向桂麗,烏日娜,Yamamoto Naoki,吳一超,蔣 進(jìn),廖明莉,魏淑紅,彭正松,楊在君

(1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 南充 637000;2.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川 南充 637000;3.南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,四川 南充 637000;4.西昌學(xué)院 農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院,四川 西昌 615013)

小麥(TriticumaestivumL.)是典型的C3植物,也是世界絕大多數(shù)地區(qū)的主要糧食作物之一[1-2]。在過(guò)去的幾十年里,以半矮稈小麥育種為代表的“綠色革命”使小麥的產(chǎn)量大幅度提高,在很大程度上保障了過(guò)去幾十年全世界的糧食安全[3]。但由于人口的迅速增加以及生物和非生物脅迫等因素的影響,到2050年小麥產(chǎn)量仍需每年增加1.7%左右方可滿足全球的需求[4]。因此,提高小麥的單產(chǎn)水平仍然是小麥育種的根本目標(biāo)。與其他谷類作物一樣,小麥花器官的發(fā)育直接影響其產(chǎn)量,而花器官異?？梢詾楦牧夹←湲a(chǎn)量提供獨(dú)特的遺傳資源[5]。三雌蕊小麥(TP)具有3個(gè)正常的雄蕊和3個(gè)可育的雌蕊,能結(jié)3顆種子,具有顯著的穗粒數(shù)優(yōu)勢(shì)[6]。從TP與中國(guó)春(CS)的雜交后代中篩選出的雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊突變體(HTS-1)除具有三雌蕊性狀外,其雄蕊全部或部分同源轉(zhuǎn)化為雌蕊,自然結(jié)實(shí)率僅為12%左右,而正常雌蕊和完全轉(zhuǎn)化的雌蕊發(fā)育正常,一朵小花中可結(jié)3～4粒種子[7]。因此,TP和HTS-1在提高小麥產(chǎn)量和創(chuàng)制雜交小麥中具有較大的潛力。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC;EC4.1.1.31)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)發(fā)生不可逆的β-羧基化反應(yīng),生成草酰乙酸(OAA)和無(wú)機(jī)磷酸(Pi)。PEPC在植物、藻類和細(xì)菌中廣泛存在,但在動(dòng)物和真菌中缺失[8]。在植物中,PEPC起著變構(gòu)酶的作用,并被PEPC蛋白激酶磷酸化[9-10]。在C4植物和景天酸代謝途徑(CMA)的植物中PEPC得到了廣泛而深入的研究,因?yàn)樵诠夂献饔弥兴谴呋髿庵蠧O2固定初始反應(yīng)的關(guān)鍵酶[11-12]。在非光合細(xì)胞和C3植物中PEPC也發(fā)揮著重要作用,例如:補(bǔ)充由脂質(zhì)合成、生物合成和氮同化等過(guò)程消耗的三羧酸循環(huán)(TCA)中間體,參與果實(shí)成熟、種子形成和發(fā)芽等生物過(guò)程[12-13]。該酶還在保衛(wèi)細(xì)胞的氣孔開(kāi)放和固氮豆科植物的根瘤中發(fā)揮特殊作用[14-15]?；蚪M分析表明,C3植物中包含一個(gè)小的PEPC家族,主要由植物型PEPC(PTPC)和細(xì)菌型PEPC(BTPC)2種類型組成[16]。與植物型PEPC不同,細(xì)菌型PEPC在其N端不存在絲氨酸磷酸化結(jié)構(gòu)域。

C4植物在低CO2濃度、高溫、強(qiáng)光和干旱脅迫條件下具有更高的光合作用水平、水和氮的利用效率以及更高的生物產(chǎn)量。因此,將C4基因轉(zhuǎn)入C3作物,以提高C3植物的光合速率和耐熱性。PEPC是C4途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,它一直是C3植物的轉(zhuǎn)化靶點(diǎn)[17-18]。研究表明[19],通過(guò)將C4植物玉米(ZeamaysL.)的PEPC基因轉(zhuǎn)入C3植物小麥中,可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥光化學(xué)和抗氧化酶活性,上調(diào)光合作用相關(guān)基因的表達(dá),延遲葉綠素的降解,改變小麥中脯氨酸和其他代謝物的含量,并最終提高其耐熱性。到目前為止,尚無(wú)關(guān)于PEPC參與小麥器官發(fā)育的報(bào)道。Yamamoto等[20]研究表明,小麥Tappc3基因在雌蕊中表達(dá)量較高,因此,推測(cè)其與雌蕊的發(fā)育相關(guān)。近期,筆者從Yang等[21]利用HTS-1的正常雌蕊(P)、雌蕊化雄蕊(PS)和TP的正常雄蕊(S)為材料構(gòu)建的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出一個(gè)在PS和P中表達(dá)量異常高的基因,經(jīng)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),該基因與節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)和大麥(HordeumvulgareL.)中編碼PEPC3蛋白的基因同源,由于該基因位于3A染色體上,因此命名為T(mén)appc3A。

在本研究中從HTS-1和三雌蕊近等基因系CM28TP中克隆了Tappc3A基因,并對(duì)其表達(dá)模式、共表達(dá)基因及原核表達(dá)后酶的活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,Tappc3A可能參與小麥雌蕊發(fā)育,它在雄蕊中的過(guò)量表達(dá)可能與HTS-1的雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊性狀形成有一定的關(guān)聯(lián)。本研究為進(jìn)一步闡明Tappc3A基因的功能及其小麥雌蕊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用三雌蕊小麥CM28TP和小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化雌蕊突變體HTS-1為試驗(yàn)材料。CM28TP是小麥三雌蕊突變體(TP)與川麥28(Chuanmai 28,CM28)雜交后與CM28回交7代后獲得的三雌蕊小麥株系[22]。HTS-1是從TP與中國(guó)春(Chinese spring,CS)的雜交后代中篩選出的一個(gè)雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊的突變體,其雄蕊部分或完全轉(zhuǎn)變?yōu)榇迫?因此具有4～6個(gè)雌蕊。因此,HTS-1與CM28TP中均含有控制小麥三雌蕊性狀的關(guān)鍵基因Pis1。小麥進(jìn)入孕穗期后,分別取采集長(zhǎng)度為0.2～0.5 cm(二棱期至小花分化期),0.5～0.7 cm(雌雄蕊原基分化期)和0.7～1.0 cm(藥隔時(shí)期)的3個(gè)階段幼穗[23]。同時(shí)采集HTS-1的雌蕊(P)、雌蕊化雄蕊(PS)及CM28TP雄蕊(S)。將上述材料浸入RNA保存液(TaKaRa,中國(guó)大連)中,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA合成

利用LABGENETMplant RNA isolation Kit(蘭博基因,中國(guó)江蘇)分別提取HTS-1和CM28TP 3個(gè)階段的幼穗及P、PS、S的總RNA,具體提取方法參照生產(chǎn)商提供的說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NaroDrop 2000c微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度。以上述提取的RNA為模板,利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa,中國(guó)大連)參照說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并將得到的cDNA溶液置于-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Tappc3A的克隆測(cè)序

基于小麥TraesCS3A02G306700.1序列,利用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)Tappc3A擴(kuò)增引物(表1)。以HTS-1和CM28TP藥隔時(shí)期幼穗cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板,退火溫度56 ℃。將擴(kuò)增純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,最后涂布于含100 μg/mLAmp+的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。陽(yáng)性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,利用DNAMAN 9.0和Chromas對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 Tappc3A基因克隆、qRT-PCR及原核表達(dá)引物序列

1.4 Tappc3A氨基酸序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

獲得的cDNA序列利用NCBI在線軟件ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的分析,DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì);利用NCBI的蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(Conserved domain database,CDD,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和InterPro在線分析工具(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域及功能域;使用ExPasy(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)的親疏水性;采用NovoPro網(wǎng)站(https://www.novopro.cn/tools/)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);運(yùn)用NCBI的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索同源基因,使用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì),再使用MEGA 7.0軟件中的鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并進(jìn)行Bootstrap檢測(cè)。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

利用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)Tappc3A的qRT-PCR引物,引物序列如表1所示。以1.2中的cDNA作為模板,利用CFX 96 PCR儀(Bio-Rad,美國(guó)加州)進(jìn)行qRT-PCR,具體操作參照SsoFastTMEva Green Supermix(Bio-Rad,美國(guó)加州)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以小麥Actin基因作為內(nèi)參(GenBank ID:AB1811991)[20],利用2-ΔΔCt的方法計(jì)算各樣品中Tappc3A基因的相對(duì)表達(dá)量[24]。利用Graphpad軟件作圖。

1.6 重組表達(dá)載體pET-28a-Tappc3A的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)Tappc3A基因的ORF序列分別設(shè)計(jì)帶有EcoR Ⅰ(5′-G↑AATTC-3′)和HindⅢ(5′-A↑AGCTT-3′)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物(表1)。以1.3中克隆且測(cè)序正確的菌液為模板進(jìn)行菌落PCR,退火溫度61.5 ℃。利用EcoRⅠ和HindⅠ對(duì)擴(kuò)增回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,再利用T4DNA連接酶連接,獲得pET-28a-Tappc3A重組載體。利用熱激法將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,利用PCR和雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。最后將驗(yàn)證正確的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-Tappc3A轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,獲得的pET-28a-Tappc3A-BL21重組菌株在LB(含100 μg/mL Kan)液體培養(yǎng)基中,180 r/min,30 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)至OD值0.6左右加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑,30 ℃誘導(dǎo)5 h。12 000 r/min,4 ℃離心10 min收集菌液細(xì)胞。按照鈺博生物的大腸桿菌總蛋白提取試劑盒提取融合蛋白,通過(guò)冰浴超聲得到大腸桿菌總蛋白樣品。按照磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)操作,在340 nm測(cè)定NADH減少速率,從而計(jì)算PEPC酶活性。

1.7 挖掘與Tappc3A共表達(dá)的基因

利用中國(guó)春小麥(CS)及其近等基因系17種RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得TPM值,挖掘與Tappc3A共表達(dá)的基因[20]。這些共表達(dá)基因包括抽穗期和開(kāi)花期的旗葉,開(kāi)花早期和晚期的莖、根、雌蕊、雌蕊化雄蕊、雄蕊、子房,孕穗期的莖和穗,種子萌發(fā)期的胚芽鞘、胚、根尖以及幼苗期葉片。計(jì)算Tappc3A與其他基因之間表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)(PCCs)。將正相關(guān)的Pearson相關(guān)系數(shù)閾值設(shè)定為0.7[25]。利用agriGO(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php)對(duì)與Tappc3A共表達(dá)的基因進(jìn)行GO富集分析。利用bioinformatics在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO富集的氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tappc3A基因克隆及序列分析

以HTS-1和CM28TP藥隔時(shí)期幼穗cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板,克隆獲得一條約3 000 bp的單一條帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖1-A)。經(jīng)測(cè)序和比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)從HTS-1和CM28TP中克隆得到的目的基因序列完全一致。克隆得到的Tappc3A長(zhǎng)度為2 970 bp,開(kāi)放性閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為2 901 bp,編碼966個(gè)氨基酸殘基(圖1-B)。通過(guò)NCBI上的BlastN比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該基因序列與其他植物的PEPC基因序列具有77.14%～99.93%的相似性,其中與小麥中國(guó)春品種3A染色體上的PEPC基因(XM_044485447.1)具有99.93%的一致性,與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,XM_014898420.2)和酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa,XM_048471538.1)的PEPC基因分別具有89.77%和78.54%的一致性。因此,將該基因命名為T(mén)appc3A,并將該序列上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào):OP615936)。

運(yùn)用DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),目的基因與中國(guó)春(XP_044341382.1)、二穗短柄草(XP_014753906.1)、水稻(Oryzasativa,XP_015630901.1)、高粱(Sorghumbicolor,P15804.2)、黃花菊(Flaveriatrinervia,P30694.2)的氨基酸序列相似度分別為99.69%,91.54%,90.82%,73.17%,81.11%。比對(duì)結(jié)果顯示(圖2),Tappc3A基因編碼蛋白序列在N端具有保守的絲氨酸(Ser,S)可逆磷酸化位點(diǎn)(SIDAQLR),C端具有植物型PEPC蛋白特征序列(QNTG),氨基酸序列第774位是C3型PEPC的丙氨酸(Ala,A)而非高粱和黃花菊C4型PEPC的絲氨酸(Ser,S),表明小麥Tappc3A蛋白是植物型C3型PEPC。

2.2 Tappc3A蛋白的特征性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

在CDD數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)Tappc3A結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)該蛋白在氨基酸序列163—966位具有一個(gè)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPase)保守結(jié)構(gòu)域,屬于磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶超級(jí)家族成員(圖3-A)。進(jìn)一步分析顯示,在該結(jié)構(gòu)域中具有2個(gè)PEPase活性位點(diǎn),分別在氨基酸序列第168—179位(PS00781,VLTAHPTQSVRR)和第592—604位(PS00393,VMIGYSDSGKDAG),在這2個(gè)活性位點(diǎn)中分別含有與酶活性有關(guān)的氨基酸殘基賴氨酸(Lys,K)和組氨酸(His,H),同時(shí)具有7個(gè)保守的PEPcase亞催化結(jié)構(gòu)域(圖2)。該蛋白質(zhì)分子式C4917H7778N1356O1442S35,相對(duì)分子質(zhì)量為110.08 ku,理論等電點(diǎn)為6.02,不穩(wěn)定系數(shù)45.18,總平均親水性為-0.358,因此,該蛋白屬于酸性親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè),該蛋白含有62.84%的α-螺旋、4.35%的β-轉(zhuǎn)角、5.69%的延伸鏈和27.12%的無(wú)規(guī)則卷曲(圖3-B、C)。為了進(jìn)一步了解Tappc3A基因的生物學(xué)功能,采用MEGA 7.0軟件N-J構(gòu)建植物Tappc3A蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明,相同光合作用途徑且親緣關(guān)系近的物種首先聚為一類,Tappc3A基因氨基酸序列與烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)、大麥(Hordeumvulgare)等的親緣關(guān)系最近,同屬于C3型分支。

圖4 Tappc3A與其他植物PEPC的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 Tappc3A基因qRT-PCR分析

進(jìn)一步探討克隆得到的Tappc3A基因在CM28TP和HTS-1中的表達(dá)是否有差異,通過(guò)qRT-PCR對(duì)CM28TP和HTS-1 3個(gè)階段的幼穗及P、PS、S的表達(dá)量進(jìn)行分析(圖5)。結(jié)果顯示,Tappc3A基因在2種材料及P、PS、S中均有表達(dá),但各個(gè)時(shí)期及P、PS、S表達(dá)量有顯著差異。在CM28TP小穗中,Tappc3A的表達(dá)量在雌雄蕊原基分化期(0.5～0.7 cm)最高,其次是二棱期至小花分化期(0.2～0.5 cm),表達(dá)量最低的是藥隔時(shí)期(0.7～1.0 cm)。在HTS-1小穗中,Tappc3A的表達(dá)量在二棱期至小花分化期最高,雌雄蕊原基分化期和藥隔時(shí)期表達(dá)量相近。在二棱期至小花分化期和藥隔時(shí)期,HTS-1小穗中Tappc3A的表達(dá)量都要顯著高于CM28TP,而在雌雄蕊原基分化期無(wú)顯著差異。Tappc3A在P和PS中的表達(dá)量顯著高于S的表達(dá)量。

1.二棱期至小花分化期0.2～0.5 cm;2.雌雄蕊原基形成期0.5～0.7 cm;3.藥隔期0.7～1.0 cm;P.雌蕊;PS.雌蕊化雄蕊;S.雄蕊。不同字母的均值表示存在差異顯著(P<0.05)。圖6同。

2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及PEPC活性分析

構(gòu)建的pET-28a-Tappc3A重組質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切和電泳檢測(cè)后獲得2條帶,一條大小為5 300 bp左右(pET-28a載體),一條大小為2 900 bp左右(目的條帶),而未經(jīng)雙酶切的pET-28a-Tappc3A線性質(zhì)粒只有一條大小8 000 bp左右的條帶,條帶大小與預(yù)測(cè)的一致(圖6-A)。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致,證明重組質(zhì)粒pET-28a-Tappc3A構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,活化獲得pET-28a-Tappc3A-BL21重組菌株。對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化,pET-28a-Tappc3A-BL21在30 ℃、IPTG終濃度為0.2 mmol/L時(shí),誘導(dǎo)5 h后,Tappc3A蛋白表達(dá)量最大。表達(dá)菌液經(jīng)超聲破碎后取上清部分,測(cè)定融合蛋白中PEPC的活性。結(jié)果表明(圖6-B),pET-28a空載體組中是否添加IPTG對(duì)PEPC活性影響顯著,且酶活性均較低;與pET-28a空載組相比,pET-28a-Tappc3A組的PEPC活性增強(qiáng),加入IPTG誘導(dǎo)后,其酶活性進(jìn)一步得到顯著提升。原核表達(dá)分析證明,Tappc3A基因編碼的蛋白能催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸,并且在IPTG誘導(dǎo)后活性顯著增強(qiáng)。

A.重組質(zhì)粒 pET-28a-Tappc3A的雙酶切鑒定:M.Marker 15000;1.pET-28a-Tappc3A質(zhì)粒經(jīng) EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切;2.pET-28a-Tappc3A線性質(zhì)粒。B.PEPC活性測(cè)定:VC.對(duì)照組;3A.試驗(yàn)組。

2.5 與Tappc3A共表達(dá)的基因分析

為探究Tappc3A與其他調(diào)控花器官發(fā)育基因之間是否存在相互關(guān)系,從小麥RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出與Tappc3A共表達(dá)的基因。當(dāng)Pearson相關(guān)系數(shù)的閾值設(shè)定為0.7時(shí),從小麥17個(gè)RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到了11 862個(gè)基因,其中3 492個(gè)基因得到GO注釋信息,當(dāng)P<0.05時(shí)獲得674個(gè)富集顯著的GO term。在這些GO term 中有18個(gè)GO term 與花器官的發(fā)育與分化相關(guān)(圖7)。這些GO term主要包括:花器官形成、生殖芽系統(tǒng)發(fā)育、胚胎后器官形態(tài)發(fā)生、花器官形態(tài)發(fā)生、生殖過(guò)程的調(diào)節(jié)、單體生殖過(guò)程、生殖過(guò)程、花器官的發(fā)育、花器官特性的維持、器官特性的維持、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育、多細(xì)胞生物繁殖過(guò)程、分生組織營(yíng)養(yǎng)期到生殖期的轉(zhuǎn)變、器官形態(tài)發(fā)生、花輪發(fā)育、胚胎后器官發(fā)育和花器官特性規(guī)范等。這表明Tappc3A可能與這些基因一起調(diào)控了小麥花器官的發(fā)育。

顏色表示富集程度;大小表示基因數(shù)量。

3 結(jié)論與討論

在C3植物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)的主要作用是催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸(OAA)進(jìn)入三羧酸循環(huán),從而彌補(bǔ)三羧酸循環(huán)中消耗的中間產(chǎn)物[26-27]。此外,PEPC在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用,如果實(shí)的成熟、種子的萌發(fā)和發(fā)育、抗旱、抗鹽等[28-31]。到目前為止,除Igawa等[32]報(bào)道了細(xì)菌型PEPC基因可以加速花粉成熟過(guò)程中貯藏物質(zhì)的積累外,尚無(wú)關(guān)于PEPC參與植物器官發(fā)育的報(bào)道。Yamamoto等[20]研究表明,小麥Tappc3基因在雌蕊中表達(dá)量較高,因此,推測(cè)其與雌蕊的發(fā)育相關(guān)。本研究以小麥2個(gè)特有的雌蕊突變體CM28TP和HTS-1為試驗(yàn)材料克隆了一個(gè)PEPC家族基因Tappc3A,它是Tappc3位于3A染色體上的同源基因,該基因具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性位點(diǎn)和功能位點(diǎn),第774位氨基酸為C3植物PEPC典型的丙氨酸。聚類分析結(jié)果也表明,Tappc3A屬于C3型PEPC家族。原核表達(dá)分析結(jié)果表明,構(gòu)建pET-28a-Tappc3A重組質(zhì)粒在大腸桿菌中能表現(xiàn)出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性,且IPTG誘導(dǎo)后酶活性明顯增強(qiáng)。這表明本研究獲得了具有正常功能的Tappc3A基因。通過(guò)對(duì)P、PS和S的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析表明Tappc3A在P和PS中的表達(dá)量顯著高于S,因此,推測(cè)小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊可能與Tappc3的過(guò)量表達(dá)相關(guān)[21]。序列比對(duì)結(jié)果分析表明,在CM28TP和HTS-1中克隆得到Tappc3A基因ORF序列及推導(dǎo)氨基酸序列完全相同,這表明,雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊性狀不是Tappc3A基因序列的差異造成的,可能與其表達(dá)量有關(guān)。

前期研究表明,小麥PEPC基因在不同組織中的表達(dá)具有特異性,如Tappc1a基因在根和生殖器官中表達(dá)量較高。Tappc1b基因在幼苗期的葉片中高水平表達(dá)。Tappc2的表達(dá)具有普遍性,因此,可能是一個(gè)看家基因。Tappc3雌蕊等生殖器官中高水平表達(dá)。Tappc4在成熟葉片中表達(dá)量較高[20]。在蓖麻(Ricinuscommunis)中O′Leary等[29]也觀察到Rcppc3基因在雌蕊的珠被中的表達(dá)量高于雄蕊,因此,推測(cè)Rcppc3與雌蕊發(fā)育相關(guān)。本研究重點(diǎn)探討了Tappc3A在小麥幼穗、雌蕊(P)、雄蕊(S)以及雌蕊化的雄蕊(PS)中的表達(dá)情況。在幼穗發(fā)育的3個(gè)階段,除階段二(雌雄蕊原基分化期)外,HTS-1中的Tappc3A基因的表達(dá)量均高于CM28TP。尤其是在第三階段(藥隔形成期)HTS-1中的Tappc3A基因表達(dá)量約為CM28TP的2倍。在這個(gè)階段,雌雄蕊原基已完成分化,雄蕊突起由球狀變?yōu)橹鶢?且沿中部自頂向下出現(xiàn)微凹縱溝,同時(shí)雌蕊原基頂端凹陷分化出2枚柱頭原基。因此,在這個(gè)階段,雄蕊和雌蕊發(fā)育所需要的物質(zhì)具有較大的差異。而Tappc3A在雄蕊中的過(guò)量表達(dá)可能造成蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝混亂,從而導(dǎo)致雄蕊發(fā)育異常。已有研究表明,花藥和花粉發(fā)育過(guò)程中脂質(zhì)代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致花藥角質(zhì)層、花粉外壁和花藥亞細(xì)胞器膜的發(fā)育異常,從而引起細(xì)胞核雄性不育(GMS)[33]。Tappc3A基因在HTS-1的P、PS及CM28TP的S中的表達(dá)模式進(jìn)一步表明,該基因可能與雌蕊發(fā)育相關(guān),因?yàn)門(mén)appc3A在P和PS中的表達(dá)量顯著高于S,該結(jié)果也與之前的RNA-Seq結(jié)果一致[21]。共表達(dá)分析顯示,Tappc3A基因與花器官形成、花器官形態(tài)發(fā)生、花器官的發(fā)育、花器官特性的維持、器官形態(tài)發(fā)生、花輪發(fā)育和花器官特性規(guī)范等花器官的發(fā)育與分化相關(guān)基因共表達(dá),進(jìn)一步表明Tappc3A可能參與了小麥花器官的形態(tài)發(fā)生。此外,研究表明[34],基因表達(dá)模式的改變會(huì)導(dǎo)致小麥雄蕊心皮化。綜上所述,Tappc3A可能與小麥雌蕊發(fā)育相關(guān),其在雌蕊中的過(guò)量表達(dá)可能與HTS-1的雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊性狀形成有一定的關(guān)聯(lián)。本研究為進(jìn)一步闡明Tappc3A基因的功能及小麥雌蕊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

從小麥中克隆得到Tappc3A基因,該基因編碼966個(gè)氨基酸,具有典型的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性位點(diǎn)和功能位點(diǎn),是植物C3型PEPC。構(gòu)建的pET-28a-Tappc3A重組質(zhì)粒在大腸桿菌中能表現(xiàn)出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性,且IPTG誘導(dǎo)后酶活性顯著增強(qiáng),這表明Tappc3A基因具有正常的功能。在HTS-1幼穗發(fā)育的二棱期至小花分化期和藥隔時(shí)期,Tappc3A基因的表達(dá)水平都顯著高于CM28TP,且HTS-1的P和PS中的表達(dá)量顯著高于CM28TP中的S。共表達(dá)分析結(jié)果進(jìn)一步表明,Tappc3A可能參與了小麥花器官的形態(tài)發(fā)生。因此,推測(cè)Tappc3A可能參與小麥雌蕊發(fā)育,其在雄蕊中的過(guò)量表達(dá)可能與小麥雄蕊同源轉(zhuǎn)化為雌蕊性狀形成有一定的關(guān)聯(lián)。