陳薇伊,徐興軍,劉佳人,張偉偉,楊 燁,邵淑麗

齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室寒區(qū)麻及制品教育部工程中心,齊齊哈爾 161006

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病,其患病率在全球逐年增長,現(xiàn)已成為第四位需要優(yōu)先考慮的疾病[1-3]。血糖濃度過高會引起機(jī)體代謝紊亂,導(dǎo)致組織損傷和功能障礙[4]。這種疾病最常見的形式是1型和2型糖尿病[5],這兩種類型的特征是由于胰島素產(chǎn)生不足(1型)[6]或細(xì)胞對胰島素敏感性的喪失而導(dǎo)致的高血糖被稱為胰島素抵抗(2型),雖然這兩種糖尿病類型都有不同的病因,但它們都受到細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。1型糖尿病發(fā)病的核心機(jī)制是遺傳、環(huán)境、免疫因素交互作用導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞特異性損傷,造成胰島素絕對不足[7,8],目前治療該病的藥物主要是胰島素,但由于胰島素特殊的給藥方式影響了患者的依從性和其自身的治療效果,包括低血糖事件、體重增加以及酮癥酸中毒等副作用,因此尋求胰島素外的藥物幫助1型糖尿病患者控制血糖具有重要的臨床意義。

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge)既可食用又可作為藥用,山楂葉具有降血脂、降糖、降血壓等多種藥理活性,同時還具備抗氧化的作用。山楂葉中富含多種生物活性成分,Li等[9]研究表明,山楂葉中的多糖類化合物具有清除DPPH和OH自由基的能力。Hu等[10]研究表明,山楂葉黃酮可通過上調(diào)LDLR的表達(dá),促進(jìn)清除高脂血癥小鼠肝臟中游離的膽固醇,從而改善小鼠脂質(zhì)代謝紊亂。Zhang等[11]研究表明,脊髓損傷大鼠通過腹腔注射山楂葉總黃酮可抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)運動功能恢復(fù)。Li等[12]研究表明,山楂葉總黃酮可顯著提升非酒精性脂肪肝病肝細(xì)胞中超氧化物歧化酶(speroxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)水平,降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,提升機(jī)體抗氧化能力,從而延緩或阻止非酒精性脂肪肝病的進(jìn)展。

本試驗首先通過注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)構(gòu)建糖尿病小鼠模型,再將山楂葉黃酮(total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL)按照不同濃度灌胃建模成功的糖尿病小鼠,探究山楂葉黃酮對糖尿病小鼠的抗氧化作用,為山楂的開發(fā)利用以及糖尿病的預(yù)防和治療提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要藥物

研究對象購自吉林長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司,合格證號:SCXK(吉) -2020-00 01。為84只4周齡SPF級雄性ICR小鼠(22.00±2.00)g,并在齊齊哈爾大學(xué)生命學(xué)院動物生理學(xué)實驗室進(jìn)行了為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。山楂葉黃酮購自成都埃法生物科技有限公司,純度90%。本實驗經(jīng)過齊齊哈爾大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)實施,倫理審批號:QiqiharUEC20220507。

1.2 糖尿病模型的制備

實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,測定小鼠血糖及體質(zhì)量,按組間體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)隨機(jī)選12只為空白對照組(control group,Con),其余72只均為模型組。各模型組小鼠一次性按150 mg/kg腹腔注射濃度為1%的鏈脲佐菌素,構(gòu)建STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型,空白對照組注射等量的配置鏈脲佐菌素溶液所使用的溶劑—檸檬酸鈉。注射前禁食12 h,注射后可自由飲食、飲水,注射72 h后測定小鼠空腹血糖濃度。小鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L,并表現(xiàn)出明顯的多飲、多食、多尿癥狀,造模成功。

1.3 動物分組與給藥方法

選取造模成功的小鼠72只,隨機(jī)分為120 mg/(kg·d)的山楂葉黃酮高濃度組(high dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-H)、60 mg/(kg·d)的山楂葉黃酮中濃度組(medium dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-M)、30 mg/(kg·d)的山楂葉黃酮低濃度組(low dose of total flavonoids from hawthorn leaf,TFHL-L)、陽性對照組(positive control group,Pos)、模型組(model control group,Mod)和DMSO模型對照組(DMSO model control group,DMSO),每組數(shù)量為12只,空白組和模型組灌胃蒸餾水,陽性對照組灌胃300 mg/(kg·d)的鹽酸二甲雙胍。各組小鼠自然光照,飲食、飲水,于室溫下每天定時灌胃4周。

1.4 小鼠血糖及口服糖耐量的測定

利用血糖儀(GA-3型)測定小鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)濃度,采用剪尾取血法,將得到的血液滴到載玻片上并用血糖儀進(jìn)行測量,操作前后均進(jìn)行消毒。測定小鼠空腹血糖(0 min)后,小鼠按2 g/kg灌胃葡萄糖,進(jìn)行尾尖采血,以血糖儀檢測糖灌胃后15、30、60、120 min 的血糖值為口服糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)。

1.5 抗氧化酶活性測定

最后一次灌胃后,小鼠禁食24 h,并通過斷頸法處死小鼠。將血液離心以制備血清。肝臟在低溫條件下解剖,用預(yù)先冷卻的生理鹽水清洗,并在-80 ℃下保存在冰箱中供日后使用。用試劑盒法測定T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性和MDA含量。

1.6 抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)測定

根據(jù)小鼠SOD-1(NM_011434.2)、SOD-2(NM_013671.3)、GPX-1(NM_008160.6)、GPX-4(NM_008162.4)和GAPDH(NM_001289726.1)的基因序列設(shè)計引物,序列如表1所示。從小鼠肝臟樣本中提取總RNA,使用Prime ScriptTM RT試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄到cDNA中,使用逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,內(nèi)部參照GAPDH,并使用2-△△Ct該方法計算基因的相對表達(dá)。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂葉黃酮對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖及口服糖耐量的影響

由表2可知,試驗期間,空白對照組小鼠血糖呈動態(tài)平衡,DMSO對照組和水模型對照組小鼠血糖濃度持續(xù)上升,各黃酮試驗組和陽性對照組總體呈下降趨勢。試驗結(jié)束后,各黃酮試驗組組小鼠血糖顯著低于DMSO模型對照組(P<0.05),低酮組極顯著低于DMSO模型對照組和水模型對照組(P<0.01),并且與陽性對照組相比組間差異不顯著(P>0.05)。山楂葉黃酮可以降低糖尿病小鼠血糖濃度。

表2 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Table 2 Effect of different concentrations of TFHL on fasting blood glucose in diabetic

由表3可知,空白對照組、陽性對照組及中酮組均在15 min時有葡萄糖峰值,此時空白對照組血糖濃度為15.00±1.92 mmol/L,陽性對照組血糖濃度為20.13±1.88 mmol/L,中酮組血糖濃度為22.90±1.07 mmol/L。高酮組和低酮組在30分鐘時有葡萄糖峰值,此時高酮組血糖濃度為21.87±0.32 mmol/L,低酮組血糖濃度為19.50±0.57 mmol/L。DMSO模型對照組和水模型對照組在60分鐘時有葡萄糖峰值,此時DMSO模型對照組血糖濃度為27.40±0.46 mmol/L,水模型對照組血糖濃度為26.37±0.48 mmol/L。山楂葉黃酮可以改善糖尿病小鼠葡萄糖峰值時間。

表3 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響Table 3 Effect of different concentrations of TFHL on OGTT in diabetic

2.2 山楂葉黃酮對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胰島素變化的影響

由圖1可知,空白對照組小鼠胰島素含量最高,水模型和DSMO對照組小鼠胰島素含量最低,各試驗組及陽性對照組胰島素含量由大到小依次為陽性對照組、低酮組、高酮組、中酮組。其中DMSO對照組與水模型對照組比組間差異不顯著(P>0.05);水模型對照組與高酮組、中酮組、低酮組相比組間差異均極顯著(P<0.01)。山楂葉黃酮可增加糖尿病小鼠體內(nèi)胰島素含量。

圖1 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠胰島素變化的影響Fig.1 The effect of different concentrations of TFHL on insulin changes in diabetic

2.3 山楂葉黃酮對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

由表4可知,小鼠血清中,DMSO模型對照組和水模型對照組的T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性以及MDA含量差異不顯著(P>0.05);水模型對照組T-AOC、SOD及GSH-PX酶活性極顯著低于各黃酮實驗組(P<0.01);水模型對照組MDA含量極顯著高于各黃酮實驗組(P<0.01)。山楂葉黃酮可提高糖尿病小鼠血清中T-AOC、GSH-PX以及SOD酶活性,降低MDA含量。

表4 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠血清中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響Table 4 Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in serum of diabetic

2.4 山楂葉黃酮對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響

由表5可知,小鼠肝臟中,DMSO模型對照組和水模型對照組SOD酶活性顯著低于各黃酮實驗組(P<0.05),而MDA含量極顯著高于各黃酮實驗組(P<0.01);各黃酮實驗組T-AOC和GSH-PX酶活性極顯著高于DMSO模型對照組和水模型對照組(P<0.01)。山楂葉黃酮可提高糖尿病小鼠肝臟中T-AOC、GSH-PX以及SOD酶活性,降低MDA含量。

表5 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠肝臟中SOD、T-AOC、GSH-PX和MDA的影響Table 5 Effect of different concentrations of TFHL on SOD,T-AOC,GSH-PX and MDA in the liver of diabetic

2.5 山楂葉黃酮對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化基因相對表達(dá)量的影響結(jié)果

由圖2、3可知,小鼠肝臟中各黃酮實驗組SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表達(dá)量均極顯著高于DMSO模型對照組和水模型對照組(P<0.01),其中各黃酮實驗組GPX-4基因表達(dá)量與陽性對照組相比差異不顯著(P>0.05)。糖尿病小鼠經(jīng)山楂葉黃酮灌胃4周后,肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4四種抗氧化基因的表達(dá)量均有極顯著提升。

圖2 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠SOD-1基因(A)和SOD-2基因(B)表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of TFHL on SOD-1 gene (A) and SOD-2 (B) gene expression in diabetic

圖3 不同濃度山楂葉黃酮對糖尿病小鼠GPX-1基因(A)和GPX-4基因(B)表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of TFHL on GPX-1 gene (A) and GPX-4 gene (B)

3 討論及結(jié)論

血糖是身體細(xì)胞、組織、器官重要的能量來源[13]?？诜悄土吭囼?zāi)軌驅(qū)C(jī)體胰島β細(xì)胞功能、糖代謝狀況進(jìn)行評估[14]。Huang等[15]研究表明,魚腥草總黃酮能降低1型糖尿病小鼠的血糖。上述研究表明黃酮類化合物對糖尿病的治療有積極作用。本試驗結(jié)果顯示,山楂葉黃酮可降低糖尿病小鼠血糖濃度并改善葡萄糖峰值時間,與上述研究結(jié)果相一致。胰島素是體內(nèi)唯一降糖激素[16],通過其含量可判斷糖尿病病變程度。本試驗結(jié)果顯示,山楂葉黃酮可增加小鼠體內(nèi)胰島素含量,降低糖尿病小鼠血糖濃度,這與Zeng等[17]研究桑葉黃酮可顯著降低糖尿病小鼠血糖水平,改善其糖代謝的結(jié)果相一致。在本試驗結(jié)果中,低劑量山楂葉黃酮降低血糖的效果最好,這可能是由于低劑量山楂葉黃酮會首先作用于胰腺,促進(jìn)胰島素的分泌進(jìn)而使血糖降低,而高劑量山楂葉黃酮會首先作用于肝臟,修復(fù)肝臟的損傷,使相應(yīng)的基因表達(dá)增強(qiáng)。這與Zhang[18]、Lu[19]等的研究結(jié)果一致。

目前研究顯示,糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其重要的發(fā)病機(jī)制為活性氧自由基積累使機(jī)體抗氧化能力下降[20,21]。Liu等[22]研究表明,準(zhǔn)噶爾山楂葉中三種黃酮成分均有清除自由基的功能;根據(jù)本次實驗,由各組數(shù)據(jù)顯示,發(fā)現(xiàn)山楂葉黃酮能顯著提高血清和肝臟中抗氧化酶活性,并使MDA含量降低,可能有以下幾個方面的原因,一是由于半琨式自由基其性質(zhì)較穩(wěn)定,而在體內(nèi)的自由基能與山楂葉黃酮中的酚羥基發(fā)生反應(yīng),生成穩(wěn)定的半琨式自由基,從而終止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),鏈?zhǔn)椒磻?yīng)終止使機(jī)體抗氧化能力提高。二是MDA的含量可以因為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而增加,機(jī)體過量的自由基會導(dǎo)致此反應(yīng)產(chǎn)生。山楂葉黃酮可以抑制脂質(zhì)過氧化,血清和肝臟中MDA含量不會因此增加,機(jī)體抗氧化能力也就隨之增強(qiáng)。三是山楂葉黃酮中黃酮種類較多,當(dāng)B環(huán)存在鄰羥基時,2,3位雙鍵對B環(huán)失去電子后自旋產(chǎn)生穩(wěn)定的自由基,4位羰基能和鄰羥基生成氫鍵,使得自由基中間體更加平穩(wěn)。此外,在細(xì)胞中存在Fenton反應(yīng)(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+·OH-),牡荊素可與Fe2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),絡(luò)合位點在4-羰基-5-羥基之間,絡(luò)合Fe2+可有效減少·OH的生成,形成絡(luò)合物沉淀,減少自由基,提高機(jī)體抗氧化能力。山楂葉黃酮可提高1型糖尿病小鼠肝臟和血清中抗氧化酶的活性,降低MDA含量,使機(jī)體抗氧化能力得到增強(qiáng)?？寡趸虻谋磉_(dá)與抗氧化酶的抗氧化作用密切相關(guān)。

當(dāng)機(jī)體氧化程度超出氧化物清除能力,氧化和抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)定性被破壞,造成氧化損傷[23]。低水平氧化應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體的抗氧化蛋白在抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant-response element,ARE)或親電反應(yīng)元件(electrophilic response element,EpRE)的順式作用元件介導(dǎo)下被激活[24]。ARE可從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控抗氧化酶對機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下的反應(yīng)[25]。正常生理情況下,核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(epoxy chloropropane kelch sample related protein-1,Keap1)相結(jié)合于胞漿中,活性被抑制,在泛素蛋白酶作用下降解,以保持在生理狀態(tài)下Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性[26],當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時,原本相結(jié)合的Nrf2與Keap1解偶聯(lián),活化了的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核后與小Maf蛋白形成二聚體,進(jìn)而識別并結(jié)合ARE元件,啟動下游基因轉(zhuǎn)錄,機(jī)體抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性因此被提高,故而平衡機(jī)體氧化損傷[27]。

在本試驗中,糖尿病小鼠經(jīng)山楂葉黃酮灌胃4 w后,肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4四種抗氧化基因的表達(dá)量均有極顯著提升,其原因可能有兩方面,一方面可能由于糖尿病小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激較為嚴(yán)重,使得機(jī)體抗氧化系統(tǒng)無法平衡自由基進(jìn)攻,從而造成細(xì)胞的嚴(yán)重氧化損傷并且機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)無法消除自由基,山楂葉黃酮不但可消除體內(nèi)自由基,亦可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用,減少自由基和金屬離子對細(xì)胞的氧化損傷,促進(jìn)Nrf2的核內(nèi)轉(zhuǎn)位,增加Nrf2的表達(dá),進(jìn)而增加糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表達(dá)量。另一方面可能由于糖尿病小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性降低,導(dǎo)致體內(nèi)自由基增加,造成細(xì)胞氧化損傷,引起線粒體系統(tǒng)供能不足以及DNA、RNA轉(zhuǎn)錄受阻,使患病小鼠肝臟中抗氧化基因的表達(dá)量極顯著降低。由于山楂葉黃酮均有清除體內(nèi)自由基的作用,灌胃后,小鼠細(xì)胞中DNA、RNA轉(zhuǎn)錄得到改善,使糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1及GPX-4基因的表達(dá)量得到提高。Deng等[28]研究表明,槲皮素可激活乙醇孵育的人原代肝細(xì)胞中Nrf2的核轉(zhuǎn)位表達(dá)。Ganesan[29]、Zhang[30]等的研究表明,牡荊素通過激活β細(xì)胞調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵蛋白,包括NF-κB和Nrf2,從而改善胰島素分泌。均與本試驗結(jié)果相一致。

結(jié)果表明,山楂葉黃酮可使MDA含量極顯著降低,并極顯著提高STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清和肝臟中T-AOC、SOD以及GSH-PX酶活性。山楂葉黃酮可顯著上調(diào)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟中SOD-1、SOD-2、GPX-1、GPX-4基因的表達(dá)量。綜上所述,山楂葉黃酮可改善糖尿病氧化損傷,具有良好的抗氧化作用,在對于糖尿病的治療與相關(guān)藥物研發(fā)上具有良好的發(fā)展前景。