袁正 周春陽

角膜在眼球光學(xué)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用,角膜疾病是導(dǎo)致失明的主要原因之一。目前,治療角膜盲的主要方法是角膜移植,而用于移植的角膜主要來源是器官捐獻(xiàn),不足以滿足臨床需求。供體角膜的嚴(yán)重短缺推動了角膜替代物的研究。隨著3D打印技術(shù)的迅速發(fā)展和進步,目前在眼科和眼科護理等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用,如制造眼眶植入物、眼球假體等定制產(chǎn)品。3D生物打印技術(shù)(3D bio-printing technology)是一項廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的新興技術(shù)。該技術(shù)使用由活細(xì)胞、生物材料或活性生物分子組成的生物墨水,通過計算機輔助控制在空間逐層精確排列來制造具有生物活性的組織或器官替代物。3D生物打印的出現(xiàn),使獲得個性化的角膜植入物和具有可控結(jié)構(gòu)與設(shè)計的單層或多層角膜等效物成為可能,是一種很有前景的角膜替代方法。預(yù)計在不久的將來,將有更多的眼科醫(yī)生和其他臨床醫(yī)生使用這項技術(shù)。

1 用于3D生物打印的材料

由于天然組織微環(huán)境的復(fù)雜性,精確構(gòu)建仿生微環(huán)境仍然是一個挑戰(zhàn)。3D生物打印系統(tǒng)能夠產(chǎn)生微米級仿生微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。水凝膠、纖維素等材料作為構(gòu)建仿生微環(huán)境的關(guān)鍵構(gòu)件,需要滿足印刷適宜性好、印刷過程變形小以及對細(xì)胞友好和快速凝膠化的要求。最重要的是,水凝膠應(yīng)該提供引導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建自然微環(huán)境的平臺,并且以精確和近生理的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。

1.1 藻酸鹽水凝膠

藻酸鹽水凝膠是一種天然多糖,通常來自各種藻類。具有成本低、生物相容性好、離子凝膠化速度快等優(yōu)點,已成為3D生物打印的理想生物墨水來源,目前已應(yīng)用于血管組織、骨和軟骨的打印。然而,缺乏細(xì)胞粘附性、生物降解性不穩(wěn)定以及印刷適宜性差限制了藻酸鹽水凝膠生物墨水的應(yīng)用。這種水凝膠中的細(xì)胞不能降解周圍的藻酸鹽凝膠基質(zhì),導(dǎo)致它們始終保持在低增殖和未分化狀態(tài)。Wu等[1]通過添加檸檬酸鈉并搭載人角膜上皮細(xì)胞獲得了可降解的細(xì)胞負(fù)載組織結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好,細(xì)胞可表現(xiàn)出更高的增殖率且存活率高達(dá)90%以上。Tabriz等[2]開發(fā)了一種新的3D生物打印技術(shù),以生產(chǎn)更復(fù)雜的藻酸鹽水凝膠結(jié)構(gòu)。通過將藻酸鹽水凝膠的交聯(lián)過程分為三個階段來實現(xiàn):一次鈣離子交聯(lián)劑用于凝膠的印刷適宜性;二次鈣離子交聯(lián)劑用于藻酸鹽水凝膠在印刷后的剛性;三次鋇離子交聯(lián)劑用于藻酸鹽水凝膠在培養(yǎng)介質(zhì)中的長期穩(wěn)定性。為了確保該生物打印技術(shù)的可行性,首先打印了簡單的3D結(jié)構(gòu),然后成功打印了分支血管結(jié)構(gòu)等復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)。

Olate-Moya等[3]通過微擠壓工藝開發(fā)了用于3D打印的生物共軛水凝膠納米復(fù)合油墨,提高了生物相容性和印刷性。這種水凝膠是基于與明膠和硫酸軟骨素生物結(jié)合的可光交聯(lián)性藻酸鹽,以模擬軟骨細(xì)胞外基質(zhì);而納米填料是基于氧化石墨烯,以增強印刷性和細(xì)胞增殖。結(jié)果表明,在水凝膠墨水中加入氧化石墨烯顯著提高了3D打印支架的形狀保真度和分辨率。此外,由于氧化石墨烯液晶的模板作用,納米復(fù)合油墨在3D打印過程中還會產(chǎn)生各向異性的線條。人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue derived stem cells,hASCs)的體外增殖實驗表明,生物偶聯(lián)支架的細(xì)胞增殖率高于純藻酸鹽,其中納米復(fù)合材料的細(xì)胞增殖率最高。第7天hASCs在不同支架上完全存活。值得注意的是,用納米復(fù)合水凝膠墨水制備的支架能夠引導(dǎo)細(xì)胞沿著3D打印線的方向增殖。28天后的免疫染色顯示,生物結(jié)合的藻酸鹽水凝膠基質(zhì)可在不含外源性促軟骨生成因子的情況下誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞分化。

1.2 甲基丙烯酸酯明膠

基于甲基丙烯酸酯明膠(gelatin methacrylate,GelMA)的水凝膠在組織工程中作為潛在的可植入材料受到了極大的關(guān)注。由于不同的自然組織對機械力的反應(yīng)不同,理想的植入材料需要與靶組織的機械性能非常匹配。研究表明,GelMA水凝膠有助于緩解角膜基質(zhì)纖維化現(xiàn)象,減少纖維化導(dǎo)致的角膜屈光力損失。但目前GelMA水凝膠的應(yīng)用仍受到GelMA低機械強度和物理性質(zhì)的限制。許多研究詳細(xì)描述了將各種生物材料加入到GelMA水凝膠中,以調(diào)整其各種性能,例如物理強度、化學(xué)性質(zhì)、導(dǎo)電性,并促進細(xì)胞負(fù)載和加速組織修復(fù)。

Farasatkia等[4]開發(fā)了基于絲素納米纖維(silk nanofibrils,SNF)和GelMA的透明薄膜用于角膜組織工程。通過改變SNF與GelMA的體積比,可以調(diào)節(jié)薄膜的力學(xué)性能、透明度、降解速率和溶脹比。其中,SNF/GelMA的最佳配比為3:7,可具有較高的透明性,透光率可達(dá)85%以上,親水性和力學(xué)性能接近天然角膜基質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)研究還證明了SNF/GelMA膜支持基質(zhì)細(xì)胞附著、擴散和增殖的能力。Yin等[5]使用3D生物打印將5%(w/v)細(xì)胞負(fù)載的GelMA生物墨水精確沉積到具有高細(xì)胞活性的受控微結(jié)構(gòu)中。通過在GelMA生物墨水中加入明膠,實現(xiàn)了明膠快速可逆熱交聯(lián)和GelMA不可逆光交聯(lián)的兩步交聯(lián)法。成功地將5%(w/v)的GelMA和8%(w/v)的明膠打印成3D結(jié)構(gòu),提高了生物打印后的形狀逼真度。通過骨髓干細(xì)胞(bone marrow stem cells,BMSCs)的體外培養(yǎng)和細(xì)胞打印,證明了5/8%(w/v)的GelMA/明膠生物墨水的細(xì)胞活性。BMSCs在5/8%(w/v)的GelMA/明膠支架上的鋪展面積較大,打印后BMSCs的存活率達(dá)90%以上。

1.3 其他材料

許多基于天然聚合物的生物墨水均可用于3D生物打印,如多糖甲基纖維素、瓊脂、脫細(xì)胞基質(zhì)等。Kim等[6]以部分氧化透明質(zhì)酸鹽(oxidized hyaluronate,OHA)和乙二醇?xì)ぞ厶?glycol chitosan,GC)為原料,在己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)存在下,設(shè)計了一種自愈合水凝膠,具有再生軟骨的潛力。OHA/GC/ADH水凝膠的自愈合能力歸因于凝膠中兩個動態(tài)可逆的共價交聯(lián)鍵,包括OHA與GC之間通過席夫堿反應(yīng)得到的亞胺鍵,以及OHA與ADH反應(yīng)形成的酰肼鍵。OHA/GC/ADH水凝膠用于打印3D結(jié)構(gòu)時不需要任何凝膠后或額外的交聯(lián)化過程,聚合物的濃度和相對分子質(zhì)量是影響自愈合水凝膠流動性和力學(xué)性能的關(guān)鍵參數(shù)。Ji等[7]以1,4-丁二醇和碳酸二甲酯為原料,通過本體縮聚反應(yīng)成功地制備了聚1,4-碳酸丁酯(poly 1,4-butylene carbonate,PBC),并評估了PBC在熔融沉積成型(fused deposition modeling,FDM)中的適用性。該研究將PBC在150℃以上的加熱室中熔化,然后施加壓力從打印噴嘴流出并在室溫下固化,形成3D支架結(jié)構(gòu)。通過控制FDM機的溫度和壓力,可以得到與程序設(shè)計完全匹配的3D支架,且PBC支架具有良好的生物相容性。

2 載干細(xì)胞打印角膜組織

脂肪干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種亞型,具有低侵入性、易獲得的重要優(yōu)勢。其具備分化為多種細(xì)胞系的潛能,可表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)特性,并通過分泌營養(yǎng)因子促進組織再生。研究表明,hASCs可用于再生人類角膜的上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層[8]。

Sorkio等[9]使用人類干細(xì)胞和激光輔助3D生物打印來制造模擬角膜組織。人胚胎干細(xì)胞來源的角膜緣上皮干細(xì)胞(human embryonic stem cell derived limbal epithelial stem cells,hESC-LESCs)作為打印上皮樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞源,而hASCs用于構(gòu)建層狀基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。重組人層粘連蛋白和人源性I型膠原蛋白作為功能性生物墨水的基質(zhì)。共打印了三種類型的角膜結(jié)構(gòu):包括使用hESC-LESCs的層狀角膜上皮;使用無細(xì)胞生物墨水和hASCs交替的角膜基質(zhì)層;最后是具有基質(zhì)和上皮的雙層結(jié)構(gòu)。兩種細(xì)胞在打印后都保持了良好的活性。打印后的hESC-LESCs顯示上皮細(xì)胞形態(tài)、Ki67增殖標(biāo)記物的表達(dá)以及角膜前體標(biāo)記物p63α和p40的共同表達(dá)。重要的是,打印的hESC-LESCs形成了一層復(fù)層上皮,頂端表達(dá)CK3,基礎(chǔ)表達(dá)祖細(xì)胞標(biāo)志物。3D生物打印的基質(zhì)結(jié)構(gòu)與天然角膜基質(zhì)組織一致,并顯示I型膠原陽性標(biāo)記。3D打印的基質(zhì)構(gòu)建物植入豬角膜器官中7天后,植入物附著在宿主組織上,并有hASCs從打印結(jié)構(gòu)遷移的跡象。該研究表明使用人類干細(xì)胞,可以成功地制造出與天然角膜組織結(jié)構(gòu)相似的3D生物打印組織。

Arnalich-Montiel等[10]測試了人脂肪干細(xì)胞移植到兔角膜基質(zhì)中的生物安全性和免疫原性。脂肪干細(xì)胞在移植后10周,仍可保持其形狀,并在不破壞其組織學(xué)模式的情況下混合在基質(zhì)中,沒有引起免疫反應(yīng)。此外,即使脂肪干細(xì)胞在基質(zhì)中形成一層不連續(xù)層時,透明度仍然保持不變。 Espandar等[11]研究表明,人脂肪干細(xì)胞可在兔角膜基質(zhì)內(nèi)成功生長,并能表達(dá)人角膜特異性蛋白。Alio等[12]將hASCs注入脫細(xì)胞人角膜基質(zhì)中進行再細(xì)胞化,然后植入兔角膜基質(zhì)內(nèi),評估了移植物的生物整合、干細(xì)胞活性和特異性蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,hASCs體外具有良好的再細(xì)胞能力,可在移植物內(nèi)存活,并向有功能的角質(zhì)形成細(xì)胞分化。植入后3個月移植物仍保持透明,且沒有任何排斥跡象。除此之外,還有研究團隊[13]提出了將hASCs定向分化為人角膜內(nèi)皮細(xì)胞(human corneal endothelial cells,hCECs)的方案。進一步拓寬了自體眼外來源的細(xì)胞類型,可用于臨床治療角膜內(nèi)皮缺乏癥。

3 載上皮細(xì)胞打印角膜組織

角膜神經(jīng)、上皮和基質(zhì)之間的相互作用對于維持健康的角膜是必不可少的。Wang等[14]構(gòu)建了一個包括上皮、基質(zhì)和神經(jīng)的3D角膜組織模型。使用絲蛋白薄膜作為支架支撐角膜上皮和基質(zhì)層,而周圍的絲質(zhì)多孔海綿則支持神經(jīng)元的生長。神經(jīng)元支配上皮層和基質(zhì)層,并改善組織的功能和生存能力。在體外模擬出角膜組織的氣液界面環(huán)境,對上皮成熟度產(chǎn)生了積極的影響。Gosselin等[15]設(shè)計了一個以絲蛋白生物材料為支架的共培養(yǎng)系統(tǒng),研究了人角膜上皮細(xì)胞和人角膜基質(zhì)干細(xì)胞在該培養(yǎng)體系中向角膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的生長和分化。結(jié)果表明,絲質(zhì)支架與細(xì)胞兼容,可以形成透明的3D組織系統(tǒng)。此外,還研究了體外培養(yǎng)體系中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞的增殖分化作用。與單純的角膜上皮細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞相比,這兩種細(xì)胞類型在共培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出更完整的分化和生長。角膜上皮絲膜結(jié)合了大量的IV型膠原,角膜上皮和基質(zhì)蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平的增加,表明每種細(xì)胞類型的分化明顯。

He等[16]將GelMA和長鏈聚乙二醇二丙烯酸酯(poly ethylene glycol diacrylate,PEGDA)混合形成雙組分油墨,利用光引發(fā)共聚后的長鏈PEGDA結(jié)晶交聯(lián)對GelMA水凝膠起到增韌作用,結(jié)合數(shù)字光處理印刷技術(shù),可打印不同機械強度的程序化PEGDA-GelMA物件。印制的PEGDA-GelMA水凝膠支持細(xì)胞的黏附、增殖、遷移,同時表現(xiàn)出較高的透光率,以及適當(dāng)?shù)娜苊浂取I養(yǎng)物質(zhì)的滲透率和降解率。由負(fù)載兔角膜上皮細(xì)胞的上皮層和兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維基質(zhì)層組成的雙層穹頂狀角膜支架具備高精確度和可處理性。這種雙層細(xì)胞負(fù)載的角膜支架被應(yīng)用于兔角膜移植。術(shù)后顯示角膜缺損區(qū)有效封閉、再上皮化和基質(zhì)再生。3D打印角膜支架的微結(jié)構(gòu)與上皮和基質(zhì)層中細(xì)胞的精確定位相結(jié)合,為角膜再生提供了最佳的地形學(xué)和生物學(xué)微環(huán)境。

4 載基質(zhì)細(xì)胞打印角膜組織

使用載角膜基質(zhì)細(xì)胞(corneal stromal keratocytes,CSK)的膠原基生物墨水和合適的支撐結(jié)構(gòu)可3D打印出與自然角膜基質(zhì)類似的結(jié)構(gòu),CSK在打印后第7天仍可顯示出較高的細(xì)胞活力,并保持其天然的基質(zhì)細(xì)胞表型。經(jīng)光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)證實,3D生物打印的角膜基質(zhì)等效物光學(xué)性質(zhì)與天然角膜基質(zhì)相似。Park等[17]將3D生物打印的脫細(xì)胞膠原片植入五只兔的角膜基質(zhì)層,使用OCT對植入膠原片后的兔角膜進行了體內(nèi)無創(chuàng)監(jiān)測。術(shù)后1個月,通過對深度-強度的圖像分析和蘇木精-伊紅染色,證實了其具備生物相容性。

為了模擬角膜基質(zhì)的自然形態(tài)和功能,有研究團隊制備了具有高透明度(約90%)的載基質(zhì)細(xì)胞GelMA水凝膠[18]。穩(wěn)定性研究表明,GelMA水凝膠在磷酸緩沖鹽溶液放置21天后仍有87%的保存率。凝膠中負(fù)載的CSK在48 h的細(xì)胞存活率超過90%;培養(yǎng)3周后,熒光圖像和掃描電子顯微鏡觀察到水凝膠中細(xì)胞拉長并相互連接,細(xì)胞均勻分布。此外,該團隊還制備了GelMA和聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly hydroxyethyl methacrylate,pHEMA)互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠作為角膜基質(zhì)替代物,并進行了體內(nèi)和體外實驗。隨著pHEMA的加入,凝膠的壓縮模數(shù)顯著增加。超過90%的CSK可在GelMA和GelMA-HEMA水凝膠中存活,同時合成了具有代表性的膠原蛋白和蛋白多糖,保留了細(xì)胞的功能和表型。并且細(xì)胞負(fù)載的GelMA-HEMA水凝膠在培育3周后,透明度與天然角膜相當(dāng)。Mahdavi等[19]以GelMA與CSK混合作為生物墨水,利用3D生物打印出與人角膜解剖形態(tài)相似的穹頂狀結(jié)構(gòu)。同時對兩種不同濃度的GelMA大分子聚合物(7.5%和12.5%)進行了角膜基質(zhì)生物印跡試驗。結(jié)果表明,12.5%濃度GelMA支架的機械強度更高,更容易處理;含水率和透光率更接近天然角膜基質(zhì)組織。7天后,12.5%濃度GelMA樣品中可見細(xì)長的CSK,表明細(xì)胞在支架內(nèi)附著、生長和整合,細(xì)胞相容性更高?？傊?負(fù)載CSK的3D打印GelMA水凝膠具有極好的透明度、足夠的機械強度和高細(xì)胞存活率,模擬了角膜基質(zhì)的生物和物理特性,是一種很有前景的角膜基質(zhì)組織生物制造方法。

Ghezzi等[20]將基于多孔、光學(xué)透明的絲蛋白薄膜與人角膜基質(zhì)干細(xì)胞(human corneal stromal stem cells,hCSSCs)相結(jié)合,通過將單層多孔絲膜堆積成正交的多層結(jié)構(gòu),制備了具有3D功能的角膜基質(zhì)組織等效物。組織學(xué)切片顯示,接種hCSSCs的3D組織系統(tǒng)中產(chǎn)生了細(xì)胞外基質(zhì)。與2D單層絲膜系統(tǒng)相比,3D組織系統(tǒng)中的hCSSCs基因表達(dá)上調(diào)。初始基質(zhì)的重塑顯著提高了構(gòu)建物的粘聚力和機械性能,同時在9周后保持了透明度。Kutlehria等[21]設(shè)計了高通量3D生物打印角膜等效物。將人CSK加入到優(yōu)化的生物墨水中,打印出負(fù)載CSK的角膜基質(zhì)等效物。結(jié)果顯示,CSK在2周內(nèi)保持了較高的存活率(>95%),打印的角膜結(jié)構(gòu)能夠保持其穩(wěn)定性、完整性和透明度,且在打印的角膜中有纖維連接蛋白和肌動蛋白的表達(dá)。表明3D打印角膜基質(zhì)等效物的高通量制造已經(jīng)實現(xiàn)。

5 載內(nèi)皮細(xì)胞打印角膜組織

有研究團隊將培養(yǎng)的hCECs懸液接種于脫細(xì)胞人角膜基質(zhì)層上,構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮移植物[22]。在兔角膜內(nèi)皮損傷的模型中,分別植入和不植入含hCECs的脫細(xì)胞薄層(實驗組和對照組),并檢測了這些移植物的功能和存活率。結(jié)果顯示,hCECs在脫細(xì)胞薄層上提供了最佳且一致的內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)密度和多邊形形態(tài),并具備主動泵送功能。術(shù)后實驗組的角膜透明度逐漸恢復(fù),而對照組的角膜混濁和水腫持續(xù)長達(dá)4周。組織學(xué)檢查顯示,實驗組的移植物表面覆蓋著人類來源的內(nèi)皮細(xì)胞。表明脫細(xì)胞基質(zhì)載體與hCECs體外復(fù)合移植治療角膜內(nèi)皮疾病具備可行性,可提高角膜內(nèi)皮疾病患者的視覺質(zhì)量。

Kim等[23]將核糖核酸酶5(ribonuclease5,RNase5)表達(dá)載體導(dǎo)入培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,獲得了高表達(dá)RNase5的hCECs。作為R5-hCECs促進細(xì)胞增殖和存活的候選靶點,程序性細(xì)胞死亡蛋白4被抑制,細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白E1被激活。將培養(yǎng)的R5-HCECs和對照的hCECs分別沉積在凍干羊膜(amniotic membrane,AM)上,采用3D生物打印技術(shù)制備RNase5載體攜帶hCECs的可移植羊膜移植物(R5-Graft)和僅攜帶hCECs的對照AM移植物(Ct-Graft)。植入兔角膜后2周開始,R5-Graft和Ct-Graft兩組兔角膜的透明性都逐漸恢復(fù);第3～4周時,R5-Graft組的角膜中央水腫明顯輕于Ct-Graft組,且角膜內(nèi)皮表型標(biāo)志物的體外表達(dá)明顯高于Ct-Graft組。該研究表明使用培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)容易存活并可作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用。此外,使用高表達(dá)RNase5的hCECs可能是獲得更高的移植物細(xì)胞密度和增強移植物功能的一種選擇。

6 總結(jié)與展望

3D生物打印基于數(shù)學(xué)模型和計算機斷層掃描技術(shù),可以設(shè)計并制作個性化角膜替代物。利用快速、簡單、低成本、高重復(fù)性和高質(zhì)量的制造工藝,根據(jù)生物力學(xué)分析、重量、結(jié)構(gòu)完整性和生物相容性等方面對打印的角膜替代物進行評估,可以制作出符合自然人體角膜結(jié)構(gòu)特征的高透光性的曲面薄膜。目前的研究主要使用搭載干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物墨水3D打印出具備不同生理特點的角膜組織,并已經(jīng)證明了個性化設(shè)計、分析和制造角膜替代物具備可行性。隨著研究的不斷深入,3D生物打印的角膜替代物能夠應(yīng)用于臨床,解決角膜供體稀缺的難題。

除此之外,3D生物打印的個性化角膜替代物有望應(yīng)用于角膜屈光手術(shù)領(lǐng)域,矯治目前普遍存在的近視、遠(yuǎn)視和散光。傳統(tǒng)的激光角膜屈光手術(shù)通過切削角膜組織來矯正屈光不正,受角膜厚度、角膜形態(tài)等因素的限制。而角膜透鏡植入可以突破該限制,使角膜屈光手術(shù)不消融角膜組織成為可能。通過3D生物打印技術(shù)體外構(gòu)建個性化的角膜基質(zhì)透鏡,將透鏡植入受體角膜基質(zhì)層間改變角膜的曲率以矯正屈光不正。當(dāng)植入角膜基質(zhì)層間的透鏡為凹透鏡時,可降低角膜的屈光力,達(dá)到矯正近視的效果。