高海京 楊芝笛

摘 要 粳稻品種中花11（ZH11）經(jīng)過60Co-γ輻射誘變，得到了一個小粒突變體tm282，對其進行遺傳分析和初步定位以篩選合適的粒型控制基因。農(nóng)藝性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，該突變體株高變矮，穗變短且稀疏，籽粒變?。唤M織細胞學觀察可知，突變體穎殼上表皮細胞數(shù)目變少，但是細胞長度無明顯變化；遺傳分析表明，tm282小粒突變?yōu)閱坞[形核基因控制，利用多重比較分析方法將目的基因初步定位于第七染色體483 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段未有相關基因報道，推測是一個控制水稻粒型的新基因。

關鍵詞 水稻；tm282；遺傳分析；基因定位

中圖分類號：S511 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.12.077

水稻是全球范圍內(nèi)最主要的糧食作物，為全球超過50%的人口提供食物來源，提高作物品種的產(chǎn)量潛力是水稻育種的基本目標[1]。構成水稻產(chǎn)量的三要素包括粒重、穗粒數(shù)、有效穗數(shù)，其中粒重由籽粒形狀和籽粒灌漿程度決定，即由粒長、粒寬、粒厚決定[2]。挖掘粒型調(diào)控的新基因不僅可以豐富粒型遺傳調(diào)控網(wǎng)絡，還可以提高水稻的產(chǎn)量[3]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小粒突變體tm282是從粳稻品種中花11（ZH11）經(jīng)過60Co-γ輻射誘變得到的突變體中初步鑒定出來的。水稻在揚州大學農(nóng)學院實驗田種植，播種30 d后單苗移栽，每行10株，行距為20 cm，株距為15 cm，常規(guī)大田統(tǒng)一水肥管理，在成熟期收種曬干后低溫保存。

1.2 遺傳分析群體和基因定位群體構建

將tm282與ZH11回交，得到F1代，F(xiàn)1自交得到分離群體F2進行遺傳分析，同時將tm282與珍汕97B（ZS97B）雜交得到F2群體進行初步定位，在F2群體中篩選極端表型單株與輪回親本ZS97B回交構建BC1F2群體進行精細定位。

1.3 農(nóng)藝性狀考察

水稻乳熟期，選取10株長勢相同的單株測量土面至穗頂（不計芒）的高度，記為株高；每株選取3個稻穗進行穗部農(nóng)藝性狀考察，用直尺測量穗頸節(jié)到穗頂端長度，記為穗長；選取50～100粒成熟飽滿的種子，用掃描儀對粒長、粒寬、長寬比等數(shù)據(jù)進行考察。同時考察了突變體與野生型的穗粒數(shù)、千粒重、一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)等性狀。

1.4 穎殼的掃描電鏡（SEM）觀察

在揚州大學測試中心進行掃描電鏡觀察。篩選發(fā)育正常的成熟籽粒，用75%酒精洗凈表面，晾干；用雙面膠將水稻籽粒粘在底座上，噴金；在掃描電鏡（蔡司GeminiSEM 300超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡）下觀察，于12×（全籽粒觀察）、500×（細胞觀察）倍率下觀察、拍攝圖像。

1.5 突變體tm282的初步定位

利用混池分組分析法（Bulked Segregation Analysis，BSA）對突變體tm282進行初步定位，在tm282與ZS97B雜交F2群體中篩選突變體極端表型（極小粒）和正常表型（大粒）各20株，將2份葉片等量混合，構成2個極端混池。利用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取2個極端混池的DNA后，送武漢博越致和生物科技有限公司進行基因組測序及連鎖分析[4]。

同時從F2群體中篩選極端表型單株與輪回親本ZS97B進行回交構建BC1F2群體，從該群體中篩選不同重組類型的導入系，利用SPSS進行多重比較分析，對小?；蜻M行精細定位。DNA提取采用CTAB法。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、53～58 ℃（退火溫度根據(jù)引物GC含量進行調(diào)整）退火30 s、72 ℃延伸30 s（根據(jù)擴增片段長度調(diào)整，1 min擴增1 kb）35～38個循環(huán)，72 ℃延伸10 min反應結束。

2 結果與分析

2.1 突變體tm282的農(nóng)藝性狀考察

通過對野生型ZH11和突變體tm282觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型相比突變體株高變矮（圖1A），分蘗減少，穗直立、短且稀疏（圖1A、圖1B），水稻籽粒明顯變?。▓D1C）。具體農(nóng)藝性狀考察見表1，總體來看突變體tm282穗長變短，粒數(shù)變少，二次枝梗數(shù)變少。

2.2 tm282穎殼細胞觀察

對野生型和突變體成熟籽粒的穎殼上表皮進行掃描電鏡（SEM）觀察，在相同視野下，突變體比野生型細胞排列得更加致密（圖2A、圖2B）。對穎殼上表皮細胞數(shù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)掃描拍照視野內(nèi)，野生型細胞數(shù)約為5 384個，突變體細胞數(shù)約為4 450個，細胞總數(shù)目顯著減少了17.35%。野生型和突變體穎殼上表皮細胞長度平均值分別為69.5 μm和64 μm，無明顯變化。綜合分析，tm282籽粒變短，可能是穎殼細胞數(shù)目減少引起的。

2.3 突變體tm282的遺傳分析

以突變體tm282為母本，與野生型ZH11雜交，F(xiàn)1代植株表型與ZH11相似；在F2代中，植株表型發(fā)生分離，與突變體表型相似的有134個單株，與野生型表型相似的有499個單株；卡方測驗表明F2群體中野生型表型與突變體表型性狀分離比為2.45∶1，基本符合3∶1，說明該突變體性狀的變化由一對單隱性核基因控制。

2.4 BSA關聯(lián)分析

為確定控制tm282小粒突變體隱形性狀的基因在基因組的位置，在F2群體中選取極端小粒及正常表型與ZH11或ZS97B各20株混合構建2個極端池。對突變體tm282、ZS97B及2個極端混池進行全基因組測序。連鎖分析將該基因定位于第七染色體，定位區(qū)間在18255211～21519751 bp。

2.5 tm282精細定位圖

為了進一步縮小該基因區(qū)間，利用tm282突變體與ZS97B雜交得到F1植株，經(jīng)過F2代分離，從F2代群體中篩選出與突變體穗型相似的單株與ZS97B回交，構建BC1F2群體進行精細定位。

通過對1 500株BC1F2群體進行基因型檢測，篩選出在分子標記LInD7-280～LInD7-331發(fā)生交換的單株（包括純合和雜合交換），最后利用雜合單株繼續(xù)自交，進一步擴大群體，獲得5 000株的BC1F2群體。在標記LInD7-302～LInD7-331密集標記，篩選純合的重組單株，最終在目標區(qū)段篩選得到13種不同重組類型的純合導入系，根據(jù)基因型分別命名為M1～M13。

如圖4所示，導入系M2和ZS97B粒長較長，分別為8.01 mm和8.04 mm，與M3、M4、M5、M8及M9沒有顯著差異；導入系M1、M6、M11的平均粒長低于7.00 mm，與M7、M10、M12和M13沒有顯著差異。結合以上14種不同重組類型的基因型和粒長表型數(shù)據(jù)，最終將tm282精細定位于標記LInD7-311～LInD7-315，物理距離約為483 kb。

3 結論與討論

本試驗將tm282基因定位于水稻第七號染色體483 kb區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段中未見有關影響控制水稻粒型的基因報道，推測tm282是一個新的影響水稻籽粒大小的基因，對該基因的研究有助于進一步闡明水稻籽粒大小調(diào)控機理，發(fā)掘粒型新基因。

在所有已經(jīng)克隆的調(diào)控水稻穗型和粒型的基因中，有許多一因多效基因，不僅調(diào)控水稻粒型，還參與水稻其他性狀或者組織器官的發(fā)育，如直立穗基因DEP1在改變穗型的同時，導致水稻籽粒變小，株高變矮[5]。同時粒型和穗型是受多基因控制的復雜性狀，不僅受到基因調(diào)控，還和水稻遺傳背景和種植環(huán)境相關。如SMG12基因突變導致籽粒變短，株高變矮，一次枝梗、二次枝梗數(shù)都減少[6]。本試驗的材料tm282突變體不僅在穗型粒型上有明顯變化，還在株高、分蘗、穗粒數(shù)上有變化。遺傳分析的結果證明了tm282突變體是一個隱性單核基因突變體。

參考文獻：

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[2] 宋露，何明良，劉穎湘，等.水稻粒型調(diào)控研究進展[J].土壤與作物，2021，10（4）：363-372.

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[5] ZHOU Y，ZHU J Y，LI Z Y，et al.Deletion in a quantitative trait gene qPE9-1 associated with panicle erectness improves plant architecture during rice domestication[J]. Genetics， 2009， 183（1）：315-324.

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（責任編輯：張春雨）