李林清,程維剛,李孟祥,張升華,郭 苒,朱巧晴,伍當(dāng)柔,喬 亮,高社干,齊義軍

0 引 言

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅由腫瘤細(xì)胞的固有特征決定,如癌基因激活、腫瘤抑制基因失活,腫瘤微環(huán)境中其它多種類型細(xì)胞、炎癥因子、微生物等也影響著腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[1-2]。腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞識(shí)別、清除腫瘤細(xì)胞;反之,腫瘤細(xì)胞也能夠影響免疫細(xì)胞的表型和功能,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[3-4]。程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞,與程序性死亡受體(programmed death-1,PD-1)結(jié)合后逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷[5-6]?？筆D-1(Nivolumab、Pembrolizumab等)或抗PD-L1單克隆抗體(Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab等)阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合,能夠重新激活機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng),是近年來免疫治療的重要手段?？筆D-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)治療的臨床療效與腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境中免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的PD-L1表達(dá)密切相關(guān)[3,7-9]。此外,腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)的PD-L1還與Th1型免疫反應(yīng)、效應(yīng)T細(xì)胞、干擾素γ(interferon γ,IFN γ)等免疫激活相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)[3,7,10]。由此可見,PD-1/PD-L1在腫瘤演進(jìn)過程中具有雙重作用,在不同腫瘤、腫瘤進(jìn)展不同階段、腫瘤患者機(jī)體不同組織中發(fā)揮著促進(jìn)或抑制腫瘤的作用。TCF-1作為調(diào)節(jié)T細(xì)胞生長(zhǎng)的因子,不僅在T細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用,更是作為一個(gè)重要的抗腫瘤因子,確保T細(xì)胞正常生長(zhǎng),而不發(fā)生癌變。有研究表明,TCF-1在早期TeX細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育中起到促進(jìn)作用,并明確了PD-1和TCF-1有協(xié)同作用[3-4]。然而至今未有研究闡明食管鱗癌外周血細(xì)胞中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)的關(guān)系。

無癥狀腫瘤患者外周血中,腫瘤自身抗體檢出時(shí)間可比臨床癥狀或體征提早出現(xiàn)數(shù)月至數(shù)年,表明早期腫瘤細(xì)胞已激活機(jī)體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)[11-13]。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者外周血中p53、NY-ESO-1、MMP-7、Hsp70、Prx VI、Bmi-1等6項(xiàng)腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體,57%患者外周血中至少檢測(cè)出1種腫瘤自身抗體;并且這些抗體組合鑒別診斷早期ESCC的敏感性和特異性達(dá)到了46%和96%[14]。非小細(xì)胞肺癌早期病變中能夠檢測(cè)到腫瘤克隆新抗原特異性PD-L1+CD8+T細(xì)胞,表明抗腫瘤免疫反應(yīng)激活,并且PD-L1+CD8+T細(xì)胞富集與抗PD-1/CTLA-4免疫檢查點(diǎn)治療的臨床療效呈正相關(guān)[15]。腫瘤患者外周血中PD-1、PD-L1、CD8等免疫反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)與乳腺癌、胃癌等多種腫瘤預(yù)后相關(guān)[16-17]。因此,本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ESCC患者外周血細(xì)胞中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA 表達(dá)并分析這3個(gè)mRNA分子在ESCC診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的效能。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2019年1月至2019年12月病理確診的91例ESCC患者術(shù)前外周靜脈血標(biāo)本。其中,男60例、女31例,年齡44～80歲,平均(67.0±7.4)歲?；颊吲R床病理資料通過醫(yī)院病案管理系統(tǒng)收集,電話隨訪收集患者生存信息,末次隨訪時(shí)間為2021年2月,總生存期(overall survival,OS)為手術(shù)日至患者死亡或末次隨訪時(shí)間。ESCC患者外周血標(biāo)本于手術(shù)日前1 d經(jīng)肘靜脈采集靜脈血5 mL,室溫靜置30 min,以3000 r/min離心5 min分離血細(xì)胞和血漿,分裝后-80 ℃冰箱保存。另收集63例非癌對(duì)照者,其中男27例、女36例,年齡47～86歲,平均(67.0±8.4)歲。所有非癌對(duì)照者在外周血采集后隨訪12個(gè)月,排除在此期間確診的癌患者。根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)與國(guó)際抗癌聯(lián)盟(AJCC-UICC)制定的第8版食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn),對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM進(jìn)行分期。該研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2022-03-13050)。

1.2主要試劑反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (R211-01/02)、qRT-PCR試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q111-02/03)均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;Trizol購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;異丙醇、三氯甲烷和無水酒精均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;DEPC水購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司。

1.3研究方法

1.3.1 外周血細(xì)胞RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄于200 μL血細(xì)胞中加入800 μL Trizol,提取RNA,NanoDrop Lite 紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/280值;HiScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.2實(shí)時(shí)定量PCRPD-L1、PD-1、TCF-1和GAPDH引物由生工生物工程有限公司合成。見表1。qPCR使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Q111-02/03)試劑盒,反應(yīng)體系為20 μL,每個(gè)樣品重復(fù)3次。血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)量以GAPDH作為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用R4.1.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)差異應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析,χ2檢驗(yàn)進(jìn)行臨床病理特征相關(guān)性分析。受試者操作特征(ROC)曲線分析確定最佳界值,曲線下面積(AUC)評(píng)估各分子標(biāo)志物的敏感性和特異性。Cox單因素、多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析PD-L1、PD-1、TCF-1和臨床病理特征對(duì)OS影響。Kaplan-Meier繪制生存曲線,log-rank檢驗(yàn)確定不同組別生存曲線差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌患者和非癌對(duì)照者外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)91例ESCC患者外周血細(xì)胞中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá),其相對(duì)表達(dá)量均值分別為5.75±2.50、6.66±2.70和6.50±2.29,顯著高于非癌對(duì)照組的4.38±2.25、3.54±1.61和4.45±1.15(P=1.2E-3、P=4.9E-11和P=8.3E-9)。見圖1。

圖1 食管鱗癌和非癌對(duì)照外周血細(xì)胞中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)

2.2外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)相關(guān)性分析和ROC分析ROC分析確定PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA診斷ESCC的最佳界值分別為4.52、5.42、5.96,其診斷ESCC的敏感性和特異性分別為0.58/0.68、0.92/0.64和0.95/0.58,AUC分別為0.66、0.84和0.78。見圖2。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PD-L1與PD-1相關(guān)性系數(shù)為0.61,TCF-1和PD-L1、PD-1相關(guān)性系數(shù)分別為0.62、0.64。見圖3。

圖2 外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1診斷食管鱗癌ROC曲線

圖3 PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

2.3外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性ROC分析確定PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA診斷ESCC的最佳界值分別為4.52、5.42、5.96,據(jù)此,本研究ESCC患者中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA高表達(dá)/低表達(dá)的分別為60/28、54/31、49/36例。女性ESCC患者外周血細(xì)胞PD-1表達(dá)高于男性,表達(dá)量分別為7.74±3.00、6.10±2.37(P=0.01),外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA與其他臨床病理特征無顯著相關(guān)性。見表2。

表2 食管鱗癌患者外周血細(xì)胞中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA與臨床病理特征相關(guān)性分析

2.4外周血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA與生存期ROC確定血細(xì)胞PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA區(qū)分ESCC高低風(fēng)險(xiǎn)最佳界值分別為3.67、4.74和5.37,據(jù)此,本研究中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA高表達(dá)/低表達(dá)的ESCC患者分別為64/16、57/20和53/22例。PD-L1、PD-1和TCF-1高表達(dá)ESCC患者OS明顯高于低表達(dá)者。見圖4。采用Cox單因素、多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響OS因素,發(fā)現(xiàn)PD-L1、PD-1和TCF-1和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響ESCC患者預(yù)后的的重要因素,但這些因素并不是ESCC的獨(dú)立預(yù)后因素。見表3。

a:PD-L1;b:PD-1;c:TCF-1

表3 Cox單因素、多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響食管鱗癌患者預(yù)后因素

3 討 論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一,主要組織學(xué)類型包括ESCC和食管腺癌。中國(guó)的食管癌主要是ESCC,約占所有食管癌90%以上[18]。食管癌起病隱匿,早期癥狀不典型,目前以食管胃內(nèi)鏡為主的食管癌早期篩查方法不適于大范圍人群篩查。因此,大多數(shù)ESCC患者初次確診時(shí)已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,失去了根治性手術(shù)治療機(jī)會(huì),5年總生存率低于20%;與晚期ESCC明顯不同,早期ESCC患者手術(shù)后5年生存率高達(dá)90%[14]。因此,積極探索簡(jiǎn)便易行的食管癌早期篩查方法,是提高ESCC治愈率的關(guān)鍵。

ESCC具有高度異質(zhì)性,其發(fā)生發(fā)展過程涉及大量分子異常變化,包括TP53、ZNF750、NOTCH1、FAT1、NFE2L2、CDKN2A、KRT5、YEATS2等多個(gè)基因突變,miRNA34a、miRNA375、NEAT1等非編碼RNA異常表達(dá),腫瘤抑制基因CDKN2A、RASSF1A等基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化等[19-20]。這些異常分子表達(dá)于腫瘤細(xì)胞,形成的腫瘤新抗原可被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別,激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)[11-13]。從正常食管黏膜發(fā)展至癌前病變、原位癌、浸潤(rùn)癌的過程中,外周血CD4細(xì)胞、CD8細(xì)胞和食管黏膜中IgG、IgA異常改變,CD4/CD8比值在ESCC患者明顯降低,IgG與ESCC浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[21-22]。Xu等應(yīng)用ELISA檢測(cè)388例ESCC和125例非癌對(duì)照外周血中6個(gè)腫瘤相關(guān)抗原(p53、NY-ESO-1、MMP-7、Hsp70、Prx VI、Bmi-1)的自身抗體,多數(shù)ESCC患者機(jī)體至少檢出1種腫瘤自身抗體[14]。ESCC患者外周血抗牙齦卟啉單胞菌IgG和IgA抗體滴度明顯高于食管良性病變和健康對(duì)照者,并與ESCC患者的生存期呈顯著負(fù)相關(guān),是ESCC獨(dú)立的預(yù)后因素之一[23]。本研究發(fā)現(xiàn)ESCC患者外周血中PD-L1、PD-1和TCF-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于非癌對(duì)照人群,診斷ESCC的敏感性和特異性高于目前臨床常用的SCCA、CYFRA21-1、CEA、CA19-9等血清標(biāo)志物,表明ESCC患者針對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)是ESCC潛在的生物標(biāo)志物。

PD-1是B7-CD28家族的共抑制受體,表達(dá)于激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞。侵入人體的細(xì)菌、病毒等激活機(jī)體免疫系統(tǒng),同時(shí)誘導(dǎo)PD-1表達(dá)上調(diào)進(jìn)而維持機(jī)體免疫平衡,PD-1缺失會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性自身免疫性疾病的發(fā)生[5,24]。PD-L1和PD-L2是PD-1配體,表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞,與PD-1結(jié)合后,抑制免疫反應(yīng)發(fā)生[5-6]。PD-L1和PD-L2異常表達(dá)見于多種腫瘤,在ESCC中,PD-L1和PD-L2表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,但兩者的表達(dá)水平與ESCC患者預(yù)后相關(guān)性,目前報(bào)道并不一致[25-29]。乳腺癌患者外周血中PD-1 mRNA表達(dá)高于健康對(duì)照人群,并與相對(duì)應(yīng)的乳腺癌組織中PD-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān),外周血中高表達(dá)和乳腺癌組織中低表達(dá)的PD-1乳腺癌患者預(yù)后不良[16]。與健康對(duì)照相比,胃癌患者外周血PD-1、PD-L1和CD8 mRNA表達(dá)明顯升高,并且PD-1和CD8高表達(dá)患者預(yù)后好于低表達(dá)胃癌患者[17]。多數(shù)研究表明,PD-L1和PD-L2的功能異質(zhì)性與腫瘤進(jìn)展階段相關(guān),腫瘤早期階段(TNMⅠ和Ⅱ期)的PD-L1和PD-L2高表達(dá)提示預(yù)后較好。

免疫細(xì)胞是一個(gè)多功能細(xì)胞群,包括T、B、NK、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、漿細(xì)胞等,這些細(xì)胞又由多個(gè)不均一的亞群構(gòu)成,發(fā)揮免疫應(yīng)答或免疫抑制功能[1,4]。腫瘤患者機(jī)體的免疫細(xì)胞具有高度異質(zhì)性,不同來源組織(外周血、引流淋巴結(jié)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)、腫瘤進(jìn)展不同階段、不同類型腫瘤、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的空間分布等多個(gè)因素均能夠影響免疫細(xì)胞的分子表型和功能[30-32]。文獻(xiàn)已報(bào)道的ESCC中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞包括CD8+、CD4+、骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)、Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞等,這些細(xì)胞在ESCC和/或外周血中比例變化與ESCC臨床病理特征相關(guān),影響化療療效和患者預(yù)后[1]。比較分析肝癌和腎透明細(xì)胞癌癌巢、癌細(xì)胞浸潤(rùn)前緣和正常組織,發(fā)現(xiàn)CD4+CD8+T細(xì)胞主要富集于浸潤(rùn)前緣區(qū)域,單細(xì)胞測(cè)序可將這群CD4+CD8+T細(xì)胞分為11個(gè)亞群,分別表達(dá)細(xì)胞毒性表型、幼稚表型、免疫激活表型、耗竭表型等標(biāo)志性分子,其中的LA3亞群同時(shí)高表達(dá)PD-1、細(xì)胞毒性和耗竭性分子,TCR克隆型表征發(fā)現(xiàn)CD4+CD8+T細(xì)胞可能由浸潤(rùn)前緣CD8+T分化而來,CD4+CD8+T和PD-1+CD4+CD8+T亞群細(xì)胞在浸潤(rùn)前緣富集與癌患者的生存期呈正相關(guān)[30,32-33]。在肝癌和結(jié)腸癌患者外周血、正常組織和癌組織中,各亞群細(xì)胞分布具有組織傾向性,如幼稚、中央型記憶細(xì)胞、近期激活效應(yīng)記憶CD8+細(xì)胞主要分布于外周血,富集于腫瘤組織的耗竭性CD8+高表達(dá)IFNG、GZMB/GZMH、PRF1等效應(yīng)分子,仍發(fā)揮抗腫瘤免疫功能,這些結(jié)果表明,從外周血、浸潤(rùn)前緣至TME,免疫抑制表型逐漸增強(qiáng),TME中多種免疫細(xì)胞表達(dá)耗竭性分子[30-32]。上述研究表明,特定的CD8+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞亞群共表達(dá)PD-1、多種免疫抑制性分子、Ki67、激活分子(如CD137+、CD38+、HLA-DR+),但不表達(dá)耗竭性分子EXOME,并不能代表該亞群細(xì)胞抗腫瘤免疫功能缺失,與之相反,還是拮抗性PD-1抗體的效應(yīng)細(xì)胞。此外,TCF-1作為T細(xì)胞早期發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子,其缺失發(fā)生在T細(xì)胞發(fā)育早期階段會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生,有研究表明TCF-1+T細(xì)胞亞群是PD-1治療的效應(yīng)細(xì)胞[3]。因此,本研究檢測(cè)了ESCC外周血中與腫瘤免疫活性相關(guān)分子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1和TCF-1高表達(dá)的ESCC患者預(yù)后較好,提示PD-1/PD-L1治療可能更適用于高表達(dá)PD-L1、PD-1和TCF-1的ESCC患者。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ESCC患者外周血PD-1、PD-L1和TCF-1 mRNA表達(dá)上調(diào),診斷ESCC準(zhǔn)確率高于SCCA、CYFRA21-1、CEA、CA19-9等血清標(biāo)志物,高表達(dá)這些分子的ESCC患者預(yù)后較好,這部分ESCC患者可能仍處于腫瘤發(fā)展早期階段(機(jī)體出現(xiàn)免疫耗竭狀態(tài)之前),免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療可能使這些患者生存獲益,但需更深入研究闡明。