聶利珍,張志成,謝 銳,常 悅,張瓊琳,韓平安,羿 靜

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)植物蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;3.烏蘭察布市農(nóng)林科學(xué)研究所,內(nèi)蒙古 集寧 012000)

花色苷是一種常見的水溶性植物色素,其結(jié)構(gòu)為花青素與糖類以糖苷鍵結(jié)合,存在于植物各器官的細(xì)胞液中,賦予其紅、紫或藍(lán)等五彩繽紛的顏色?；ㄉ帐侵参锎紊x過程中產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì),在花色苷合成途徑中,花色苷合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)位于花色苷生物合成途徑下游,催化無色花色苷轉(zhuǎn)化成有色的花色苷,在植物著色過程中起重要作用[1]。Menssen等[2]在1990年首先從玉米突變體中利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離得到ZmANS基因,之后陸續(xù)在紫蘇(Perillafrutescens)[3]、可可(Theobromacacao)[4]、草莓(Fragaria×ananassa)[5]等植物中分離出來ANS基因。進(jìn)一步的研究表明,將郁金香(Tulipagesneriana)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、茶葉(Camelliasinensis)、東方百合(Orientallily)、紫萼玉簪(Hostaventricosa)等植物的ANS基因進(jìn)行超量表達(dá),都能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的花色苷積累[6-10]。

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是全球第四大重要糧食作物,其營養(yǎng)豐富,除了具有基本的食用價值,還具有特殊的保健功效。馬鈴薯薯肉主要為白色和黃色,還具有紫、紅、黑等顏色的薯肉,這種具有彩色薯肉的馬鈴薯叫彩色馬鈴薯[11]。它除了含有馬鈴薯的營養(yǎng)成分之外,還含有豐富的花色苷[12]。近年來,馬鈴薯中參與花色苷生物合成的相關(guān)基因研究也取得了一定的進(jìn)展[13]。研究人員在馬鈴薯中過表達(dá)了3GT基因,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中的花色苷含量和塊莖顏色顯著提高[14]。已有的研究表明,StANS基因在彩色馬鈴薯中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯高于黃色馬鈴薯,在馬鈴薯中過表達(dá)StANS基因可以提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中花色苷的積累[15]。

盡管在許多植物中已克隆了ANS基因并進(jìn)行相關(guān)的研究,但彩色馬鈴薯中該基因的研究還鮮見報道。本研究根據(jù)彩色馬鈴薯薯肉的特性,克隆其ANS基因的cDNA序列,通過生物信息學(xué)分析其同源性及進(jìn)化特性,并將其過表達(dá)到擬南芥中進(jìn)行功能驗證,揭示ANS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)與花色苷積累的關(guān)系,以期為了解彩色馬鈴薯花色苷合成途徑中關(guān)鍵基因的功能奠定試驗基礎(chǔ),同時也為彩色馬鈴薯的分子育種提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

彩色馬鈴薯品種紅美塊莖作為基因克隆的試驗材料;野生型擬南芥Columbia 生態(tài)型(Col-0)種子作為轉(zhuǎn)基因受體材料。

1.2 設(shè)計基因的特異引物

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道馬鈴薯StANS基因(NM_001287930)的cDNA序列,通過Primer 5設(shè)計基因的特異引物如下:

ANS-F:5′-TGGTGAGTGAAGTGGTTCCAA-3′;ANS-R :5′-ACAGGAACATGTTTGAGGACT-3′。ANS-ORF-F:5′-CACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGTGAGTGAAGTGGTTCCAATTC-3′;ANS-ORF-R:5′-ACCATGGTGTCGACTCTAGATTTAGATTCTTTAGCAGGAACATCCTTGA-3′。

1.3 彩色馬鈴薯塊莖總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

選用塊莖的薯皮和薯肉作為試驗材料,提取其總RNA,具體詳細(xì)的提取方法見參考文獻(xiàn)[11]和[16]的試驗方法。吸取1 μL 總RNA樣品作為反轉(zhuǎn)錄模板,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物)的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,獲得塊莖的cDNA樣品,以此cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 彩色馬鈴薯花色苷合成酶基因PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,利用ANS-F/R作為特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,56 ℃ 10 s,72 ℃ 1 min,40個循環(huán);72 ℃ 10 min。電泳檢測結(jié)果,利用純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.5 ANS基因的連接及測序

將純化回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體(T載體)進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1。過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證,驗證正確后選取陽性菌液測序。

用上述質(zhì)粒作為模板,ANS-ORF-F/R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序同上,純化回收PCR產(chǎn)物,連接T載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,獲得T-ANS質(zhì)粒。

1.6 ANS基因的生物信息學(xué)分析

利用BlastN對ANS基因序列進(jìn)行比對分析;根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的馬鈴薯StANS(NM_001287930)和其他植物基因序列,利用DNAMAN 10軟件對克隆基因進(jìn)行氨基酸序列及多序列相似性比對;利用ExPASy Prot Param tool軟件在線預(yù)測克隆基因的理化特性;根據(jù)MEGA 7.0.26軟件對多種物種來源的ANS序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[11]。

1.7 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pCAM35S-GFP和T-ANS載體,分別回收大片段和目的片段;然后利用T4DNA連接酶(NEB,美國)連接,連接產(chǎn)物通過凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定,鑒定正確即完成了植物表達(dá)載體的構(gòu)建。采用凍融法將StANS1a基因?qū)朕r(nóng)桿菌GV3101,通過菌落PCR鑒定陽性菌落,驗證正確后挑選陽性菌落搖菌,菌液-20 ℃保存?zhèn)溆?用于侵染擬南芥。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

在EP管中裝入擬南芥種子,用70%的乙醇消毒2～3 min,再用10%次氯酸鈉消毒10 min,用無菌水洗4～5次,點種在1/2 MS培養(yǎng)基上,4 ℃黑暗條件下春化3 d,然后置于16 h光照/8 h黑暗光周期、40～60 μmol/(m2·s)、18 ℃、濕度為70%條件下培養(yǎng)。10 d后,選擇生長健壯的幼苗移栽到培養(yǎng)土中。當(dāng)幼苗生長14 d左右抽薹時進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化前將已經(jīng)開放的花和種子剪除干凈。將冷凍保存的農(nóng)桿菌菌液活化培養(yǎng)后,重懸于滲透緩沖液中,調(diào)節(jié)菌液濃度OD600=0.4～0.6,將擬南芥花器浸入農(nóng)桿菌懸浮液30 s,繼續(xù)生長約30 d收獲種子。通過含有潮霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因植株和純合植株。

1.9 花色苷含量測定

根據(jù)Laby等[17]的方法進(jìn)行花色苷含量的測定。每個樣品都選用14 d左右的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株3棵,稱質(zhì)量后加入99∶1甲醇∶HCl(V/V)提取液,混合均勻,4 ℃提取16 h,其間每隔5～6 h顛倒混勻1次。處理結(jié)束后,4 ℃條件下,12 000 r/min 離心10 min,吸取上清液至新的離心管?；ㄉ詹捎梅止夤舛扔嬤M(jìn)行檢測,每個樣品分別讀取530,657 nm下的吸光值進(jìn)行測量,每個樣品3 次生物學(xué)重復(fù)。使用以下公式確定相對花色苷水平:花色苷的相對單位/新鮮組織的質(zhì)量=(OD530-(0.25×OD657))×提取體積(mL)×1/組織樣品的質(zhì)量(g)。

1.10 RT-PCR檢測

分別提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物)操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板,進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測。PCR擴(kuò)增的引物分別為:擴(kuò)增StANS1a基因的特異引物為StANS1a-RT-F-5′-ATGGTGAGTGAAGTGGTTCCA-3′和StANS1a-RT-R-5′-AAGTCTTCCATGCCTCCAAC-3′,擴(kuò)增片段跨StANS1a基因內(nèi)含子,擴(kuò)增cDNA片段長度為659 bp。擬南芥內(nèi)參基因引物為Atactin-F-5′-CGGAAAACAAGGTGAGCCGA-3′和Atactin-R-5′-GATTTGAGTCATCTTCTCACG-3′,擴(kuò)增cDNA片段長度為555 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩色馬鈴薯ANS基因的RT-PCR 擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄獲得的彩色馬鈴薯cDNA為模板,利用ANS-F/R作為引物,擴(kuò)增獲得長度約1 500 bp 的特異性條帶(圖1-A)。PCR產(chǎn)物回收純化后連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對挑取的單克隆進(jìn)行菌液PCR驗證,其結(jié)果見圖1-B。將PCR 驗證為陽性的菌液送公司測序,結(jié)果顯示,所得cDNA片段長度為1 406 bp(圖2-A),通過比對分析其包含一個1 368 bp完整的開放閱讀框,編碼 455個氨基酸殘基 (圖2-B)。

M.DNA Marker DL3000; A.StANS1a基因克隆; B.PCR驗證陽性菌落; 1—16.隨機(jī)菌落。

A.StANS1a基因cDNA序列;B.StANS1a氨基酸序列;4～228.多肽鏈N端。

Blast比對后發(fā)現(xiàn),該序列與馬鈴薯StANS(NM_001287930)基因序列相似度達(dá)到84.60%(圖3-A),而開放閱讀框相似度為97.59%,氨基酸相似度為95.82%(圖3-B),通過對其氨基酸序列編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域比對,發(fā)現(xiàn)堿基改變未引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域改變,并且具有保守的結(jié)構(gòu)域DIOX_N和2OG_FeⅡ_Oxy,分別位于氨基酸序列的第52～166位和第215～312位(圖2-B)。表明克隆得到的序列為馬鈴薯StANS基因序列,命名為StANS1a(GenBank:ON512347)。

2.2 StANS1a理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam tool 軟件分析StANS1a氨基酸的理化性質(zhì),結(jié)果顯示,StANS1a 蛋白質(zhì)是由455 個氨基酸殘基組成的,分子式為C2292H3633N607O696S13,原子總數(shù)為7 241個,分子質(zhì)量約為51.25 ku,其中帶正、負(fù)電荷的氨基酸殘基分別有63,81 個,理論等電點(pI)是5.32,不穩(wěn)定系數(shù)44.45,平均親水系數(shù)-0.496,表明StANS1a蛋白屬于親水性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(圖4)。

2.3 StANS1a蛋白質(zhì)的相似性比對分析

根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫中其他植物ANS的氨基酸序列,利用DNAMAN 10軟件分析以下幾種植物的ANS氨基酸序列的相似性,如馬鈴薯StANS (Solanumtuberosum,NM_001287930)、番茄SlANS(Solanumlycopersicum,NP_001361323.1)、茄子SmANS(Solanummelongena,ACJ02088.1)、辣椒CaANS(Capsicumannuum,PHT92526.1)、煙草NtANS(Nicotianatabacum,AWL24853.1)、擬南芥AtANS(Arabidopsisthaliana,NP_001031700.1)、蘋果MdCHS(Malusdomestica,RXI03704.1)、大豆GmANS3(Glycinemax,NP_001240884.1)、黑果枸杞(Lyciumruthenicum,QFR04941.1)、澳洲棉(Gossypiumaustrale,KAA3469013.1)、葡萄(Vitisvinifera,ABV82967.1)、胡桃(Juglansregia,XP_018847204.1)、可可(Theobromacacao,XP_007040068.2)、榴蓮(Duriozibethinus,XP_022736758.1)、阿月渾子(Pistaciavera,XP_031284664.1)、覆盆子(Rubusidaeus,AXY97021.1)。由圖5可知,StANS1a基因在氨基酸水平與StANS和番茄SlANS相似性達(dá)到98%,而與茄子SmANS、辣椒CaANS、煙草NtANS、擬南芥AtANS、蘋果MdANS和大豆GmANS3等氨基酸序列的相似性也都超過了80%,它們在氨基酸水平具有很高的相似性,揭示了在植物中ANS基因的氨基酸序列具有極強(qiáng)的保守性,也可能說明了不同植物ANS蛋白質(zhì)功能具有較高的相似性。

圖5 StANS1a與其他植物ANS氨基酸序列相似性的比對分析

2.4 構(gòu)建StANS1a蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析,選用與StANS1a氨基酸序列同源性較高的其他植物ANS的氨基酸序列,分別為馬鈴薯(NM_001287930)、番茄(NP_001361323.1)、茄子(ACJ02088.1)、辣椒(PHT92526.1)、煙草(AWL24853.1)、黑果枸杞(QFR04941.1)、澳洲棉(KAA3469013.1)、葡萄(ABV82967.1)、胡桃(XP_018847204.1)、可可(XP_007040068.2)、榴蓮(XP_022736758.1)、蘋果(RXI03704.1)、阿月渾子(XP_031284664.1)、覆盆子(AXY97021.1)和擬南芥(NP_001031700.1)。利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,由圖6可知,在初級聚類中,首先聚合成2大分支,其中StANS1a與同為茄科的馬鈴薯、番茄、茄子聚在同一個分支,其親緣關(guān)系較近;其他的聚為另一個分支,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),進(jìn)化樹的構(gòu)建也反映了一些物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

各節(jié)點處數(shù)字表示bootstrap 值(重復(fù)1 000 次)。

2.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

用KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pCAM35S-GFP(圖7-A)和克隆載體T-StANS1a,分別回收大片段和小片段,將所得大片段與酶切所得的StANS1a基因的cDNA小片段用同源重組連接酶重組連接,轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR驗證,載體測序驗證,構(gòu)建好的植物表達(dá)載體見圖7-B,最后將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,菌落PCR驗證陽性菌落(圖7-C),證實彩色馬鈴薯StANS1a基因已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

A.酶切pCAM35S-GFP和T-StANS1a載體;B.構(gòu)建的植物表達(dá)載體圖譜;C.菌落PCR驗證StANS1a;1—5.隨機(jī)單菌落。

2.6 StANS1a基因轉(zhuǎn)化擬南芥

將含有StANS1a基因的植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥中,將收獲的種子種植于含有潮霉素的培養(yǎng)基中,利用轉(zhuǎn)基因種子帶有抗性基因,在含有潮霉素的培養(yǎng)基中仍然能正常生長,而非轉(zhuǎn)基因種子不能生長而死亡,來篩選轉(zhuǎn)基因植株。通過篩選獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥T3純合種子。

2.7 轉(zhuǎn)基因植株中StANS1a的相對定量分析

為了驗證轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中StANS1a基因的轉(zhuǎn)錄水平,隨機(jī)挑選7個轉(zhuǎn)基因植株,利用StANS1a的特異引物StANS1a-RT-F/R,以擬南芥的Atactin基因作為內(nèi)參基因,通過RT-PCR檢測StANS1a在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)。由圖8可知,7株轉(zhuǎn)基因植株中都有StANS1a基因的表達(dá),只是表達(dá)量稍有不同。

圖8 轉(zhuǎn)基因株系RT-PCR分析

2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥中花色苷含量的測定

為了驗證StANS1a基因參與花色苷的積累,本研究測定了不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中花色苷的含量,由圖9可知,部分轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)花色苷含量與非轉(zhuǎn)基因擬南芥相比有顯著差異(P<0.05),最高T2比非轉(zhuǎn)基因擬南芥高54.61%;其次為T3,比非轉(zhuǎn)基因擬南芥高51.63%;T4比非轉(zhuǎn)基因擬南芥高40.24%;T7比非轉(zhuǎn)基因擬南芥高36.39%;T1比非轉(zhuǎn)基因擬南芥高28.76%;最低為T5,比非轉(zhuǎn)基因擬南芥略高2.17%。

不同的字母代表轉(zhuǎn)基因擬南芥與Wt 的差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

花色苷是植物黃酮類化合物中最大的一類,在許多植物中主要呈現(xiàn)紅色和藍(lán)色[18]。花色苷在合成過程中需要多種酶的參與,如ANS、DFR、F3′5′H和3GT等[14,19-20]。其中ANS 是花色苷生物合成途徑末端的關(guān)鍵酶,對植物的成色起著關(guān)鍵作用,是其生物合成途徑中重要的結(jié)構(gòu)基因[21]。本研究從彩色馬鈴薯塊莖中克隆到1個包含1 368 bp的完整開放閱讀框,編碼 455個氨基酸殘基的花色苷合成酶基因的cDNA序列。分析比對后發(fā)現(xiàn),該序列部分堿基發(fā)生改變,但與StANS序列相比蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域未發(fā)生變化,具有ANS保守的結(jié)構(gòu)域DIOX_N和2OG_FeⅡ_Oxy,這些 ANS 的保守結(jié)構(gòu)域與其他植物是一致的[22]。進(jìn)化分析表明,StANS1a與同為茄科的馬鈴薯、番茄和茄子處在同一分支,親緣關(guān)系最近,與蘋果和擬南芥等親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這與植物學(xué)傳統(tǒng)分類一致。本研究構(gòu)建了StANS1a過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)基因株系中StANS1a基因的轉(zhuǎn)錄水平較非轉(zhuǎn)基因植株有了明顯提高,這與楊成龍等[9]將東方百合ANS轉(zhuǎn)入擬南芥,轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)NS基因的表達(dá)量顯著上升的結(jié)果是一致的。轉(zhuǎn)基因植株花色苷含量比非轉(zhuǎn)基因植株中高2.17%～54.61%,這些結(jié)果證實StANS1a基因具有花色苷合成酶的功能,且促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因擬南芥中花色苷含量的積累,這與ANS基因在草莓和蘋果中的結(jié)果是一致的[5,23]。

對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察,轉(zhuǎn)基因擬南芥在幼苗期未出現(xiàn)明顯的表型變化,推測可能有兩方面的原因,一是轉(zhuǎn)基因株系中StANS1a在苗期表達(dá)量低,形成的花色苷含量也低,不足以在表型上體現(xiàn)出來;二是在擬南芥顏色形成的過程中,StANS1a基因可能并不是擬南芥成色的主效基因,只是催化無色花色苷變成有色花色苷,具體的原因還有待于進(jìn)一步的深入研究。本研究也證實了過表達(dá)單一的StANS1a基因并不能引起擬南芥幼苗植株顏色的變化,只能改變擬南芥幼苗體內(nèi)花色苷的積累量,說明ANS基因在植物花色苷形成過程中起了關(guān)鍵作用。綜上所述,彩色馬鈴薯StANS1a基因在花色苷代謝途徑中起著重要作用,為后續(xù)利用該基因?qū)︸R鈴薯的分子改良提供了基因資源。