黃良江

(來賓市檢驗檢測中心,廣西 來賓 546100)

蜂蜜是蜜蜂通過采集植物花粉,通過與自身分泌物混合釀造出的一種甜味物質(zhì)。蜂蜜中富含多種營養(yǎng)成分,主要以果糖和葡萄糖為主,是一種天然的保健食品。有研究表明,蜂蜜具有美容養(yǎng)顏、潤腸通便的功效[1-2],因而常常被用于人體保健。同時蜂蜜也是常用的藥用輔料,廣泛應用于蜜丸等藥物的制造[3]。因此,蜂蜜無論作為保健產(chǎn)品還是作為藥用輔料使用,對其進行質(zhì)量的控制都是十分重要的[4-5]。

蜂蜜有天然的野生蜂蜜和人工飼養(yǎng)的養(yǎng)殖蜂蜜,無論是野生蜂蜜還是養(yǎng)殖的蜂蜜,對人體保健和藥物制造均具有重要價值。近年來隨著人們健康意識的提高,養(yǎng)生逐漸受到人們的關(guān)注,蜂蜜作為一種具有高營養(yǎng)價值的產(chǎn)品備受人們的青睞和歡迎[6]。由于天然的野生蜂蜜和農(nóng)家飼養(yǎng)的土蜂蜜價格較為昂貴,不法分子為追求利益,在蜂蜜中摻糖造假的行為常有發(fā)生[7]。蔗糖由于價格低廉,易于取得,常被摻和到蜂蜜中[8],因此對蜂蜜中主要糖分和摻假糖分的檢測對于打擊制假造假十分重要。筆者通過有關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索有關(guān)文獻,檢索到檢測蜂蜜中還原糖分的方法主要有旋光法[9-10]、化學法[11]、近紅外光譜法[12]、高效液相色譜法[13-14]等。高效液相色譜法由于靈敏度高、操作簡單,因而廣泛應用于蜂蜜中還原糖的檢測。但由于使用的示差折光檢測器使用條件較為嚴格,實際應用中常因色譜條件選擇不當引起各成分之間分離不佳、峰形差、影響準確定量。本研究通過改善和優(yōu)化色譜條件,建立一種前處理簡單、操作方便、色譜條件穩(wěn)定、測量準確可靠,可實際應用于蜂蜜中3種還原糖成分的含量測定,以期為實驗室對蜂蜜的品質(zhì)質(zhì)量控制和摻假打假提供可靠、穩(wěn)定的試驗方法。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

沃特世e2695高效液相色譜儀,2414示差折光檢測器,Empower色譜工作站,電子天平(瑞士梅特勒-托利多),超聲波振蕩器(鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司),離心機(德國西格瑪),恒溫水浴鍋(上海一恒),渦旋儀(廣州IKA)。

1.2 試劑耗材

乙腈(色譜純,德國默克公司),實驗用水均為超純水(一級)。

1.3 樣品與標準品

蜂蜜(批號:SP01、SP02、SP03,購于某超市;SP04、SP05、SP06,購于某蜂蜜產(chǎn)品保健專賣店;SP07、SP08、SP09,SP10,購于某蜜蜂養(yǎng)殖基地),果糖(CAS號:57-48-7,上海安譜實驗科技股份有限公司),葡萄糖(CAS號:50-99-7,上海安譜實驗科技股份有限公司),蔗糖(CAS號:57-50-1,上海安譜實驗科技股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 樣品前處理

用勺子取適量蜂蜜樣品,置于具塞錐形瓶中,蓋緊瓶塞,將樣品放入50 ℃的恒溫水浴鍋中加熱,使蜂蜜樣品全部溶化后從水浴鍋中取出,放置于攪拌器上攪拌10 min,使樣品充分攪拌混合均勻,放置于陰涼處冷卻至室溫備用。

2.1.2 樣品溶液的制備

用電子天平準確稱取冷卻至室溫的混合均勻蜂蜜樣品2 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,蓋緊瓶塞,將錐形瓶放置到超聲波振蕩器中超聲5 min,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,每次用少量純化水洗滌錐形瓶,洗滌3次,每次洗滌后將洗滌液轉(zhuǎn)移到容量瓶中,用水定容至刻度,充分振蕩搖勻。將樣品轉(zhuǎn)移至20 mL離心管中,置于離心機中以5 000 r/min的速度離心5 min后,吸取離心后的樣品上清液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,濾過至2 mL樣品上機瓶中,待上機分析。

2.2 標準溶液和空白溶液的制備

2.2.1 標準溶液的制備

2.2.1.1 標準貯備液的制備

將果糖、葡萄糖、蔗糖置于96 ℃的干燥箱中干燥3 h,冷卻至室溫后,迅速分別準確稱取果糖、葡萄糖、蔗糖各2.50 g,用少量純化水溶解,轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用純化水定容至刻度,配制成50 mg/mL的標準貯備液(標準溶液編號:①)。

2.2.1.2 標準工作液的制備

?、贅藴嗜芤?分別準確吸取0.25,0.50,2.50,5.00,7.50,10.00 mL放置于25 mL容量瓶中,加純化水稀釋并定容至刻度,配置成0.5 mg/mL(標準溶液編號:②)、1.0 mg/mL(標準溶液編號:③)、5.0 mg/mL(標準溶液編號:④)、10.0 mg/mL(標準溶液編號:⑤)、15.0 mg/mL(標準溶液編號:⑥)、20.0 mg/mL(標準溶液編號:⑦)的系列標準工作液。

2.2.2 空白溶液的制備

用純化水為空白溶液,使用時用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱類型和規(guī)格:NH2柱,規(guī)格為4.6 mm×250 mm×5 μm;流動相:V乙腈∶V水=75∶25;流速:1.0 mL/min;柱溫:45 ℃;檢測池溫度:40 ℃;洗脫方式:等度洗脫。

3 方法學考察

3.1 色譜柱的類型

選擇C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、C8色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)分別進行試驗,考察不同類型的色譜柱對還原糖的分離效能。試驗結(jié)果表明,使用C18色譜柱和C8色譜柱時,不能將果糖、葡萄糖、蔗糖有效地分離開來,即使優(yōu)化流動相比例和色譜柱溫度,亦無法達到分離度大于1.5的要求,無法實施準確定量。使用NH2色譜柱進行試驗時,果糖、葡萄糖、蔗糖3組成分能較好地分離開來,通過調(diào)整和優(yōu)化色譜條件,能使果糖和葡萄糖這兩個臨近成分較好地分離,分離度達到1.5以上的定量要求,而且色譜峰峰型也較好,理論塔板數(shù)較高,分離還原糖選擇氨基色譜柱能實現(xiàn)較好的分離效果。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜條件直接影響物質(zhì)的分離效果,本試驗考察了不同的流動相比例V乙腈∶V水(65∶35,70∶30,75∶25,80∶20,85∶15),柱溫(35,40,45,50,60 ℃)對果糖、葡萄糖、蔗糖3組成分分離度的影響。當流動相V乙腈∶V水為65∶35和70∶30時,3種還原糖成分中葡萄糖和蔗糖之間的分離度能達到大于1.5的要求,但果糖和葡萄糖之間的分離度均達不到1.5,增加乙腈的比例能使果糖和葡萄糖之間的分離度增大,當V乙腈∶V水為75∶25,80∶20,85∶15時果糖和葡萄糖之間的分離度能滿足大于1.5的要求,增加乙腈的比例雖然能提高分離度,但乙腈的價格比較昂貴,對環(huán)境的污染也比較大,為降低檢測成本和減少環(huán)境污染,因此流動相比例選擇為75∶25較為合適,既能達到分離效果又能降低檢測成本和減少環(huán)境污染?？疾焐V柱溫度時,當柱溫為35 ℃時,果糖和葡萄糖不能有效分離;當柱溫為40 ℃時,果糖和葡萄糖的分離度剛好能滿足1.5的要求;當柱溫為45 ℃時,果糖和葡萄糖能有效分離,分離度大于1.5;當柱溫升高為50,60 ℃時,果糖和葡萄糖分離度均大于1.5,但分離度變化不明顯。隨著色譜柱溫度的增高,各成分之間的分離度也相應增大,但溫度增高會影響色譜柱的使用壽命,因此選擇柱溫為45 ℃時,既能使各成分之間有效分離,又能較好地保護色譜柱。通過色譜條件的嘗試、改善、篩選和優(yōu)化,最終得到了“2.3”項下較為穩(wěn)定、可靠的條件,該色譜條件能使果糖、葡萄糖、蔗糖3組成分有效地分離,并能準確定量。該條件下,標準品和樣品的色譜圖分別如圖1～3所示。

圖1 標準品色譜圖

圖2 摻糖樣品色譜圖

圖3 非摻糖樣品色譜圖

3.3 方法檢出限和方法定量限

取“2.2.1.2”項下②號標準溶液逐級定量稀釋,按“2.3”中色譜條件進樣測定,分別以信噪比(S/N)為3時作為方法檢出限,信噪比(S/N)為10作為方法定量限。試驗結(jié)果表明,當稱樣量為2 g時,果糖、葡萄糖、蔗糖的方法檢出限為0.08 mg/mL,方法定量限為0.25 mg/mL。

3.4 線性關(guān)系和范圍

分別精密吸取“2.2.1.2”項下②號到⑦號標準工作液各10 μL注入液相色譜儀,按“2.3”項下色譜條件進行測定,分別以果糖、葡萄糖、蔗糖各成分的質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標,以果糖、葡萄糖、蔗糖各成分的峰面積作為縱坐標,建立線性回歸曲線。試驗測得果糖的回歸方程為Y=115 882.942 86X-10 648.685 71,相關(guān)系數(shù)r=0.999 74;葡萄糖的回歸方程為Y=138 564.342 86X-16 217.885 71,相關(guān)系數(shù)r=0.999 53;蔗糖的回歸方程為Y=90 760.071 43X-23 984.142 86,相關(guān)系數(shù)r=0.999 91。試驗結(jié)果表明果糖、葡萄糖、蔗糖在0.5～20.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 精密度測定

取“2.2.1.2”項下⑤號標準溶液,按“2.3”項下的色譜條件重復進樣6針,考察儀器的精密度。試驗結(jié)果顯示,重復6次進樣果糖、葡萄糖、蔗糖3個成分峰面積的RSD(n=6)分別為1.53%,1.71%,1.26%,表明儀器精密度良好。

3.6 加標回收率試驗

稱取批號為SP01的蜂蜜樣品9份,每份2 g精密稱定。分別在9份樣品添加低、中、高三種濃度水平的標準品,每個添加水平3個樣品進行試驗。上述樣品按“2.1.2”項下方法制備,按“2.3”項下的色譜條件測定,計算每份樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖的加標回收率。試驗測得低、中、高三種添加水平的樣品的平均加標回收率為88.93%～103.94%,RSD=0.37%～1.78%(n=9),表明該方法測定果糖、葡萄糖、蔗糖的準確度良好。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=9)

4 樣品測定

利用該方法對10個批次的蜂蜜樣品進行果糖、葡萄糖、蔗糖3個成分含量測定,每批樣品進行2次平行試驗以平均值作為測定結(jié)果。10批次蜂蜜樣品果糖、葡萄糖、蔗糖各成分含量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

5 討論

5.1 液相色譜條件的改善與優(yōu)化

本試驗中選擇了不同類型的色譜柱對蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖3種還原糖成分進行分離效能測試,測試結(jié)果表明氨基色譜柱能較好地實現(xiàn)果糖、葡萄糖、蔗糖3種還原糖成分的分離,氨基色譜柱是分離還原糖成分較為理想的色譜柱類型。試驗還對流動相比例和色譜柱溫度進行了考察和試驗,結(jié)果表明提高乙腈的比例和升高色譜柱溫度對增大3種還原糖成分的分離度有一定作用,而且將乙腈和水按比例混合后單通道系統(tǒng)比使用儀器四元泵按比例雙通道洗脫更容易使基線平穩(wěn)。示差折光檢測器的基線比較難穩(wěn)定和平衡,基線不穩(wěn)定直接影響積分與定量,因此使用示差折光檢測器檢測時,用流動相平衡儀器8 h以上再進樣,能使基線更為平穩(wěn)。綜合各方面因素,本試驗通過對色譜條件的嘗試和優(yōu)化,探索出了較為理想的同時測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖3種還原糖成分的液相色譜條件,即選用NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),柱溫:45 ℃,檢測池溫度:40 ℃,流動相:V乙腈∶V水=75∶25,流速:1.0 mL/min,等度洗脫的色譜條件,果糖、葡萄糖、蔗糖能有效分離和準確定性定量,色譜峰對稱性較好,分析時間適宜,該色譜條件穩(wěn)定、可靠,是液相色譜法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖3種還原糖成分含量較為理想的色譜條件。

5.2 結(jié)果與小結(jié)

建立的方法能較好實現(xiàn)蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖3種還原糖成分的分離和定量。試驗對10個批次的蜂蜜樣品進行檢測,測得7個批次的樣品沒有摻糖造假行為,果糖和葡萄糖的含量總和均大于60 g/100 g,有效成分指標能滿足國家標準的要求;3個批次的樣品檢測出了蔗糖成分,說明蜂蜜中摻糖造假的現(xiàn)象依然存在,必須對蜂蜜的質(zhì)量進行嚴格監(jiān)管和質(zhì)量把關(guān)。本研究在優(yōu)化色譜條件的基礎(chǔ)上,驗證了該方法的線性關(guān)系、精密度、加標回收試驗,方法驗證結(jié)果較為滿意,得到了較好的準確度。該方法樣品前處理操作簡單,測定結(jié)果準確可靠,可用于蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖含量的同時測定。