李艷艷 劉小燕 趙琳娜 白繼超 崔生輝 徐中清
摘 要:目的:比較國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB培養(yǎng)基對(duì)啤酒有害菌的檢測(cè)效果。方法:將干酪乳桿菌、短乳桿菌、四聯(lián)球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、植物乳桿菌植物亞種6株乳酸菌接種到NBB-B和NBB-A培養(yǎng)基中,28 ℃厭氧培養(yǎng)24~72 h,測(cè)定OD值,觀察培養(yǎng)基變色、菌落生長(zhǎng)狀態(tài)等。同時(shí),用不同濃度麥芽啤酒配制NBB培養(yǎng)基,確定配制培養(yǎng)基用啤酒的最適麥芽度。結(jié)果:6株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中靈敏度和指示特征無(wú)明顯差異。戊糖片球菌在國(guó)產(chǎn)NBB-A培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h變色情況略差于進(jìn)口NBB-A,培養(yǎng)72 h后,與進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基無(wú)差異。通過(guò)不同麥芽度比對(duì)試驗(yàn),采用10°P啤酒配制的NBB培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)情況最好。結(jié)論:國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口NBB培養(yǎng)基在靈敏度、指示能力、菌落生長(zhǎng)等方面無(wú)明顯差異,國(guó)產(chǎn)NBB培養(yǎng)基可用于國(guó)內(nèi)啤酒生產(chǎn)企業(yè)檢測(cè)啤酒有害菌。
關(guān)鍵詞:NBB培養(yǎng)基;啤酒有害菌;麥芽度;乳酸菌
Abstract: Objective: To compare the detection effect of domestic and imported NBB culture media on harmful bacteria in beer. Method: Six strains of lactic acid bacteria, including Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Micrococcustetragenus, Pediococcuspentosaceus, Lactococcus lactis subsp. cremoris, and Lactobacillus plantarum subsp. plantarum, were inoculated into NBB-B and NBB-A media. They were anaerobic cultured at 28 ℃ for 24~72 h, and their OD values were measured. The discoloration of the media and the growth status of the colonies were observed. At the same time, prepare NBB culture medium with different concentrations of malt beer to determine the optimal malt content of the beer used for preparing the culture medium. Result: There was no significant difference in sensitivity and indicator characteristics between the 6 strains of lactic acid bacteria in domestic and imported NBB-B culture media. After 48 hours of cultivation on domestic NBB-A medium, the appearance of Pediococcuspentosaceus turned slightly worse than that on imported NBB-A. After 72 hours of cultivation, there was no difference compared to imported NBB-A medium. Through the comparison experiment of different malt degrees, the NBB culture medium prepared with 10°P beer showed the best growth performance. Conclusion: There is no significant difference in sensitivity, indicator ability, and colony growth between domestic and imported NBB culture media. Domestic NBB culture media can be used for detecting harmful beer bacteria in domestic beer production enterprises.
Keywords: NBB culture medium; harmful bacteria in beer; malt degree; lactic acid bacteria
啤酒是一種以麥芽為原料,經(jīng)酵母發(fā)酵釀制而成的低酒精度釀造酒。啤酒釀造是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程,在生產(chǎn)過(guò)程中難免會(huì)被有害菌污染。這些有害微生物在啤酒中生長(zhǎng)繁殖,會(huì)影響啤酒的質(zhì)量和風(fēng)味,嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。啤酒中有害菌按照生理學(xué)分類,主要分為細(xì)菌、野生酵母和霉菌[1];按照對(duì)啤酒的有害程度可分為專性啤酒有害菌、潛在啤酒有害菌、間接啤酒有害菌、指示性微生物和潛伏微生物5個(gè)等級(jí),其中專性啤酒有害菌對(duì)啤酒質(zhì)量穩(wěn)定性的影響最大,包括乳酸桿菌、四聯(lián)球菌、果膠桿菌和釀酒酵母等。
啤酒廠十分重視對(duì)啤酒有害菌的檢測(cè),主要采用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè),使用的培養(yǎng)基主要有VLB-S7、ABD、MRS和NBB等,其中NBB培養(yǎng)基是一種能生長(zhǎng)啤酒有害菌和多種野生酵母的選擇性和鑒別性培養(yǎng)基[2]。成品化NBB培養(yǎng)基的主要產(chǎn)品有NBB-A(NBB固體培養(yǎng)基)、NBB-B(NBB液體培養(yǎng)基)、NBB-C(NBB濃縮液體培養(yǎng)基)3種。NBB培養(yǎng)基添加了啤酒液體,為污染微生物的生長(zhǎng)提供了相似的生長(zhǎng)環(huán)境,NBB含有的半胱氨酸鹽酸鹽可以降低培養(yǎng)基的氧化還原電位,有利于乳酸菌的生長(zhǎng)。NBB-A和NBB-B中含有酸性指示劑,如果細(xì)菌產(chǎn)酸,培養(yǎng)基的顏色將由紅色變成黃色;NBB-C不含指示劑,為濃縮液體培養(yǎng)基,適用于已發(fā)現(xiàn)的所有啤酒有害菌的檢測(cè),是目前啤酒廠使用最多的培養(yǎng)基[3]。但目前NBB培養(yǎng)基依賴進(jìn)口,價(jià)格較昂貴,供貨周期較長(zhǎng),增加了啤酒生產(chǎn)在檢測(cè)過(guò)程中的成本。目前國(guó)產(chǎn)商品化NBB培養(yǎng)基并不多,本研究將國(guó)產(chǎn)的啤酒有害細(xì)菌培養(yǎng)基與進(jìn)口品牌NBB-B培養(yǎng)基進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證,旨在為國(guó)內(nèi)啤酒生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行培養(yǎng)基選擇時(shí)提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ABX0009、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)ABX0010、四聯(lián)球菌(Micrococcustetragenus)ABX0011、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)ABX0013、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. cremoris)ABX0012、植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum)ABX0015,由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司保存提供;NBB-B培養(yǎng)基(批號(hào)20210326)、瓊脂粉(批號(hào)0145)、MRS培養(yǎng)基(批號(hào)20210326),北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;NBB-B培養(yǎng)基(批號(hào):0005399414),德國(guó)德樂(lè);10°P啤酒,燕京;12°P啤酒,德國(guó)進(jìn)口;14.5°P啤酒,美國(guó)進(jìn)口;厭氧袋,日本三菱。
1.2 儀器與設(shè)備
DHP培養(yǎng)箱,天津中環(huán)試驗(yàn)儀器廠;S20 pH計(jì)、XS205DU電子天平,瑞士梅特勒;YX-280D手提式滅菌器,合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;UV-1800紫外分光光度計(jì),島津儀器(蘇州)有限公司;SY2D超凈工作臺(tái),江蘇博萊爾凈化設(shè)備有限公司。
1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 菌液制備方法
(1)菌種活化。將保存于-80 ℃條件下的菌種取出,用接種環(huán)取一環(huán)接種于MRS培養(yǎng)基中,36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,再取單菌落劃線于MRS培養(yǎng)基,36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,二代新鮮培養(yǎng)物備用。
(2)菌液稀釋。用無(wú)菌棉簽取MRS平板二代新鮮培養(yǎng)物于無(wú)菌生理鹽水中,制成菌懸液,OD值為1.0~1.5,再分別用生理鹽水稀釋至接種水平為20~200 CFU/100 μL的工作菌懸液。
1.3.2 培養(yǎng)基配制方法
(1)不同麥芽度啤酒配制NBB-B培養(yǎng)基。按照進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)NBB-B培養(yǎng)基配方說(shuō)明分別稱取配制500 mL培養(yǎng)基用量干粉于250 mL去離子水中,加熱煮沸溶解,再分別加入250 mL經(jīng)脫氣的10°P、12°P和14.5°P不同麥芽度的啤酒,調(diào)整pH值為5.8±0.2,分裝10 mL/支,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。
(2)NBB-B培養(yǎng)基配制方法。按照進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)NBB-B培養(yǎng)基配方說(shuō)明分別稱取配制500 mL培養(yǎng)基用量干粉于250 mL去離子水中,加熱煮沸溶解,再加入250 mL經(jīng)脫氣的10°P啤酒,調(diào)整pH值為5.8±0.2,分裝10 mL/支,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。
(3)NBB-A培養(yǎng)基配制方法。按照進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)NBB-B培養(yǎng)基配方說(shuō)明分別稱取配制500 mL培養(yǎng)基用量干粉于250 mL去離子水中,加入瓊脂粉7.5 g,加熱煮沸溶解,再加入250 mL經(jīng)脫氣的10°P啤酒,調(diào)整pH值為5.8±0.2,121 ℃高壓滅菌15 min,冷至50 ℃時(shí)無(wú)菌環(huán)境下制備平板,備用。
1.3.3 微生物生長(zhǎng)效果檢驗(yàn)方法
(1)不同麥芽度啤酒配制培養(yǎng)基微生物生長(zhǎng)效果對(duì)比。取100 μL工作菌懸液接種至10 mL 10°P、12°P和14.5°P不同麥芽度啤酒配制的培養(yǎng)基中,每株菌接種2支并取1支作為空白對(duì)照,28 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)過(guò)程中觀察菌株在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)濁度及顏色變化。
(2)國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基菌株培養(yǎng)效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)。取100 μL工作菌懸液接種至10 mL NBB-B培養(yǎng)基中,每株菌接種2支并取1支作為空白對(duì)照,28 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)過(guò)程中每24 h觀察不同菌種在各培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)濁度及顏色變化,并檢測(cè)菌液OD620值。
(3)國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基菌株培養(yǎng)效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)。取100 μL工作菌懸液涂布于國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基中,每株菌涂布2塊并取1塊作為空白對(duì)照,同時(shí)用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)。28 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,培養(yǎng)過(guò)程中觀察檢測(cè)平板的顏色變化情況和菌落形態(tài)。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同麥芽度啤酒對(duì)NBB-B培養(yǎng)基的影響
將6株乳酸菌分別接種于3種麥芽度啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中,28 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,觀察菌液濃度和培養(yǎng)基顏色。由表1可知,6株乳酸菌在10°P啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特征和靈敏度均無(wú)差異;短乳桿菌在12°P啤酒配制的進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基不變色,戊糖片球菌在12°P啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中均微變黃色,其他4株乳酸菌在12°P啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)濃度均無(wú)明顯差異;但在14.5°P啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中除戊糖片球菌在國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基中微變黃色,其他菌株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)均不變色,四聯(lián)球菌在兩種培養(yǎng)基中均不生長(zhǎng),短乳桿菌在進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)濁度低,乳酸乳球菌乳脂亞種在兩種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)濁度低。
麥芽度濃度越高培養(yǎng)基靈敏度越差,麥芽度濃度增高對(duì)四聯(lián)球菌和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株的生長(zhǎng)存在抑制作用,戊糖片球菌培養(yǎng)基變色差。結(jié)果顯示采用麥芽度為10°P啤酒配制培養(yǎng)基效果較好。
2.2 國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6株乳酸菌接種至國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中,28 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,均可見(jiàn)菌株微弱生長(zhǎng),但培養(yǎng)基顏色均未發(fā)生變色;培養(yǎng)36 h,培養(yǎng)基均明顯渾濁,肉湯均由紅色變微黃色;培養(yǎng)至48 h,菌株均生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)基均變黃色。
根據(jù)6株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)時(shí)間菌液OD620值繪制曲線,圖1結(jié)果顯示,在培養(yǎng)24 h、36 h、48 h后,短乳桿菌和乳酸乳球菌乳脂亞種在國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基中OD620值均高于進(jìn)口培養(yǎng)基,其他4株菌無(wú)明顯差異。
2.3 國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6株乳酸菌接種至國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基中,28 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,戊糖片球菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)數(shù)量無(wú)差異,在國(guó)產(chǎn)NBB-A平板中菌落周圍培養(yǎng)基變黃,平板上有少量紅色區(qū)域;在進(jìn)口培養(yǎng)基中菌落周圍培養(yǎng)基變黃,平板上紅色區(qū)域多。其他5株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口培養(yǎng)基中菌落圓潤(rùn)、生長(zhǎng)豐滿,均為乳白色菌落,培養(yǎng)基全部變黃,詳見(jiàn)圖2。培養(yǎng)72 h,6株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)數(shù)量和形態(tài)均無(wú)明顯差異,培養(yǎng)基全部變黃,菌落計(jì)數(shù)結(jié)果詳見(jiàn)表2。
3 討論
啤酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量,造成產(chǎn)品變質(zhì)[4]。啤酒中有害菌會(huì)影響啤酒質(zhì)量穩(wěn)定性,其中乳酸桿菌、四聯(lián)球菌對(duì)啤酒的危害最大,能使啤酒產(chǎn)生渾濁和異味,它們能耐受啤酒中特殊的條件,在低pH值、厭氧、含有一定量的酒精、缺乏一定量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和低溫的環(huán)境下仍能在啤酒中很好地生長(zhǎng)[5]。研究發(fā)現(xiàn),啤酒中必然有害菌中短乳桿菌出現(xiàn)概率約為40%,干酪乳桿菌出現(xiàn)概率約為3%,片球菌出現(xiàn)概率約為17%[6];有研究從工藝啤酒中分離出23株啤酒腐敗菌,經(jīng)鑒定為15株短乳桿菌、3株植物乳桿菌、1株副布氏乳桿菌、2株副干酪乳桿菌和2株達(dá)氏片球菌[7-8]。本研究使用干酪乳桿菌、短乳桿菌、四聯(lián)球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亞種和植物乳桿菌植物亞種6種啤酒中必然有害菌對(duì)國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示6種乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)良好。
NBB配制說(shuō)明中使用水和啤酒按照1∶1比例配制NBB-B培養(yǎng)基。有研究發(fā)現(xiàn)啤酒濃度越高,對(duì)啤酒有害菌的抑制能力越強(qiáng)[9]。本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用10°P、12°P、14.5°P 3種麥芽度啤酒配制NBB-B培養(yǎng)基,結(jié)果顯示6株乳酸菌在10°P麥芽啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)靈敏度和特征無(wú)明顯差異;戊糖片球菌在12°P麥芽啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口培養(yǎng)基中變色均差,生長(zhǎng)濃度無(wú)差異;短乳桿菌在12°P麥芽啤酒配制的國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基中變黃色,在進(jìn)口培養(yǎng)基中不變色,生長(zhǎng)濃度無(wú)差異;在14.5°P麥芽啤酒配制的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中除戊糖片球菌在國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基中微變黃色,其他菌株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)均不變色,四聯(lián)球菌在兩種培養(yǎng)基中均不生長(zhǎng),短乳桿菌在進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)濁度低,乳酸乳球菌乳脂亞種在兩種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)濁度低。由此可見(jiàn),麥芽度濃度越高培養(yǎng)基靈敏度越差,濃度增高對(duì)四聯(lián)球菌和乳酸乳球菌乳脂亞種菌株的生長(zhǎng)存在抑制作用,戊糖片球菌培養(yǎng)基變色差。本研究采用麥芽度為10°P的啤酒配制的培養(yǎng)基效果較好。
啤酒工廠用于啤酒有害菌檢測(cè)的培養(yǎng)基主要有R-R培養(yǎng)基、NBB系列培養(yǎng)基以及MRS培養(yǎng)基[10]。R-R培養(yǎng)基主要選擇性檢測(cè)乳酸菌和片球菌,對(duì)巨球菌不能檢出[11];MRS培養(yǎng)基主要選擇性檢測(cè)乳酸菌和片球菌;NBB系列培養(yǎng)基檢測(cè)范圍較廣,基本可以檢測(cè)所有啤酒有害菌[12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者比較了乳酸短桿菌、四聯(lián)球菌、醋化醋酸桿菌在NBB、MRS、Raka-Ray、VLB-S7、番茄汁培養(yǎng)基、自配培養(yǎng)基A和自配培養(yǎng)基UBA上的生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示NBB對(duì)乳酸桿菌的檢測(cè)效果最好[13-14]。本研究選用國(guó)產(chǎn)NBB與進(jìn)口NBB進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示6株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)NBB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)72 h靈敏度和菌落特征與進(jìn)口NBB培養(yǎng)基無(wú)明顯差異。
4 結(jié)論
通過(guò)不同麥芽度比對(duì)試驗(yàn),采用10°P啤酒配制的NBB培養(yǎng)基菌株生長(zhǎng)情況最好。6株乳酸菌在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口NBB-B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)靈敏度和指示特征無(wú)明顯差異,在國(guó)產(chǎn)NBB-A培養(yǎng)基與進(jìn)口NBB-A培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h菌落生長(zhǎng)特征無(wú)明顯差異。目前NBB培養(yǎng)基依賴進(jìn)口,價(jià)格較昂貴,供貨周期較長(zhǎng),國(guó)產(chǎn)NBB培養(yǎng)基可供于國(guó)內(nèi)啤酒生產(chǎn)企業(yè),降低檢測(cè)成本。
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