王志文 楊寧寧 張 晨 秦莉莉 曹瀧云 李海鋒 董 臣

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

蓮（Nelumbo nucifera）是我國(guó)重要的水生經(jīng)濟(jì)作物，也是多年生草本蓮屬植物，具有廣泛的用途和價(jià)值［1］。蓮花以其獨(dú)特香氣深受人們喜愛，其花色有白色、黃色和紅色等，且與蓮類胡蘿卜素的積累有關(guān)［2］。類胡蘿卜素（carotenoid）是自然界中分布最廣的一類色素，迄今已發(fā)現(xiàn)近750 種類胡蘿卜素［3］。類胡蘿卜素是必要的光合色素和光保護(hù)劑，也是植物激素和植物香氣的前體物質(zhì)［4］。

類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase，CCDs）是一類高度異構(gòu)的多烯鏈氧化酶家族，在非血紅鐵Fe2+協(xié)助下，結(jié)合4個(gè)組氨酸發(fā)生催化反應(yīng)［5］。在植物中，CCDs家族根據(jù)催化底物是否環(huán)氧化分為兩個(gè)亞家族：類胡蘿卜素裂解雙加氧酶和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）。植物CCD 亞基因家族成員有5個(gè)，分別為CCD1、CCD2、CCD4、CCD7和CCD8；NCED亞家族成員有5 個(gè)，分別為NCED1、NCED3、NCED5、NCED6和NCED9。兩個(gè)基因家族之間的同源性和酶活性較低，底物專一性也存在差異［6-7］。

CCDs作為一種關(guān)鍵酶參與植物激素的生成，并在植物（葉、花、果實(shí)）顏色和香味形成中發(fā)揮重要作用［8］。CCD1 和CCD4 通過裂解作用，形成易于揮發(fā)的脫輔基類胡蘿卜素，產(chǎn)生香氣物質(zhì)；CCD7 和CCD8 裂解產(chǎn)物是獨(dú)角金內(nèi)酯形成的關(guān)鍵前體物質(zhì)；NCEDs 是脫落酸（abscisic acid，ABA）形成的關(guān)鍵酶［9-10］。在植物體內(nèi)同時(shí)存在多個(gè)CCD 家族基因，在不同的植物組織中發(fā)揮著各自的功能，共同調(diào)節(jié)植物類胡蘿卜素代謝［11］。

CCDs通過裂解不同底物和位點(diǎn)產(chǎn)生不同產(chǎn)物，從而發(fā)揮著獨(dú)特的生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)CCD1 和CCD4 能夠裂解多種類胡蘿卜素，產(chǎn)生不同的香氣物質(zhì)，包括β-紫羅酮和香葉基丙酮等［12-13］。CCD1 定位于植物細(xì)胞質(zhì)，CCD4 位于植物質(zhì)體內(nèi)［14］?？紤]到質(zhì)體是植物類胡蘿卜素合成的主要場(chǎng)所，本研究對(duì)蓮NnCCD4基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)NnCCD4基因表達(dá)模式進(jìn)行研究，明確其酶促催化產(chǎn)生的香氣物質(zhì)，以期為蓮屬植物的花香改良提供有效基因，為蓮種質(zhì)資源開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取子蓮金色年華、金陵火都和太空蓮36 作為研究對(duì)象，種植于河南工業(yè)大學(xué)。收集太空蓮36 的蓮子、幼葉和成熟葉，以及金色年華（黃色）、金陵火都（紅色）和太空蓮36（白色）的花瓣。取樣完成后，立即在液氮中冷卻，后放置在-80 ℃冰箱中備用。每個(gè)材料均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)［15］。

細(xì)菌顏色試驗(yàn)所用載體pAC-β 和pMAL-c5x均由河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院董臣課題組保存。大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）購(gòu)自生工生物工程上海股份有限公司；植物總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；核酸測(cè)序及引物合成委托北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler nexus X2 PCR擴(kuò)增儀、Centrifuge 5418 R微量離心機(jī)、CryoCube F740超低溫冰箱，德國(guó)Eppendorf公司；7250 GC/Q-TOF 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，上海安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蓮NnCCDs基因家族鑒定 使用NCBI（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蓮NnCCDs 編碼蛋白序列（E 值<10-6）進(jìn)行在線搜索，獲得NnCCDs 蛋白序列。使用Expasy（https：//www.expasy.org/）在線網(wǎng)站分析NnCCD4分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)［16］。

1.3.2 蓮NnCCD4編碼蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載蓮NnCCDs及其他高等植物CCD蛋白序列，分析蓮NnCCD4蛋白序列的相似性及其結(jié)構(gòu)特征。利用DNAMAN 6.0 軟件對(duì)NnCCD4與其他物種的CCD4 進(jìn)行多序列比對(duì)［17］。使用軟件MEGA 7.0 通過最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）繪制高等植物CCDs家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹［18］。

1.3.3 蓮NnCCD4原核表達(dá)載體構(gòu)建 原核表達(dá)載體構(gòu)建采用一步克隆法［19］。設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端含有15 bp 載體序列，對(duì)目的基因進(jìn)行克隆（表1）。采用pMAL-c5x 作為原核表達(dá)載體，使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ對(duì)pMAL-c5x 載體進(jìn)行酶切，將插入片段與酶切載體進(jìn)行電泳檢測(cè)。膠回收進(jìn)行重組反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆［20］。通過質(zhì)粒提取試劑盒抽提原核表達(dá)載體pMALNnCCD4a、pMAL-NnCCD4b、pMAL-NnCCD4c。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.4 蓮NnCCD4基因表達(dá)模式分析 通過植物總RNA 提取試劑盒提取蓮的總RNA［21］。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，合成后的cDNA 于-20 ℃冰箱中保存［22］。設(shè)計(jì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量引物（表1），使用DNA結(jié)合染料SYBR GreenⅠ，分析蓮NnCCD4基因在不同部位的差異性表達(dá)。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s、55 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃變性15 s，60 ℃延伸60 s，95 ℃變性15 s。以26 s作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量用2-??Ct法計(jì)算（fold change），用Origin2017進(jìn)行柱狀圖繪制及誤差分析［23］。

1.3.5 細(xì)菌顏色試驗(yàn) 以pMAL-c5x 空載體作為對(duì)照，將重組質(zhì)粒pMAL-NnCCD4b 與質(zhì)粒pAC-β 共轉(zhuǎn)大腸桿菌BL21（DE3），37 ℃培養(yǎng)過夜。將共轉(zhuǎn)化的菌液使用100 mL TB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入濃度為1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)時(shí)間為15～20 h，產(chǎn)生顏色變化［24］。再使用癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，將其加入到待分析的樣品混合物中，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），并結(jié)合固相微萃取技術(shù)（solid-phase microextraction，SPME）頂空吸附上機(jī)，對(duì)蓮NnCCD4b基因共轉(zhuǎn)化菌的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)［13，25］，分析揮發(fā)性類胡蘿卜素衍生香氣物質(zhì)的組分和相對(duì)含量。

用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SPME-GC-MS）頂空固相微萃取檢測(cè)技術(shù)共轉(zhuǎn)化菌的揮發(fā)性物質(zhì)，具體方法如下：

（1）設(shè)置程序：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，初始柱溫箱溫度為50 ℃保持5 min，以25 ℃·min-1升到250 ℃保持5 min 后按1∶20 的比例分流進(jìn)樣；將氦氣流速保持在1 mL·min-1，不分流時(shí)間為3 min；電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度為200 ℃，DB-1701 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；

（2）向裝有誘導(dǎo)好菌液的錐形瓶中插入固相微萃取萃取頭（SPME，50/30 μm），放入60 ℃恒溫水浴鍋中30 min進(jìn)行頂空吸附萃?。?/p>

（3）結(jié)束后將SPME 萃取頭插入儀器中進(jìn)行解析，5 min后拔出，點(diǎn)擊開始鍵run；

（4）對(duì)其檢測(cè)產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過在標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中檢測(cè)到內(nèi)標(biāo)物和香氣物質(zhì)的時(shí)間來確定標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間、出峰位置和樣品含量，從而確定樣品中內(nèi)標(biāo)物和香氣物質(zhì)的出峰時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)處理重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。采用Origin2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，并應(yīng)用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)對(duì)變量進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮NnCCD4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

從蓮基因組中成功獲得3 個(gè)CCD基因，分別命名為NnCCD4a、NnCCD4b和NnCCD4c。NnCCD4a、NnCCD4b和NnCCD4c分別含有1 914、1 812 和1 647 bp 的開放閱讀框，編碼蛋白各含有637、603和548個(gè)氨基酸。利用Expasy 在線網(wǎng)站分析NnCCD4 蛋白的分子量、等電點(diǎn)、編碼長(zhǎng)度以及氨基酸組成等特征（表2）。

表2 蓮NnCCD4編碼蛋白的理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of lotus NnCCD4-encoding protein

2.2 蓮NnCCD4編碼蛋白的序列比對(duì)分析

使用DNAMAN6.0 軟件對(duì)不同高等植物，如香瓜（Cucumis melo）、牽牛（Ipomoea nil）、蘋果（Malus domestica）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、葡萄（Vitis vinifera）、蓮的CCD4 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)（圖1）。結(jié)果表明，氨基酸序列多重比對(duì)一致性為82.98%；NnCCD4與MdCCD4 的同源性為76.48%；與VvCCD4 的同源性為74.64%；與NtaCCD4的同源性為73.08%；與SlCCD4的同源性為71.85%；與InCCD4 的同源性為72.31%；與StCCD4 的同源性為72.24%；與CmCCD4 的同源性為72.09%。說明不同物種的CCD4 蛋白序列具有較高的同源性，NnCCD4 與蘋果和葡萄之間具有較近的同源關(guān)系。

2.3 CCDs家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0 軟件通過最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建CCDs家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，NnCCD4a、NnCCD4b和NnCCD4c屬于CCD 基因家族中CCD4 亞家族，不同亞基因家族之間進(jìn)化關(guān)系存在差異。NnCCD4a、NnCCD4b與NnCCD4c與其他物種的CCD4亞家族同源性較低。說明NnCCD4在進(jìn)化過程中保守性不強(qiáng)，不同種屬之間存在差異。

圖2 蓮NnCCD4與其他亞家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of NnCCD4 and other subfamilys

2.4 qRT-PCR分析蓮NnCCD4基因家族的表達(dá)模式

qRT-PCR結(jié)果表明，NnCCD4a、NnCCD4b、NnCCD4c在成熟葉片和花中的表達(dá)量普遍高于蓮子和幼葉（圖3）。其中NnCCD4a在成熟葉片中表達(dá)量較高；NnCCD4b在不同顏色的花瓣中的表達(dá)量較高，且白花表達(dá)量最高，紅花次之，黃花則相對(duì)偏低；而NnCCD4c相較于NnCCD4a、NnCCD4b在不同部位的表達(dá)量均偏低。上述結(jié)果表明，NnCCD4 家族成員在蓮不同組織器官發(fā)育中可能起到不同的作用，其中NnCCD4b在蓮花的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

圖3 NnCCD4基因在蓮的不同部位中的表達(dá)量Fig.3 The amount of expression of the NnCCD4 gene in different organs of the lotus

2.5 NnCCD4蛋白的功能及酶切產(chǎn)物分析

考慮到NnCCD4b主要表達(dá)于不同顏色蓮的花瓣中，以NnCCD4b作為研究對(duì)象，分析其酶切產(chǎn)物。質(zhì)粒pAC-β能夠在大腸桿菌中合成β-胡蘿卜素，使菌體產(chǎn)生黃色。如圖4-A 所示，由于pMAL-c5x 空載體不攜帶NnCCD4基因，所以共轉(zhuǎn)化菌用IPTG 誘導(dǎo)后，由于β-胡蘿卜素積累而呈現(xiàn)出深黃色。與對(duì)照相比，重組質(zhì)粒pMAL-c5x-NnCCD4b 和pAC-β 共轉(zhuǎn)化菌中的顏色明顯變淺，說明NnCCD4b 有催化活性，能夠切割β-胡蘿卜素，使顏色變淺。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品與蓮NnCCD4b的類胡蘿卜素含量檢測(cè)色譜圖Fig.4 Chromatogram of carotenoid content detection of standard with NnCCD4b

為了進(jìn)一步確定其裂解類胡蘿卜素產(chǎn)物，以pMALc5x作為對(duì)照，使用癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，利用GC-MS技術(shù)，并結(jié)合SPME頂空吸附上機(jī)，對(duì)蓮NnCCD4b共轉(zhuǎn)化菌的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，分析揮發(fā)性類胡蘿卜素衍生香氣物質(zhì)的組分和相對(duì)含量。在標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖20.69 min 處檢測(cè)到了內(nèi)標(biāo)物癸酸乙酯，24.27 min 處檢測(cè)到了香氣物質(zhì)β-紫羅蘭酮，從而確定了標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間、出峰位置和樣品含量（圖4-B）。根據(jù)總離子流色譜圖，通過檢索NIST98譜圖庫(kù)，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜圖，在重組質(zhì)粒pMAL-c5x-NnCCD4b和pAC-β共轉(zhuǎn)化菌中進(jìn)行檢測(cè)，分析色譜圖發(fā)現(xiàn)了揮發(fā)性物質(zhì)β-紫羅蘭酮（圖4-D），且質(zhì)譜圖（圖4-E）與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖（圖4-C）一致。說明NnCCD4b 蛋白可以分解β-胡蘿卜素的9，10/9′，10′雙鍵，通過降解不同類胡蘿卜素底物的不同雙鍵，生成13 個(gè)碳原子的β-紫羅蘭酮（圖4-F）。

3 討論

本研究對(duì)NnCCD4基因家族保守基序、系統(tǒng)發(fā)育和表達(dá)模式進(jìn)行了分析，通過同源克隆從蓮基因組中獲得了3 個(gè)NnCCD4 基因家族成員：NnCCD4a、NnCCD4b和NnCCD4c，結(jié)果表明，NnCCD4 基因家族的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小在61.49～70.14 kDa，pI值在5.55～6.52，表明NnCCD4 家族成員間在蛋白質(zhì)大小、pI 值等特征參數(shù)上差異不大?？寺〉玫降? 個(gè)NnCCD4 基因家族成員與其他植物中已報(bào)道的CCD4基因相似［26］。NCBI比對(duì)結(jié)果表明，NnCCD4基因具有CCDs 家族基因相似結(jié)構(gòu)特征的保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)蛋白序列進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，NnCCD4 與其他物種CCD4 家族成員的蛋白序列有較高的同源性。此外，NnCCD4c與NnCCD4a、NnCCD4b的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明不同亞基因家族之間親緣關(guān)系存在差異。通過分析CCDs 的家族進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)NnCCD4在進(jìn)化過程中保守性不強(qiáng)，不同種屬之間存在差異，這與岳遠(yuǎn)征等［27］和王贊等［28］的研究結(jié)果一致。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育離不開CCD亞家族各成員的表達(dá)。Rubio等［29］證明番紅花（Crocus sativus）CsCCD4b僅在柱頭組織中表達(dá)；王昊等［30］證明芹菜（Apium graveolens）AgCCD4在葉片中高表達(dá)，葉柄和根中的表達(dá)量低，說明CCD 亞家族基因在植物不同組織和器官中具有表達(dá)特異性。本研究結(jié)果顯示，3 個(gè)NnCCD4基因在蓮子、葉片和花中的表達(dá)量都存在明顯差異：NnCCD4c表達(dá)量最低；對(duì)比葉片的2 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)現(xiàn)，在成熟葉片中NnCCD4a表達(dá)量明顯高于幼葉中的表達(dá)量。在3種不同顏色的花中，NnCCD4b表達(dá)量遠(yuǎn)高于NnCCD4a和NnCCD4c，且白花表達(dá)量最高，紅花次之，黃花則相對(duì)偏低。

CCD 基因家族成員是一類具有RPE65 保守結(jié)構(gòu)域的基因家族，大多存在于植物中，如葡萄基因組中鑒定出19 個(gè)CCD［31］、水稻中鑒定出11個(gè)CCD［32］、擬南芥和番茄中均鑒定到9 個(gè)CCD［6，33］。CCD 亞家族各成員編碼的酶在類胡蘿卜素的代謝過程中發(fā)揮了重要作用，目前在番紅花、桂花和矮牽牛中均已證實(shí)CCD1 和CCD4可參與類胡蘿卜素的降解，導(dǎo)致類胡蘿卜素含量發(fā)生變化，裂解產(chǎn)生獨(dú)特的香氣物質(zhì)。Baldermann等［34］證明桂花OfCCD1可裂解β-胡蘿卜素產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、假紫羅蘭酮以及香葉基丙酮。Simkin等［35］證明矮牽?；ㄖ蠵hCCD1的表達(dá)量增加會(huì)使β-紫羅蘭酮的含量相應(yīng)升高。Rubio等［29］證明番紅花CsCCD4柱頭發(fā)育期間會(huì)裂解出β-胡蘿卜素，產(chǎn)生β-紫羅蘭酮。Song等［36］證明在轉(zhuǎn)基因水稻中過表達(dá)擬南芥AtCCD4 會(huì)使水稻中β-胡蘿卜素降低74%，且β-紫羅蘭酮的含量是非轉(zhuǎn)基因水稻的2 倍。本研究通過GC-MS 和SPME 頂空吸附上機(jī)對(duì)蓮NnCCD4b共轉(zhuǎn)化菌的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明NnCCD4 可以催化β-胡蘿卜素氧化裂解，產(chǎn)生香氣物質(zhì)β-紫羅蘭酮。這與Baldermann 等［34］和Simkin 等［35］的研究結(jié)果一致。本研究表明NnCCD4很可能是蓮代謝途徑里的一個(gè)關(guān)鍵基因，這為今后植物品質(zhì)改良提供了一定的理論依據(jù)，為后續(xù)進(jìn)一步研究蓮NnCCD4基因家族功能特性提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以NnCCD4 為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)手段對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NnCCD4 與其他物種家族成員同源性較高，且NnCCD4在不同亞基因家族之間親緣關(guān)系存在差異；采用qRT-PCR 對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期NnCCD4基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，證明了蓮不同組織部位中不同基因之間存在表達(dá)差異，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，進(jìn)一步研究NnCCD4 蛋白的酶活性以及酶切產(chǎn)物，從分子水平上揭示了NnCCD4 降解類胡蘿卜素產(chǎn)生香氣物質(zhì)對(duì)蓮品質(zhì)的影響。