徐慧穎,丁奕輝,董 昊,趙雪岑,柏 陽(yáng),才 謙

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,大連 116600

脾虛屬臟腑辯證中常見(jiàn)之證型,通常表現(xiàn)為消瘦、食欲不振、胃脘痛、脹氣、乏力、面色萎蔫、便溏等。脾虛表明機(jī)體處于低能量代謝狀態(tài),尤其與胃腸功能障礙有關(guān)[1]。值得關(guān)注的是,線粒體是機(jī)體胃腸蠕動(dòng)的重要能量來(lái)源,通過(guò)氧化磷酸化以ATP的形式產(chǎn)生能量,是“脾主運(yùn)化”的重要環(huán)節(jié)[2]。氧化損傷、營(yíng)養(yǎng)缺乏等外界刺激易導(dǎo)致線粒體損傷,對(duì)此,宿主細(xì)胞可啟動(dòng)自噬機(jī)制清除損傷的線粒體,維持細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)態(tài)[3]。如自噬功能受損不能及時(shí)清除損傷的線粒體,可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn),脾虛動(dòng)物骨骼肌、神經(jīng)、肝臟、心肌等細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)線粒體自噬異常[4,5]。

蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.) DC為菊科多年生草本植物,具有燥濕健脾之功效。《中國(guó)藥典》規(guī)定其基源為菊科植物茅蒼術(shù)或北蒼術(shù)的根莖[6]。茅蒼術(shù)野生資源主要分布于湖北、安徽宣城、江西武寧和陜西漢中等地區(qū),北蒼術(shù)野生資源主要分布東北、內(nèi)蒙、河北等地區(qū)。傳統(tǒng)認(rèn)為江蘇茅山地區(qū)的蒼術(shù)質(zhì)量最好,為道地藥材。在泰國(guó)、日本等許多國(guó)家,蒼術(shù)也常用來(lái)治療消化系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明,蒼術(shù)可以調(diào)節(jié)大鼠血清中胃腸激素水平[7];蒼術(shù)提取物對(duì)胃癌細(xì)胞(bgc-823和sgc-7901)[8]與幽門螺桿菌的生長(zhǎng)[9]均有抑制作用。蒼術(shù)含有多種類型的化學(xué)成分,分別為揮發(fā)油、多糖、苷類和低極性非揮發(fā)物質(zhì)。課題組之前研究發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)多糖與正丁醇部位(苷類)對(duì)脾虛具有治療作用[10,11],本實(shí)驗(yàn)是在此基礎(chǔ)上,首次從線粒體自噬的角度對(duì)蒼術(shù)有效部位調(diào)節(jié)脾虛的作用機(jī)制進(jìn)行探究,旨在為蒼術(shù)的合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與制備

生茅蒼術(shù)采自于湖北羅田中藥種植基地(非道地藥材),番瀉葉購(gòu)自海王星辰藥店(生產(chǎn)批號(hào):20210801),經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研組許亮教授鑒定分別為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.) DC.根莖、豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl的干燥小葉。

1.1.1 麩炒蒼術(shù)正丁醇萃取物的制備

取麩炒茅蒼術(shù)(根據(jù)中國(guó)藥典記載方法炮制),粉碎后過(guò)60目篩。稱取一定量粉末加8倍量溫水浸泡1 h,80 ℃提取3 h,提取出揮發(fā)油,提取液過(guò)濾,濾液減壓濃縮作為水提液。藥渣加入8倍量70%的乙醇再次提取3 h,過(guò)濾,濾液減壓濃縮作為醇提液。合并上述水提液與醇提液,依次用二氯甲烷、正丁醇萃取3次,回收正丁醇溶劑得到麩炒蒼術(shù)正丁醇萃取物,收率為3.2%。

1.1.2 麩炒蒼術(shù)多糖的制備

將上述萃取后的剩余液加入4.2倍量的95%乙醇,靜置12 h,過(guò)濾得沉淀,沉淀冷凍干燥,得麩炒蒼術(shù)粗多糖,收率為20%。

1.1.3 藥液的配置

根據(jù)課題組前期研究結(jié)果,蒼術(shù)在0.945 mg/g劑量下對(duì)脾虛大鼠有治療作用,本次試驗(yàn)選取0.945 mg/g劑量進(jìn)行研究。結(jié)合收率將正丁醇萃取物加入0.5%羧甲基纖維素鈉配制成0.012 g/mL的藥液,折合生藥量0.378 g/mL。結(jié)合收率將多糖加入蒸餾水配制成0.075 6 g/mL的藥液,折合生藥量0.378 g/mL。

1.1.4 番瀉葉水煎液的制備

稱取適量番瀉葉,加10倍量水,大火燒開(kāi)后再改小火煎煮30 min,過(guò)濾,濾液小火濃縮至含生藥0.125 g/mL的水煎液。

1.2 主要試劑及儀器

ATP檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A095-1-1);BCA總蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A045-4-2);H2O2檢測(cè)試劑盒(上海Beyotime 生物公司,貨號(hào):S0038);JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(上海 Beyotime 生物公司,貨號(hào):C2006);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)Thermo公司,貨號(hào):#K1622);ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(武漢百仟度生物科技有限公司,貨號(hào):Ba1059);PINK1抗體(美國(guó)Affinity公司,貨號(hào):DF7742);Parkin抗體(美國(guó)CST公司,貨號(hào):2132s);p62抗體(美國(guó)CST公司,貨號(hào):23214S);LC3B抗體(美國(guó) Abcam公司,貨號(hào):ab192890);β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司,貨號(hào):ab227387);山羊抗兔Ⅱ抗、山羊抗小鼠Ⅱ抗(美國(guó) KPL公司,貨號(hào)分別為:074-1506、074-1806)。

HT7700型透射電子顯微鏡(日本hitachi公司);754紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司);SpectraMax Gemini XPS型熒光酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司);熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療器械有限公司);TGL-16型冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);L4158型掃描儀(EPSON公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

60只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±10)g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司(合格證號(hào):SCXK-遼-2021-0004)。室溫:20～23 ℃,相對(duì)濕度:45%～55%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,復(fù)制脾虛動(dòng)物模型。本研究方案通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核(2019YS-DW-028-01)。

60只大鼠隨機(jī)分為空白組(control group,Con)、模型組(model group,Mod)、麩炒蒼術(shù)多糖組(FD)、麩炒蒼術(shù)正丁醇部位組(FZ)、生蒼術(shù)多糖組(SD)、生蒼術(shù)正丁醇部位組(SZ)。除空白組外,均采用飲食不節(jié)、疲勞過(guò)度加苦寒瀉下的復(fù)合因素法復(fù)制脾虛大鼠模型。方法如下:第1～14 d,單日灌胃豬油,劑量為:10 mL/(kg·d),給予飼料喂養(yǎng);雙日游泳,游至耐力極限,并喂飼甘藍(lán)不給予飼料。第15～21 d,灌胃給予苦寒傷脾藥物番瀉葉的水煎液,劑量為:10 mL/(kg·d)。第22～28 d,FD、FZ、SD、SZ分別灌胃藥液劑量為:10 mL/(kg·d)。給藥期間,空白組和模型組給予相同體積的0.9% NaCl溶液。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 取材

末次給藥24 h后,各組大鼠采取吸入式麻醉并剖開(kāi)腹腔,冰上剪取胃竇組織,放入預(yù)冷的生理鹽水中洗去血液,部分冰上切成約1 mm3小塊,迅速投入2.5%戊二醛4 ℃固定,用于線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察;部分分裝后-80 ℃凍存用于其他檢測(cè)。

1.4.2 線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察

取戊二醛中固定的胃竇組織,磷酸鹽緩沖液漂洗,1%的鋨酸再固定,之后進(jìn)行乙醇、丙酮梯度脫水,經(jīng)浸透、包埋、超薄切片(60～80 nm)、鈾鉛雙染色后,透射電鏡下觀察胃竇組織線粒體超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3 ATP水平測(cè)定

取凍存胃竇組織加入煮沸雙蒸水充分勻漿,沸水浴10 min后離心取上清液待測(cè)。按照BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,取待測(cè)樣品置于96孔板,加入BCA工作液,37 ℃孵育30 min后,使用酶標(biāo)儀測(cè)定A562 nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的蛋白濃度。

按照ATP試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管及對(duì)照管,空白管和標(biāo)準(zhǔn)管分別加入30 μL標(biāo)準(zhǔn)液,對(duì)照管和測(cè)定管分別加入30 μL待測(cè)樣本,分別加入不同反應(yīng)劑,反應(yīng)結(jié)束后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各管OD值(636 nm)。按照如下公式計(jì)算樣品的ATP濃度。

ATP濃度=

(OD測(cè)定-OD對(duì)照)/(OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白)×A×N/C

式中,A:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,N:測(cè)定樣本稀釋倍數(shù),C:樣品蛋白濃度。

1.4.4 H2O2水平測(cè)定

取凍存胃竇組織加入H2O2檢測(cè)裂解液,充分勻漿,離心取上清。吸取上清與H2O2檢測(cè)試劑置于96孔板內(nèi),輕輕振蕩使溶液混勻,室溫放置30 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定A560 nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中H2O2的濃度。同時(shí),采用BCA試劑盒測(cè)定勻漿液中的蛋白濃度,并用蛋白濃度校正H2O2濃度。蛋白濃度測(cè)定方法同“1.4.3”。

1.4.5 線粒體膜電位水平(MMP)測(cè)定

按照線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,取凍存胃竇組織加入Lysis Buffer,冰上研磨組織20余次得到勻漿混懸液,低速離心取上清,再高速離心取沉淀,所得的沉淀即為線粒體粗提物,加入Wash Buffer對(duì)線粒體粗提物進(jìn)行洗滌,離心后取線粒體沉淀置于Store Buffer中重懸,即得到純化的線粒體。

按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,將純化的線粒體與JC-1緩沖液混合后使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。紅色熒光和綠色熒光分別代表正常線粒體和去極化線粒體。以紅色熒光/綠色熒光的比值表示MMP。

1.4.6 RT-PCR法檢測(cè)PINK1、Parkin、p62、LC3 mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法提取各組大鼠胃竇組織總RNA,使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成RNA樣品的第一鏈cDNA,并用PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析采用Trizol法提取各組大鼠胃竇組織總RNA,使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成RNA樣品的第一鏈cDNA,并用PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析。PCR反應(yīng)體系:2(SYBR Gree qPCR Master Mix 5 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA 2 μL,滅菌去離子水2.6 μL,共10 μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性(95 ℃ 300 min),40次循環(huán)(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s),溶解曲線(65～105 ℃)。

所有引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成,結(jié)果用2-△△Ct方法進(jìn)行分析,各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.7 Western blot法檢測(cè)PINK1、Parkin、p62、LC3蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解緩沖液提取各組大鼠胃竇組織中總蛋白,并通過(guò)BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5%脫脂牛奶在0.1% TBST中封閉1 h,洗膜,加入一抗PINK1(1∶2 500)、Parkin(1∶1 000)、LC3B(1∶2 500)、p62(1∶2 500)、β-actin(1∶6 000),4 ℃孵育過(guò)夜,加入二抗(1∶50 000)室溫孵育1 h。采用ECL試劑盒檢測(cè)條帶,并用ImageJ分析目標(biāo)條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)

空白組大鼠體格、活動(dòng)、飲食與大便均正常;造模后各組大鼠體格消瘦,反應(yīng)遲鈍,大便溏泄,被毛蓬起枯槁無(wú)光澤,弓背,神態(tài)萎靡,蜷縮聚堆等,造模后的大鼠行為狀態(tài)如圖1所示。參考中醫(yī)脾虛臨床癥狀及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)脾虛模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為造模成功[12]。經(jīng)麩炒多糖、麩炒正丁醇部位、生多糖、生正丁醇部位給藥干預(yù)后,造模大鼠癥狀逐漸正常。

2.2 線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

空白組大鼠胃竇組織線粒體形態(tài)規(guī)則完整,自噬溶酶體個(gè)別存在。模型組大鼠線粒體腫脹,形狀不規(guī)則,嵴減少,未見(jiàn)典型自噬結(jié)構(gòu),提示脾虛導(dǎo)致胃竇組織線粒體損傷與自噬功能障礙。經(jīng)麩炒蒼術(shù)多糖、麩炒蒼術(shù)正丁醇部位、生蒼術(shù)多糖給藥治療后,線粒體結(jié)構(gòu)損傷分別呈不同程度改善,且自噬溶酶體數(shù)量明顯增加。生蒼術(shù)正丁醇部位給藥治療后線粒體結(jié)構(gòu)損傷未見(jiàn)改善,線粒體腫脹明顯、膜內(nèi)基質(zhì)局部溶解,嵴減少、消失,自噬溶酶體少量存在(見(jiàn)圖2)。

2.3 線粒體基本功能的變化

與空白組比較,模型組大鼠胃竇組織ATP與MMP水平明顯下降(P<0.001),H2O2水平上升(P<0.001)。經(jīng)麩炒蒼術(shù)多糖、麩炒蒼術(shù)正丁醇部位、生蒼術(shù)多糖、生蒼術(shù)正丁醇部位給藥后均能顯著逆轉(zhuǎn)脾虛模型所致的ATP、MMP、H2O2水平的異常變化。其中,麩炒蒼術(shù)多糖對(duì)ATP、MMP、H2O2的改善效果優(yōu)于生蒼術(shù)多糖(P<0.05),麩炒蒼術(shù)正丁醇部位對(duì)H2O2的改善效果優(yōu)于生蒼術(shù)正丁醇部位(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

2.4 線粒體自噬水平的變化

與空白組相比,模型組PINK1、Parkin、p62 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.001)。蛋白結(jié)果與mRNA基本一致,模型組PINK1、Parkin、p62蛋白增加,LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化減少,LC3II/I表達(dá)顯著降低(P<0.001,P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,麩炒蒼術(shù)多糖、麩炒蒼術(shù)正丁醇部位、生蒼術(shù)多糖、生蒼術(shù)正丁醇部位給藥后上述變化明顯減輕,PINK1、Parkin、p62 mRNA與蛋白表達(dá)均下調(diào),LC3II、LC3II/I蛋白表達(dá)升高(P<0.001,P<0.01,P<0.05),其中,麩炒后蒼術(shù)多糖與正丁醇部位對(duì)以上指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于生品(P<0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖4 各組大鼠胃竇組織線粒體自噬水平的變化Fig.4 Changes of mitophagy level in gastric antrum of rats in each

3 討論與結(jié)論

脾虛的臨床診斷一般是依據(jù)癥狀,脾虛病人常會(huì)表現(xiàn)食欲減退,脘腹隱痛,倦怠乏力,畏寒肢冷等癥狀。食欲減退在脾虛動(dòng)物中表現(xiàn)為體重下降;脘腹隱痛會(huì)表現(xiàn)為弓背;倦怠無(wú)力則表現(xiàn)為神態(tài)萎靡和易疲勞;畏寒則會(huì)表現(xiàn)為扎堆蜷縮。本實(shí)驗(yàn)中,造模后大鼠消瘦,弓背,神態(tài)萎靡以及蜷縮聚堆,這些外觀行為變化證明了所建立的脾虛大鼠模型是成功的。

線粒體自噬調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,多種信號(hào)通路可介導(dǎo)不同種類的自噬過(guò)程,PINK1/Parkin通路是線粒體最常見(jiàn)、研究最為成熟的自噬信號(hào)通路。PINK1在健康的線粒體中通常是檢測(cè)不到的,因?yàn)镻INK1進(jìn)入線粒體后被膜內(nèi)水解酶(Parl)切割,隨后被清除[13]。如圖5所示,當(dāng)線粒體受損時(shí),由于內(nèi)膜電位降低,PINK1進(jìn)入線粒體路徑被阻斷,不斷聚集在線粒體外膜并將parkin募集至受損線粒體[14]。Parkin是一種E3泛素蛋白連接酶,被PINK1激活后能夠泛素化受損的線粒體膜蛋白,并被選擇性自噬接頭蛋白p62所識(shí)別[15],再與自噬體膜上的自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)連接,啟動(dòng)自噬,最終降解受損的線粒體[16]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組PINK1和Parkin mRNA與蛋白顯著增加,表明存在受損的線粒體,PINK1/Parkin通路已經(jīng)激活,但可能由于自噬功能障礙,受損的線粒體未能被自噬降解。生、麩蒼術(shù)多糖與正丁醇部位治療后各組大鼠PINK1和Parkin mRNA與蛋白水平降低,表明一些受損的線粒體已被自噬降解清除。

圖5 線粒體自噬機(jī)制圖Fig.5 The mechanism of PINK1/Parkin-mediated mitophagy

線粒體自噬受眾多自噬相關(guān)蛋白嚴(yán)密調(diào)控,因此某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)常用來(lái)判定自噬的強(qiáng)弱,其中較為關(guān)鍵的是LC3和p62等。未發(fā)生自噬時(shí),大多數(shù)LC3以LC3I的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),LC3Ⅰ會(huì)經(jīng)泛素化修飾與自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成位于自噬體膜表面的LC3Ⅱ[17],因此,LC3II的出現(xiàn)常作為自噬發(fā)生的重要標(biāo)志[18]。作為一種關(guān)鍵的選擇性自噬適配蛋白,p62可與LC3II結(jié)合并作為選擇性自噬的底物[19]。當(dāng)溶酶體與自噬體處于結(jié)合階段時(shí),p62可作為溶酶體的供體,引導(dǎo)自噬體與之結(jié)合,形成自噬溶酶體,最后底物被溶酶體內(nèi)的蛋白水解酶降解,p62隨即被一同降解[20],自噬的發(fā)生通常伴隨著p62的減少。本研究觀察到,模型組LC3II蛋白表達(dá)和LC3II/I比值均顯著低于空白組,表明脾虛時(shí)胃竇組織細(xì)胞內(nèi)的自噬體形成受限。p62 mRNA與蛋白水平上升,提示自噬活性受到抑制。經(jīng)生、麩蒼術(shù)多糖與正丁醇部位給藥后各組大鼠LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化增強(qiáng),p62mRNA與蛋白水平下降,提示自噬水平上升。透射電鏡結(jié)果與之對(duì)應(yīng),模型組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)損傷較重,未見(jiàn)自噬結(jié)構(gòu),表明自噬功能受損可能導(dǎo)致了受損線粒體的積累。給藥后各組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)損傷減輕,自噬溶酶體數(shù)量增多。因此,我們認(rèn)為脾虛導(dǎo)致大鼠胃竇組織線粒體自噬功能受損,而生、麩蒼術(shù)多糖與正丁醇部位給藥后促進(jìn)了自噬的發(fā)生。

線粒體自噬受阻通常伴隨著活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的產(chǎn)生,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高將誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[21]。氧化應(yīng)激攻擊線粒體膜,導(dǎo)致膜電位降低、線粒體損傷和功能障礙[22],進(jìn)而引發(fā)能量生成缺陷、ROS增多,造成惡性循環(huán)。受損和功能失調(diào)的線粒體被線粒體自噬選擇性清除,有助于減少ROS的產(chǎn)生并防止正常細(xì)胞的氧化損傷[3]。H2O2是細(xì)胞內(nèi)主要的內(nèi)源性ROS,幾乎可以由所有的氧化應(yīng)激源產(chǎn)生,并且能夠自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞,造成氧化-抗氧化系統(tǒng)的失衡[23]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)H2O2含量,間接評(píng)價(jià)ROS水平。研究結(jié)果表明,脾虛大鼠體內(nèi)H2O2水平,膜電位和ATP降低,表明線粒體功能受損。而生、麩蒼術(shù)多糖與正丁醇部位的治療顯著改善了線粒體功能,這可能是通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬和增加受損線粒體的清除實(shí)現(xiàn)的。

綜上,我們推測(cè),蒼術(shù)多糖與正丁醇部位可能是通過(guò)改善胃竇組織自噬障礙,恢復(fù)線粒體功能,從而調(diào)節(jié)脾虛,且麩炒后多糖與正丁醇部位效果明顯優(yōu)于生品。