照和陰性血清對照。根據(jù)檢測結(jié)果選擇出具有較好敏感性的蛋白。

1.5 膠體金最適pH和最適蛋白標記量的確定

1.5.1 最適pH的確定 用0.2 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)1 mL膠體金，分別加3、6、9、12 μL充分混勻，再向各管中加50 μL目的蛋白，混勻，靜置30 min。再加入10%NaCl，充分混勻，靜置2 h。觀察顏色變化。選擇開始無聚集膠體金顏色為紅色的離心管，作為膠體金溶液最適K2CO3量，即最適pH值。

1.5.2 最適蛋白標記量的確定 用PBS緩沖液將待標記的1 mg/mL目的蛋白2倍稀釋至1∶256，每個稀釋度各取30 μL，并且加入調(diào)好pH的膠體金溶液125 μL，15 min后，每個稀釋度加入125 μL 100 mg/mL的NaCl溶液，靜置15 min，觀察膠體金的顏色變化。

1.6 目的蛋白的膠體金標記 取調(diào)好pH值的膠體金溶液100 mL，快速攪拌下加入375 μL目的蛋白至膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌1 h。加入濃度為100 mg/mL的牛血清白蛋白使終濃度為10 g/L，封閉2 h。以7500 ×g離心20 min，吸取上清液溶液，沉淀物為初步純化的金標抗原結(jié)合物，將沉淀用重懸液溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 膠體金試紙條的制備

1.7.1 組裝 將標記好的金標抗原結(jié)合物用噴金劃膜儀均勻的噴在300 mm×5 mm的玻璃纖維上，制成金標墊，37℃鼓風(fēng)干燥2 h后，加入干燥劑于室溫密封保存，選用的NC膜用噴金劃膜儀將SPA作為檢測線（T線）、兔抗弓形蟲目的蛋白IgG作為質(zhì)控線（C線），置于37℃ 2 h后，密封保存?zhèn)溆?；然后按照包被好的NC膜、膠體金標記的玻璃纖維和吸水紙的順序，依次貼在PVC底板上。

1.7.2 檢測結(jié)果判定 首先將組裝好的試紙條平放于桌面上，吸取適量待測血清于加樣孔，室溫靜置10 min，判定結(jié)果。當(dāng)T線和C線出現(xiàn)紅色線時，結(jié)果判定為陽性；當(dāng)T線未有紅色線，C線處出現(xiàn)紅色線，結(jié)果判定為陰性；當(dāng)C線不出現(xiàn)紅色線時，說明此試紙條無效。

1.8 膠體金試紙條的評價

1.8.1 試紙條敏感性檢測 將陽性血清進行不同倍數(shù)稀釋，按照上述1.7.2檢測方法操作，每個稀釋度檢測3次，觀察試紙條檢測結(jié)果。

1.8.2 試紙條特異性檢測 用組裝好的試紙條檢測已知的貓細小病毒陽性血清、貓杯狀病毒陽性血清和貓皰疹病毒陽性血清，并根據(jù)上述標準進行結(jié)果判定。

1.9 臨床樣本檢測 用組裝好的膠體金試紙對長春地區(qū)某寵物醫(yī)院的289份貓血清進行檢測，并與間接血凝法（indirect heamagglutination assay,IHA）進行比較。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的構(gòu)建 將優(yōu)化的GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2基因序列連入載體pET-28a，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ分別對pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2進行雙酶切。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2構(gòu)建正確（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7（A）、pET28a-SAG1（B）和pET28a-GRA6-GRA2（C）雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids pET28a-GRA1-GRA7 (A),pET28a-SAG1 (B) and pET28a-GRA6-GRA2 (C)

2.2 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白的表達和純化 pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，進行SDS-PAGE，以pET-28a載體為對照，GRA1-GRA7蛋白在約50 kDa處可見特異性條帶（圖2），SAG1蛋白在約56 kDa處可見特異性條帶（圖3），GRA2-GRA6蛋白在約64 kDa處可見特異性條帶（圖4），分子質(zhì)量與目的蛋白一致，并且收獲到的蛋白純度高于85%。Western blot結(jié)果顯示目的蛋白能與鼠源弓形蟲陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)（圖2B、圖3B、圖4B），證明表達產(chǎn)物有較好的抗原特異性。

圖2 GRA1-GRA7蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of GRA1-GRA7 protein

圖3 SAG1蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of SAG1 protein

2.3 ELISA檢測蛋白敏感性結(jié)果 分別利用GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白進行包被，倍比稀釋貓弓形蟲陽性血清作為一抗進行孵育，ELISA檢測三種蛋白的敏感性，結(jié)果可知，GRA6-GRA2蛋白具有較好的抗原反應(yīng)性（表1）。

表1 ELISA檢測蛋白敏感性結(jié)果Table1 The result of protein sensitivity of ELISA test

表2 臨床樣本膠體金免疫層析檢測試紙檢測結(jié)果Table 2 The results of colloidal gold immunochromatographic test strip in clinical samples

2.4 膠體金最適pH和最適蛋白標記量的確定 用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值，1 mL膠體金當(dāng)加入12 μL的0.2 mol/L K2CO3時，膠體金溶液的顏色由藍色變紅色，結(jié)果可知，最終結(jié)果表明1 mL膠體金加入12 μL 0.2 mol/L K2CO3為最適pH值（圖5）。調(diào)節(jié)膠體金pH值后，加入GRA6-GRA2蛋白，用蛋白濃度梯度的方法，結(jié)果可知，在第6到第7個孔處溶液有紅變藍，最終表明第6孔處為最適標記蛋白標記量，蛋白標記量為3.75 μg/mL（圖6）。

圖5 膠體金標記GRA6-GRA2蛋白最適pH值確定Fig.5 Determination of the optimal pH value of GRA6-GRA2 protein labeled with colloidal gold

圖6 最適標記蛋白標記量的測定Fig.6 Determination of optimal labeling protein labeling amount

2.5 敏感性檢測 將貓弓形蟲陽性血清倍比稀釋，如圖7所示，檢測弓形蟲陽性血清稀釋至1∶256時，試紙條的檢測結(jié)果判定為陽性，弓形蟲陽性血清稀釋至1∶1024時，檢測結(jié)果為陰性。本試紙條可檢測稀釋至1∶256的弓形蟲陽性血清。

圖7 弓形蟲抗體膠體金免疫層析試紙條敏感性的檢測結(jié)果Fig.7 The detection result of sensitivity test of Toxoplasma antibody colloidal gold immunochromatographic test strip

2.6 特異性檢測 用弓形蟲抗體膠體金免疫層析試紙條對已知的貓弓形蟲陽性血清、貓細小病毒陽性血清、貓杯狀病毒陽性血清和貓皰疹病毒陽性血清進行特異性檢測，結(jié)果見圖8，試紙條檢測貓細小病毒陽性血清、貓杯狀病毒陽性血清和貓皰疹病毒陽性血清時，只有質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅的線，檢測線不出現(xiàn)紅色條帶，為陰性結(jié)果，說明試紙?zhí)禺愋粤己谩?/p>

圖8 弓形蟲抗體膠體金免疫層析試紙條特異性的檢測結(jié)果Fig.8 The detection result of specificity test of Toxoplasma antibody colloidal gold immunochromatographic test strip

2.7 臨床樣本檢測結(jié)果 對長春6家寵物醫(yī)院共289份貓待檢血清進行檢測，結(jié)果表明，采用膠體金試紙條檢出7份陽性血清，陽性率為2.42%；IHA檢出6份陽性血清，陽性率為2.07%，二者檢測的符合率為99.5%，這可能與貓?zhí)幱诠蜗x感染早期抗體水平低有關(guān)，由于檢測樣本為臨床樣本，很難追蹤貓個體情況，因此未對此差異樣本進行進一步的分析檢測。

3 討論

研究表明可作為診斷抗原的有SAG1、SAG2、SAG3、GRA1、GRA7、GRA6和GRA2蛋白等。SAG1為弓形蟲的表面蛋白，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE等多種抗體，也是目前國內(nèi)外研究較多的具有強免疫原性的診斷分子[6]。GRA1、GRA7、GRA2和GRA6蛋白都屬于致密顆粒蛋白（dense granule，GRAs），它們參與弓形蟲在宿主細胞內(nèi)的納蟲空泡(PV)和PV膜的修飾以維持細胞內(nèi)寄生，保護納蟲泡內(nèi)蟲體的存活[7]。本研究選擇SAG1、GRA1-GRA7和GRA6-GRA2蛋白進行篩選，結(jié)果表明GRA6-GRA2蛋白的敏感性高于SAG1、GRA1-GRA7蛋白的敏感性，最高可檢測稀釋至1∶1024的貓弓形蟲陽性血清，因此，GRA6-GRA2蛋白檢測弓形蟲抗體具有良好的抗原反應(yīng)性。

GRA2蛋白在弓形蟲的緩殖子時期和速殖子時期均存在，是潛在的抗原標記物，可誘發(fā)較強的抗體反應(yīng)[8]。GRA2是由185個氨基酸組成的多肽，其中185個氨基酸中包含3個α螺旋的兩性區(qū)域，其中一個α螺旋區(qū)域可以結(jié)合該蛋白的C端和N端，從而誘導(dǎo)納蟲泡的形成[9]。目前研究表明GRA2在感染弓形蟲急慢性期中是普遍存在的，它至少有3個B細胞表位和1個T細胞表位，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生一系列的抗體，激活CD4+T細胞，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護[10]。Ching等[11]用重組蛋白GRA2蛋白采用Western blot方法對弓形蟲陽性血清進行檢測，結(jié)果表明GRA2蛋白抗原能區(qū)分近期感染和既往感染。GRA6蛋白具有比較強的抗原活性，可以刺激機體產(chǎn)生抗體，在緩殖子和速殖子期均可表達，它不含內(nèi)含子，是單拷貝基因，有一個開放閱讀框大小為735 bp，可以編碼230個氨基酸。Lecordier等[12]將GRA6開放閱讀框序列基因全部導(dǎo)入pGEX表達載體中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有編碼N端的重組抗原能被感染弓形蟲的人血清所識別，表明GRA6 N端多肽含有抗原表位能被B淋巴細胞識別，用GRA6 N端的親水蛋白多肽構(gòu)建的重組抗原可以檢測弓形蟲感染者血清IgG（ELISA）并且敏感性可達96%。而GRA2同GRA6可以形成一個多聚復(fù)合體，它是構(gòu)成納蟲泡網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因子[13]。Amina等[14]研究結(jié)果表明GRA6可能通過穩(wěn)定GRA2誘導(dǎo)膜小管對納蟲泡管網(wǎng)絡(luò)的形成起重要作用。因此，本研究獨特的選用了GRA6-GRA2進行重組，對于貓弓形蟲陽性血清表現(xiàn)出較高的敏感性，可以作為弓形蟲抗體檢測的特異性抗原，為弓形蟲抗體檢測技術(shù)的開發(fā)提供了保障。

弓形蟲病是一種常見的人畜共患病。目前，對該病的診斷和檢測方法主要有IHA法，但此方法的敏感性較低，易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。而ELISA、PCR技術(shù)等雖然敏感性較高、特異性較強，但操作較復(fù)雜，不適合大規(guī)模篩查檢測，存在普遍的局限性。為了提高弓形蟲檢測的敏感性，縮減檢測的時間，并減輕檢測人員的工作負擔(dān)，本研究利用GRA6-GRA2重組蛋白作為膠體金試紙的診斷抗原進行貓弓形蟲抗體檢測。此試紙可以檢測到陽性血清稀釋至1∶256的結(jié)果，同時還具有良好的特異性，適用于弓形蟲病的早期診斷。

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2016年，張啟龍等[15]對北京地區(qū)835份貓血清進行檢測，檢出弓形蟲陽性率為1.92%；2017年，夏春芳等[16]針對伊寧市40份貓血清進行檢測，檢出弓形蟲陽性率為33.3%；2018年，禹海杰等[17]對嘉興市256份貓血清進行檢測，檢出弓形蟲陽性率為11.3%；2019年，韓云珍等[18]對福州城區(qū)221份貓血清進行檢測，檢出弓形蟲陽性率為2.71%，說明不同地區(qū)的貓都存在著一定的弓形蟲流行率。本研究針對2020年長春6家寵物醫(yī)院共289份貓血清進行膠體金檢測，并與IHA進行對比，結(jié)果膠體金試紙條陽性檢出率為2.42%，IHA陽性檢出率為2.07%，二種方法的符合率為99.5%，這一結(jié)果與王艷華等[19]的比較膠體金試紙與IHA兩種方法的結(jié)果相符合，同時說明長春地區(qū)的貓存在著一定的弓形蟲流行率，威脅著人與動物的生命健康，因此對弓形蟲病的診斷試劑盒的開發(fā)和研究有著重要意義。

本研究結(jié)果表明，利用GRA6-GRA2重組蛋白制備的膠體金試紙，具有良好的敏感性和特異性，可以應(yīng)用于弓形蟲病的早期診斷。