高曉娟,張俊嬌,劉光鵬,曲艷萍,李紅翠

(1.齊魯理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250200;2.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社 濟(jì)南果品研究院,山東 濟(jì)南 250200)

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大蒜:市售,無(wú)芽,無(wú)蟲(chóng)變,于冰箱保存。

指示菌種(由齊魯理工學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供):

有害指示菌:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、毛霉;

有益指示菌:乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、地衣芽孢桿菌。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、氯化鈉、酵母浸粉、MRS培養(yǎng)基、溴甲酚綠乙醇溶液、乙酸鈉、蔗糖、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鈉、檸檬酸等生物試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-SⅡ型,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、單人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1D型,蘇州凈化設(shè)備有限公司)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、電熱恒溫水溫箱(HHW.21型,北京永光明醫(yī)療儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜汁制備

大蒜,去皮,于榨汁機(jī)中榨成汁,再于離心機(jī)中3 000 r/min離心20 min,取上清液作為原液。

1.3.2 供試菌懸浮液制備

分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌斜面菌種于50 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi),取乳酸桿菌于50 mL BCG牛乳液體培養(yǎng)基內(nèi),取保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌于50 mL MRS液體培養(yǎng)基內(nèi),取黑曲霉、毛霉菌于50 mL PDA液體培養(yǎng)基內(nèi),分別于37和30 ℃搖床培養(yǎng)24～48 h。

1.3.3 不同條件下抑菌實(shí)驗(yàn)

因老白皮大蒜是日常生活中較為常見(jiàn)的大蒜品種,因此,1.3.3.1～1.3.3.6的實(shí)驗(yàn)均選用老白皮大蒜汁進(jìn)行。

1.3.3.1 抑菌預(yù)實(shí)驗(yàn)

采用管碟擴(kuò)散法[12]:無(wú)菌條件下,分別取100 μL細(xì)菌菌懸液和霉菌菌懸液于無(wú)菌LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基平板中,涂布均勻備用。用無(wú)菌鑷子夾取無(wú)菌牛津杯放于上述培養(yǎng)基表面,使其與培養(yǎng)基盡量接觸。分別取200 μL大蒜汁于牛津杯中,同時(shí)用無(wú)菌水做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。完成上述操作后,將培養(yǎng)皿分別放入37和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后取出,測(cè)量每個(gè)抑菌圈直徑。4種有害指示菌按上述標(biāo)準(zhǔn)操作,同時(shí)做4組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 大蒜汁濃度抑菌影響實(shí)驗(yàn)

采用二倍稀釋法:用生理鹽水把大蒜汁稀釋成濃度為50%,25%,12.5%,6.25%的大蒜汁稀釋液,按照1.3.3.1中的方法,測(cè)定不同濃度大蒜汁的抑菌效果。

1.3.3.3 pH值對(duì)大蒜汁抑菌影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法,分別移取pH值為2.6,3.6,4.6,5.6,6.6,7.6的磷酸緩沖液各4 mL,與等量大蒜汁原液混合均勻,用無(wú)菌鑷子夾取在不同pH值大蒜汁中浸泡5 min后的濾紙片,分別放在4種有害指示菌平板上。同時(shí),用無(wú)菌水做對(duì)照實(shí)驗(yàn),恒溫培養(yǎng)后,測(cè)量抑菌圈直徑,觀察pH值對(duì)大蒜汁抑菌效果的影響。

1.3.3.4 溫度對(duì)大蒜汁抑菌影響實(shí)驗(yàn)

宋軍霞等[13]人研究發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),隨著熱處理溫度升高,大蒜汁抑菌作用逐漸增強(qiáng),但當(dāng)超過(guò)一定溫度后,大蒜汁抑菌作用逐漸減弱甚至失去抑菌活性。實(shí)驗(yàn)采用管碟擴(kuò)散法,取6支試管各取4 mL大蒜汁,分別放入35,45,55,65,75 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行熱處理,處理時(shí)間為30 min,按1.3.3.1中的方法觀察溫度對(duì)大蒜抑菌效果的影響。

1.3.3.5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)大蒜汁抑菌影響實(shí)驗(yàn)

將老白皮大蒜汁原液在室溫下避光保存,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌,每間隔一天做一次抑菌實(shí)驗(yàn),連續(xù)5 d,按照1.3.3.1中的方法測(cè)定抑菌圈直徑大小,觀察儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)大蒜汁抑菌效果的影響。

1.3.3.6 大蒜汁對(duì)環(huán)境微生物的抑制實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)采用自然沉降法:分別取6個(gè)無(wú)菌LB和PDA固體培養(yǎng)基平板,放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,打開(kāi)皿蓋,3個(gè)LB培養(yǎng)基表面上噴上老白皮大蒜汁,另三個(gè)噴上無(wú)菌水做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。6個(gè)PDA培養(yǎng)基作同樣處理,過(guò)夜后,蓋上皿蓋,置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h,觀察培養(yǎng)皿內(nèi)微生物生長(zhǎng)情況。

1.3.3.7 不同類(lèi)型大蒜抑菌效果的影響實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用新鮮紫皮大蒜、新鮮白皮大蒜、老紫皮大蒜、老白皮大蒜4種不同類(lèi)型大蒜汁,分別在37和70 ℃水浴處理30 min后,研究不同溫度下不同類(lèi)型的大蒜對(duì)不同類(lèi)型微生物的抑制效果。

抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片擴(kuò)散法:取20 μL不同類(lèi)型的大蒜汁于無(wú)菌濾紙片上,晾干后放于不同指示菌的固體培養(yǎng)基平板中,輕壓濾紙片,使其貼合在培養(yǎng)基上。同樣操作,用無(wú)菌水做對(duì)照實(shí)驗(yàn)。37 ℃恒溫培養(yǎng),48 h后用直尺測(cè)量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜汁對(duì)不同微生物的抑菌效果

對(duì)4種典型有害指示菌的抑菌預(yù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示。

圖1 大蒜汁對(duì)4種指示菌的抑菌結(jié)果圖

表1 大蒜汁對(duì)4種有害指示菌的抑菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1所示:大腸桿菌的抑菌圈最大,說(shuō)明大蒜汁對(duì)其抑制效果最好;對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果次之,但是抑菌圈明顯;黑曲霉和毛霉的抑菌圈較小;因此,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明大蒜汁對(duì)細(xì)菌的抑菌效果更顯著。

2.2 大蒜汁濃度對(duì)抑菌效果的影響

4種濃度對(duì)4種有害指示菌的抑菌結(jié)果如圖2所示:大蒜汁的濃度越高,對(duì)4種微生物的抑菌效果越好,濃度越低,抑菌效果顯著降低。不同濃度的大蒜汁對(duì)大腸桿菌的抑菌作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌、黑曲霉和毛霉;對(duì)毛霉的抑制效果最弱,當(dāng)濃度降到25%時(shí),就沒(méi)有明顯抑菌圈;濃度降到12.5%時(shí),黑曲霉無(wú)明顯抑菌圈,但與對(duì)照組相比,大蒜汁周?chē)拿咕咦拥纳闪考熬z濃度明顯降低。

圖2 不同濃度大蒜汁對(duì)指示菌抑制效果

2.3 不同pH值對(duì)大蒜汁抑菌效果的影響

利用緩沖液對(duì)大蒜汁進(jìn)行pH值調(diào)整后再進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果由圖3可以看出,隨pH值的升高大蒜汁對(duì)于細(xì)菌的抑制效果呈現(xiàn)出先降低再升高再降低的趨勢(shì),說(shuō)明酸性條件下,大蒜對(duì)于細(xì)菌抑制效果較強(qiáng);而對(duì)于霉菌呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。可在后續(xù)研究中,繼續(xù)升高pH值,觀察堿性條件下對(duì)霉菌的最佳抑制pH值。

圖3 不同pH值大蒜汁對(duì)指示菌抑制效果

2.4 溫度對(duì)大蒜汁抑菌效果的影響

利用不同溫度熱處理的大蒜汁對(duì)4種有害指示菌的抑菌效果不同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí),抑菌效果明顯減弱,溫度越高抑菌效果越弱。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以確定最適抑菌溫度是35 ℃。當(dāng)處理溫度高于55 ℃時(shí),處理后的大蒜汁對(duì)黑曲霉和毛霉的抑菌實(shí)驗(yàn),沒(méi)有明顯抑菌圈;被75 ℃處理后,大蒜汁對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯抑菌圈現(xiàn)象。這說(shuō)明當(dāng)溫度高于75 ℃甚至更高時(shí),大蒜汁的抑菌活性基本消失,這可能是由于高溫破壞了大蒜中的抑菌活性成分而失去抑菌活性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以增加低溫到35 ℃之間的溫度梯度,研究低溫對(duì)抑菌效果的影響。

圖4 不同溫度下處理過(guò)的大蒜汁對(duì)指示菌抑制效果

2.5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

不同儲(chǔ)存時(shí)間的大蒜汁對(duì)指示菌的抑制結(jié)果如圖5所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,大蒜的抑菌效果逐漸減弱,在存儲(chǔ)5 d后,檢測(cè)不到抑菌圈。

圖5 大蒜汁的儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)指示菌的抑制效果

2.6 大蒜汁對(duì)環(huán)境微生物的抑制效果

通過(guò)培養(yǎng)噴灑大蒜汁與無(wú)菌水的培養(yǎng)基平板后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示,兩圖中上層平板為噴有大蒜汁的實(shí)驗(yàn)組,下層平板為無(wú)菌水的對(duì)照組。對(duì)比結(jié)果可以明顯看出,在噴有大蒜汁的平板上微生物菌落較少,對(duì)照組平板上微生物的長(zhǎng)勢(shì)明顯,所以大蒜汁對(duì)環(huán)境中的微生物具有明顯的抑制作用。

圖6 PDA培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)情況

圖7 LB培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)情況

2.7 不同類(lèi)型大蒜的抑菌效果

37和70 ℃水浴處理后的不同大蒜汁對(duì)不同微生物進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示。

表2 37 ℃下大蒜液對(duì)不同指示菌的抑菌效果

表3 70 ℃下大蒜液對(duì)不同菌種的抑菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,37 ℃大蒜汁對(duì)5種指示菌均有顯著抑制效果,其中,4種不同類(lèi)型的大蒜均對(duì)大腸桿菌的抑制效果最顯著,老紫皮大蒜的抑菌效果最好,新鮮白皮大蒜的抑菌效果最弱;對(duì)益生菌中的地衣芽孢桿菌和保加利亞乳桿菌的抑制效果更強(qiáng);70 ℃大蒜汁對(duì)指示菌的抑菌效果較弱,高溫使大蒜的抑菌活性降低,通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,大蒜對(duì)有害菌的生長(zhǎng)影響比對(duì)有益菌的生長(zhǎng)影響要大。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,大蒜對(duì)細(xì)菌的抑制效果要強(qiáng)于霉菌;不同濃度的大蒜汁對(duì)微生物的抑制效果不同,濃度越高,抑菌效果越明顯;不同pH環(huán)境,大蒜抑菌效果不同,在偏酸性環(huán)境中對(duì)指示細(xì)菌抑制效果更好,在偏酸或偏堿條件下對(duì)指示霉菌抑制效果較好;通過(guò)熱處理實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,溫度超過(guò)35 ℃以后,隨著溫度的升高,大蒜的抑菌活性逐漸降低甚至消失;大蒜汁隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加,抑菌效果逐漸減弱;通過(guò)研究大蒜對(duì)腐敗微生物的生長(zhǎng)影響,可為大蒜在食品防腐保鮮中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

通過(guò)研究大蒜對(duì)乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、地衣芽孢桿菌4種益生菌的影響,結(jié)果表明,大蒜對(duì)益生菌具有一定抑制效果,尤其是對(duì)保加利亞乳桿菌和地衣芽孢桿菌的抑制效果較強(qiáng),建議人們?cè)谑秤煤幸嫔＝∑坊蚴称窌r(shí),盡量減少大蒜的攝入,尤其是減少生食老紫皮大蒜。若必須攝取大蒜,可通過(guò)食用加熱處理后的大蒜,并在攝取大蒜后立即飲水,使腸胃中的大蒜得到適當(dāng)?shù)南♂?以減少大蒜對(duì)益生菌生長(zhǎng)的抑制,使得補(bǔ)充益生菌的作用得到最大發(fā)揮。